编码人精子膜蛋白YWK-Ⅱ基因的研究

于同德^[1]1995年在《编码人精子膜蛋白YWK-Ⅱ基因的研究》文中指出与生殖相关蛋白的研究已进展到基因水平。生精过程中的基因表达存在复杂的多级调控机制。我们曾经采用一株具有抑制生育作用的抗精子膜蛋白单克隆抗体YWK-Ⅱ对大鼠睾丸λgt11 cDNA表达型文库进行表位筛选，得到一1.8kb大小的cDNA，命名为RSD-2。同源性分析发现，RSD2的编码多肽与引起老年性痴呆症的A4蛋白前体(APP)跨膜区高度同源，表明这是一个含有单跨膜区的膜镶嵌蛋白。随后，以RSD-2为探针进一步从人睾丸λgt11 cDNA文库中筛到了HSD2-7，921，721，1062等多个阳性克隆。对它们的核苷酸序列的初步分析发现，它们之间存在同源和变异，而且5′端都不完整。本论文是在此工作的基础上进行了进一步的研究。首先，对721(1.9kb)，1062(1.9kb)两个cDNA片段进行了全部核苷酸序列手工测定，同源比较发现，721cDNA在编码区内存在189bp(63个氨基酸残基)的缺失。而1062cDNA则没有这段缺失，但在3′非翻译区内有230bp与我们前面报道的921不同源。进一步的分析发现在睾丸组织中至少有4种形式的mRNA对应于YWK-Ⅱ抗原，其同源区的同源率高达100％，提示这可能是同一基因转录的、不同方式剪切的产物。其次，为获得完整的5′端，我们以HSD2-7的5′端500bp为探针，从人睾丸λgt10 5′stretch cDNA文库中做了进一步的筛选，获得一个4kb大小的cDNA，命名为C211。序列分析比较发现，除了在胞外区接近膜处有一36bp(12氨基酸残基)缺失外，5′端1.8kb有极大变异。计算机分析显示，该1.8kb是一非编码区。连接219个氨基酸残基构成的胞外区及23个氨基酸残基的跨膜区和47个氨基酸的胞内区。由于这一段1.8kb变异比较特殊，我们用PCR和RT-PCR的方法，分别证明了该变异区确实存在于λgt10 cDNA文库和人睾丸组织mRNA中，而非片段污染所致。我们选用C211 cDNA的3′端同源区1.8kb为探针，对人睾丸组织RNA进行了Northern blot分析，结果检测到一4kb大小的杂交带。为进一步探讨该mRNA在睾丸组

黄蓬^[2]1998年在《人精子膜蛋白YWK-Ⅱ抗原的表达及其功能的初步研究》文中研究说明在本实验室以前的工作中，曾采用一株抗人精子膜蛋白的单克隆抗体YWK-Ⅱ对大鼠睾丸λgtllcDNA文库进行表位筛选，得到1.8kb长的cDNA片段，命名为RSD-2(GenBank Accession Number：M31322)。进一步以RSD-2为探针对人睾丸cDNA文库进行筛选，对所得数个阳性克隆进行拼接，结合5’RACE延伸的方法获得3135bp长的人YWK-Ⅱ抗原cDNA序列，命名为HSD-2，其开放阅读框(ORF)编码590个氨基酸(AA)。经同源性分析，发现YWK-Ⅱ抗原与老年性痴呆症A4蛋白前体(APP)存在广泛的同源性与区域保守性，具有与APP对应的典型一次跨膜结构特点，即由胞外区，疏水的穿膜区和胞内区所组成。YWK-Ⅱ抗原也与从人胎盘文库中发现的APP基因家族的另一个成员APPH／APLP2高度同源，提示YWK-Ⅱ抗原与APP同属一个蛋白超家族，二者的同源区域可能具有相似的功能。 本文首先应用荧光原位杂交技术(FISH)观察了YWK-Ⅱ抗原基因在人染色体中的定位，结果显示YWK-Ⅱ抗原基因定位于人染色体11q2.4-2.5，与APP的21号染色体定位结果不同。 利用间接免疫荧光法曾发现YWK-Ⅱ抗原定位于人精子头部赤道区，目前认为这一区域可能是精卵膜融合的起始部位。为了研究YWK-Ⅱ抗原可能具有的功能，本文针对其不同区段的序列特点，采用基因工程技术将YWK-Ⅱ抗原的三个功能区段在大肠杆菌以及真核细胞中进行表达，并对胞内区表达蛋白的功能进行了初步探索。 分析YWK-Ⅱ抗原胞外区序列特征后发现，其有一个紧接于跨膜区的127个AA残基区域与APP无显著同源性。以往的研究表明，根据该区域中一段16AA顺序设计的多肽抗原能引起雌性小鼠不育。另外，位于胞外区与跨膜区连接部位有3个连续的Ser也很有特点，预测可能与糖基化或磷酸化作用相关。为了了解YWK-Ⅱ抗原胞外区中上述与APP无同源性

张树民^[3]1999年在《应用酵母双杂交体系筛选人精子膜蛋白YWK-Ⅱ蛋白胞外区的作用配体》文中研究指明精子膜蛋白在精子发生和精卵相互作用过程中起着重要的作用。YWK-Ⅱ蛋白是本实验室筛选出的一种具有单一跨膜结构的精子膜蛋白，其cDNA开放阅读框架(ORF)为2289bp，编码763个氨基酸。已知它的胞外区具有明显的抗生育作用，而胞内区能与G_o蛋白特异结合。据此推测，YWK-Ⅱ蛋白有可能作为精子细胞表面G蛋白偶联受体参与调节人类的生育活动。因此，寻找YWK-Ⅱ蛋白胞外区的作用配体，不仅有利于我们揭示其抗生育作用的机制，而且还可能为精子发生和／或受精的研究提供新的线索。 我们选择了YWK-Ⅱ蛋白胞外近膜端226个AA(与APP同源性较低区段)作为“诱饵”蛋白，利用酵母双杂交系统从睾丸文库和卵巢文库中筛选能与YWK-Ⅱ蛋白胞外段相互作用的配体。结果发现睾丸组织中的human diaphanous protein 1(HDIA1)以及卵巢组织中的穆勒氏抑制物(Mullerian inhibiting substance，MIS)和human HLA-B associated transcripts 3(BAT3)可能是与YWK-Ⅱ蛋白胞外区结合的配体。此外，我们还发现，“诱饵”蛋白中段的63个AA是YWK-Ⅱ蛋白胞外区与上述配体相互作用的活性部位，它与三种配体之间的作用要远远强于整段“诱饵”蛋白(226AA)。而此63AA羧基端的35个AA却不能在体内与HDIA1结合。35AA与BAT3和MIS的相互作用强于整段”诱饵”蛋白(226AA)，但弱于63AA。 HDIA1是Rho分子(小G蛋白家族成员之一)的作用靶蛋白，已知其对精原和精子细胞的形态改变，粘附发生及胞质分裂等功能活动有影响。而MIS是睾丸Sertoli细胞和卵巢的卵丘颗粒细胞分泌的一种140Kd同源二聚体糖蛋白。除了在男(雄)性的性别发育中起着关键性的作用以外，MIS对精子的运动能力及存活率都有正性影响

吴燕婉, 宗书东, 于同德, 缪时英, 王琳芳^[4]1997年在《编码人精子膜蛋白YWK-Ⅱ基因在人睾丸组织表达的研究》文中进行了进一步梳理抗人精子膜蛋白的单克隆抗体YWK-Ⅱ,能引起人精子凝集和抑制体外穿卵,并发现在睾丸组织中至少有4种形式的mRNA对应于YWK-Ⅱ抗原,可能是同一基因转录而不同方式剪切的产物.从人睾丸λgt10 5’Stretch cDNA文库中筛选,得到1个4kb大小的cDNA,命名为 C211.在 C211的 5’变异区和 3’相对稳定区中选择了2段.DNA分别作为转录探针的模板,5’端为943 bP和3’端为1.5kb的片段,将以上二个片段与含SP6和T7启动子的PGEM3Z载体进行重组,采用体外转录,地高辛标记的方法,分别合成2,tRNA探针,对人睾丸组织进行原位杂交.人睾丸YWK-ⅡC211基因片段地高辛(Dig)标记的5’端和3’端Antisense cRNA探针均与支持细胞质中的mRNA杂交,证明YWK-Ⅱ抗原蛋白在Sertoli细胞中合成,并又镶嵌在生精细胞膜上,最终定位于精子头部赤道极.

尹雪茜^[5]2004年在《人精子膜蛋白YWK-Ⅱ蛋白/APLP2与穆勒氏管抑制性物质（MIS）的相互作用及其信号传导通路》文中指出YWK-Ⅱ蛋白是一种Ⅰ型精子膜蛋白，最初是由本组采用一株抗人精子蛋白的单克隆抗体(YWK-Ⅱ)对大鼠睾丸λgt11cDNA文库进行筛选获得的，定位于人精子头部的赤道区。序列分析发现YWK-Ⅱ蛋白与Alzheimcr's病(老年性痴呆)相关的A4蛋白前体(APP)存在广泛的同源性和区域保守性，胞内区和跨膜区有70.6％的同源性。其后自人胎盘中筛选的该蛋白被命名为淀粉样蛋白前体同源蛋白(APPH)，并发现与大鼠淀粉样蛋白前体样蛋白2(APLP2)非常相似，为同一蛋白在不同种属中的不同形式。人YWK-Ⅱ蛋白与APLP2基因序列一致，染色体定位于11q24-25，并在多组织中均有表达，其cDNA命名为HSD-2(GenBank Number AF168956)，长3654bp，编码763个氨基酸。研究发现YWK-Ⅱ蛋白／APLP2参与精卵相互作用。YWK-Ⅱ抗体能够导致人、大鼠和小鼠精子的凝集并抑制受精过程，可导致雌性小鼠受精卵数量的明显下降。以YWK-Ⅱ蛋白／APLP2的片段(594-610／763)免疫小鼠，可有效地降低雄性和雌性小鼠的生殖能力。基因敲除实验显示，YWK-Ⅱ蛋白／APLP2与APP分别单独敲除，小鼠仍具有生殖能力，而两者联合敲除则导致动物不育。这一实验表明，YWK-Ⅱ蛋白／APLP2在生殖系统中发挥重要的生理功能。 体外研究发现，重组表达的YWK-Ⅱ蛋白／APLP2胞内段能够被PKC和cdc2激酶磷酸化，并可以和GTP结合蛋白G_0蛋白相互作用，表明YWK-Ⅱ蛋白／APLP2可能是一种与G_0蛋白耦联的受体。采用酵母双杂交系统，发现YWK-Ⅱ蛋白／APLP2与穆勒氏管抑制性物质(MIS)存在相互作用。MIS是一种由Sertoli细胞和granular细胞表达分泌的糖蛋白，能够诱导穆勒氏管的退化，在性别决定中发挥重要作用。MIS在雄性胚胎血液中含量较高，出生后早期达到高峰，之后逐渐下降，成年后维持在较低水平；雌性在出生前血液中检测不出MIS，出生后始终维持在与成年雄性相似的浓度，绝经后消失。MIS的功能是多方面的，已发现其可在体外促进人精子的存活力和活动力。

刘孟元^[6]1993年在《两种与生育有关的人精子膜蛋白基因的研究》文中研究说明精子细胞膜(简称“精子膜”)蛋白在受精过程中占有十分重要的地位，尤其是对精子运动、精卵识别、融合及早期胚胎发育等起着重要的作用。因此精子膜蛋白的研究一直受到人们的极大关注。我们在国际上较早地开展了这一方面的工作。目前已分离纯化了数种家兔和人的精子膜蛋白，并制备了其单克隆抗体，利用抗体表位筛选法从大鼠和人睾丸表达型λgtll cDNA库中筛选获得了数种相应的精子膜蛋白的cDNA片段，并进行了核苷酸的序列分析。 本研究是在本实验室以前工作的基础上，对两种人精子膜蛋白基因做进一步的研究，是精子膜蛋白研究课题中部分工作的继续。论文分为两部分： 1．人精子膜YWK-Ⅱ抗原的cDNA克隆、序列分析及其同源性比较 本实验室过去曾用抗人精子单克隆抗体YWK-Ⅱ，从大鼠睾丸λgtll表达型cDNA库中筛选获得一个eDNA片段—RSD-2。为了进一步研究人精子中编码该蛋白基因的特征，本研究又以RSD-2为探针对人睾丸λgtll cDNA库进行筛选。所获得的7个阳性克隆其插入子的大小分别为：R171：1.2kb，R321：0.7kb，R514：0.5kb，R642：1.0kb，R721：1.8kb，R915：1.4kb和R921：1.6kb。 选择其中一个克隆(R921)进行研究，首先绘制其插入子的限制性内切酶酶切物理图谱，制备测序亚克隆进行DNA序列测定分析。核苷酸序列测定根据Sanger双脱氧终止法原理，同时使用了同位素掺入的人工测序和荧光素标记的全自动测序两种方法，对各个测序片段重复测定以保证测序结

田新勇^[7]2001年在《1. 人精子膜蛋白YWK-Ⅱ的功能研究 2. 应用酵母双杂交系统寻找tSH3p13、HSD-3编码蛋白的结合物》文中研究指明精子蛋白质的功能研究对于揭示精子发生及受精过程的分子机制有重要意义。本文对YWK-Ⅱ蛋白、tSH3p13蛋白、HSD3编码蛋白等三个精子蛋白质的功能作了不同深度的研究。 YWK-Ⅱ蛋白是本实验室筛选出的一种人精子膜蛋白，其cDNA开放阅读框架编码763个氨基酸，疏水性分析显示它具有一个单跨膜结构域。YWK-Ⅱ蛋白与Alzheimer's disease(老年性痴呆症)淀粉样A4蛋白前体(APP)在胞内区与跨膜区存在70％同源性，而在胞外近膜区与APP差异很大，并具有明显的抗生育作用。最近的研究表明YWK-Ⅱ蛋白胞内区能与Go蛋白特异结合，可能是一种精子膜上具有单跨膜结构的G蛋白偶联受体。为证明这一假定，必须发现YWK-Ⅱ蛋白胞外区结合的特异性配体。初步的研究表明，在酵母双杂交实验中，YWK-Ⅱ蛋白胞外近膜区226个氨基酸片段能与大鼠穆勒氏管抑制物(rMIS)中的一个74个氨基酸的片段作用，而其中一段63个氨基酸的区域是与MIS作用的活性部位。 为了验证YWK-Ⅱ蛋白与MIS的相互作用，并研究这种作用的生理意义，我们将在酵母双杂交实验中相互作用的YWK-Ⅱ蛋白和rMIS的片段在大肠杆菌中分别表达。作为诱饵蛋白的YWK-Ⅱ蛋白胞外近膜区226个氨基酸片段，以及其中与MIS结合的63个氨基酸的活性区，分别表达为融合蛋白His_6-tagged HSD226和GST-HSD63。将在酵母双杂交实验中与YWK-Ⅱ蛋白胞外区作用的大鼠MIS第303到376位氨基酸片段，分别表达为融合蛋白His_6-tagged rMIS(303-376)和GST-rMIS(303-376)。并根据所表达融合蛋白的6个组氨酸(His_6)或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标记进行亲和纯化。 利用这些重组蛋白，进行了一系列实验验证YWK-Ⅱ蛋白与MIS的相互作用。体外结合实验证明His_6-tagged HSD226能够与结合到glutathione Sepharose 4B柱中的GST-rMIS(303-376)作用，这与酵母双杂交实验的结果相符。而pull—down实验中，发现GST-HSD63能够与大鼠睾丸提取液中的MIS特异结合，说明在生理条件下YWK-Ⅱ蛋白有可能与MIS相互作用。我们还应用IAsys系统的生物传感器定量研究这种作用，结果表明His_6-tagged HSD226和GST-rMIS(303-376)相互作用的结合速率常数k_(ass)为1854.54s~(-1)M~(-1)，解离速率常数k_(diss)为0.0121873s~(-1)，解离平衡常数K_D为6.57μM。 MIS除了能够在雄性胎儿性别发育过程中导致穆勒氏管退化外，还有一些其它功能，比如有文献报道MIS能提高新鲜或冻存精子的活动力与生存力，而且发现精

韩书麟^[8]1996年在《与A4蛋白前体相关的精子膜蛋白YWK-Ⅱ抗原cDNA的克隆表达及其功能研究》文中提出细胞生活在信息的海洋中，每时每刻都在进行着多种多样的生物化学反应。生物体能迅速对体内环境和外界刺激作出正确的及时的应答反应，有着复杂的调控机制。其中大多数是直接或间接由蛋白质的变构作用所介导的。整个信息过程包括受体，信息放大，效应器三部分。受体能够区分不同的外界刺激，进而激活信息放大系统，细胞内信息分子再作用于目标分子产生酶活力的变化，或改变膜对专一物质的通透性或调节基因表达产生较持久的生理或病理效应。 精子是一种分化程度很高的特殊细胞。在受精的整个过程中，精卵的识别，结合从而启动精子的顶体反应，最终导致精卵融合是一系列信号系统错综复杂的网络信号传递过程。其间既反映出体细胞的信号转导普遍规律，也有其性细胞中信息过程中的特殊本质。 我们课题组从八十年代初期，开始对数种具有强免疫原性的精子膜蛋白的分离纯化及其基本性质、在精子细胞内的定位，它们的免疫性与精子的发生和生育的关系、基因的克隆表达以及结构和功能等方面进行了一系列深入的研究。为生殖生物学的基础研究和生殖调控的应用研究打下了良好的基础。本文在此基础上，对其中一种精子膜蛋白YWK-Ⅱ抗原部分片段进行了克隆基因的表达纯化，并对其功能进行了进一步的研究，现将主要研究结果简要分述于下： 1，YWK-Ⅱ抗原的表达，分离及纯化 根据YWK-Ⅱ抗原的分子结构，分析其氨基酸组成特点，选择其胞内域进行了原核系统的高效表达。经过亲和层析法和SDS-PAGE等技术对表达产物进行了分离纯化，为研究YWK-Ⅱ抗原在精子内的功能提供了物质基础。 2，抗YWK-Ⅱ抗原胞内域抗血清的制备 用纯化的YWK-Ⅱ抗原胞内域表达产物免疫纯种新西兰大白兔，制备了它的多克隆抗体。ELISA方法测得抗血清的滴度为1×10~4；双向免疫扩散方法测得抗血清的效价为1：8-16；Western blot结果表明

缪时英, 李月华, 周荔申, 陈雅娣, 白云^[9]1990年在《一种人精子膜蛋白基因的克隆与鉴定》文中研究指明应用本实验室制备的抗人精子膜蛋白的单克隆抗体(YWK-Ⅱ),自大鼠睾丸λgtll表达型cDNA库中表位筛选了一个阳性克隆,其插入cDNA长度为1.8kb,命名为RSD-2。RSD-2片段的部分酶谱分析确定该片段具有PstⅠ及BglⅡ的单一酶切位点和PvuⅡ等酶的多个位点。此外,采用RNA-DNA杂交技术还研究了RSD-2片段的种属特异性,表明人及大鼠睾丸间有较高的同源性。

杨晓鸣, 赵峰, 严缘昌, 李光地, 汪垣^[10]1998年在《含编码人精子膜多肽cDNA和乙肝表面抗原基因的重组痘苗病毒》文中提出合成编码一种人精子膜蛋白YWK-Ⅱ胞外区的一段多肽片段的双链寡核苷酸链,HSD-2a.将HSD-2a和3’端乙肝表面抗原主S基因连接并与pUC18质粒重组.经鉴定的重组质粒用BamH Ⅰ和EcoRl酶切后,可分离纯化得到HSD-2a和HBsAg的主S基因连接片段,将该连接片段插入痘苗病毒通用表达载体pGJP-5的痘苗病毒启动子P_(7.5)下游,构建成重组质粒pGJP-HSD/HBs.将该重组质粒传染已感染了天坛痘苗病毒的猴肾细胞CV-1,pGJP-5中含有的TK基因与出发株病毒基因组的TK基因发生体内同源重组,构成重组痘苗病毒vv-HSD/HBs.HuTK~-细胞经vv-HSD/HBs感染后,在5-溴脱氧尿苷存在下进行空斑分析,筛选出TK~-重组病毒.应用ELISA方法对已感染了重组病毒的HuTK~-细胞培养上清和细胞裂解液测定,表明有HSD-2a编码的多肽片段的表达.Western-blot法分析呈现28和30Kd两条显色带.重组痘苗病毒vv-HSD/HBs有可能作为抗生育疫苗用途.

参考文献：

[1]. 编码人精子膜蛋白YWK-Ⅱ基因的研究[D]. 于同德. 中国协和医科大学. 1995

[2]. 人精子膜蛋白YWK-Ⅱ抗原的表达及其功能的初步研究[D]. 黄蓬. 中国协和医科大学. 1998

[3]. 应用酵母双杂交体系筛选人精子膜蛋白YWK-Ⅱ蛋白胞外区的作用配体[D]. 张树民. 中国协和医科大学. 1999

[4]. 编码人精子膜蛋白YWK-Ⅱ基因在人睾丸组织表达的研究[J]. 吴燕婉, 宗书东, 于同德, 缪时英, 王琳芳. 中国科学C辑:生命科学. 1997

[5]. 人精子膜蛋白YWK-Ⅱ蛋白/APLP2与穆勒氏管抑制性物质（MIS）的相互作用及其信号传导通路[D]. 尹雪茜. 中国协和医科大学. 2004

[6]. 两种与生育有关的人精子膜蛋白基因的研究[D]. 刘孟元. 中国协和医科大学. 1993

[7]. 1. 人精子膜蛋白YWK-Ⅱ的功能研究 2. 应用酵母双杂交系统寻找tSH3p13、HSD-3编码蛋白的结合物[D]. 田新勇. 中国协和医科大学. 2001

[8]. 与A4蛋白前体相关的精子膜蛋白YWK-Ⅱ抗原cDNA的克隆表达及其功能研究[D]. 韩书麟. 中国协和医科大学. 1996

[9]. 一种人精子膜蛋白基因的克隆与鉴定[J]. 缪时英, 李月华, 周荔申, 陈雅娣, 白云. 基础医学与临床. 1990

[10]. 含编码人精子膜多肽cDNA和乙肝表面抗原基因的重组痘苗病毒[J]. 杨晓鸣, 赵峰, 严缘昌, 李光地, 汪垣. 生殖与避孕. 1998

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