【摘要】酶联免疫吸附试验（ELISA）是医学免疫检验的核心技术。自制ELISA试剂盒，降低成本，在免疫学检验实验教学中，让每个学生得到充分的训练，从而熟练掌握使用ELISA试剂盒的技术要点，做到加样精准，读数准确，为将来更好地适应临床工作打下坚实的基础。
【关键词】自行研制；ELISA试剂盒；免疫学检验
【中图分类号】R197.323 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）11-0394-01
免疫学检验是医学检验技术专业的专业主干课，实践操作是课程的核心内容。酶联免疫吸附试验（ELISA）是免疫学检验的核心技术。加样精准，读数准确，是医学检验技术学生基本功，也是顺利走向工作岗位的通行证。因此，加强这些方面训练和考核是做好校企衔接的重要环节。
1.现状
由于市售试剂盒价格高昂，在免疫学检验实验教学所开设的实验项目中，很难保证试剂盒的数量，让学生得到充分的训练。虽然每个学生都能保证参与加样，但实验操作空间拥挤，等待时间过长等实验脱节现象十分严重。学生对试剂盒使用原理，操作要点更是一知半解，动手操作机会少之又少。基于上述原因学生对该项技能掌握不扎实，较难适应临床实践工作。
通过自制ELISA试剂盒，降低成本（成本为市售价格的1/20-30），让每个学生实验操作时得到充分的训练，从而熟练掌握使用ELISA试剂盒的技术要点，做到加样精准，读数准确，为将来更好地适应临床工作打下坚实的基础。
2.ELISA试剂盒的研制
2.1 抗体的制备
2ml抗原对实验动物进行隔日免疫5次。末次注射7天后，由耳静脉采血分离血清，初测血清效价，滴定效价在1:500以上即可。心脏无菌采血并分离血清，置冰箱备用。
2.2 抗体的纯化
a.硫酸铵盐析法粗提抗体。
免疫血清、盐水、硫酸铵按比例混合，静置，离心，透析。
b.离子交换层析精提抗体
将粗提后抗体离心，并与QAE凝胶混合，静置，离心，取上清液。
c.纯度判断
用对流免疫电泳对提纯抗体进行纯度判断。取上清液，加入琼脂玻片相应孔中，对侧加抗原。电泳后，孔间出现一条沉淀线，判断为抗体纯度较高。
2.3 抗体效价测定，选择最适工作浓度
a.抗体效价测定。
用双向琼脂扩散试验，测定纯化抗体效价。将抗体进行倍比稀释，分别加入琼脂玻片的小孔中，中心孔加入抗原。37℃温育过夜，出现沉淀线的最高稀释度为该抗体效价。
b.最适工作浓度的选择
用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。将包被抗体和酶标抗体用包被缓冲液分别作1：160、1:320、1:640、1:1280、1:2560梯度稀释，在此实验中，所用包被液、封闭液、底物及反应时间均一致。阳性孔加入100цl抗原，阴性孔加入100цlPBS缓冲液，空白孔以1%BSA封闭，不加抗原、抗体，只加酶和底物。以强阳性抗原的A值在0.8左右、阴性参考的A值小于0.1的条件为最适条件。
2.4 包被微量反应板
最适工作浓度的抗原包被微量反应板，4℃过夜，封闭液封闭，37℃温育1h，备用。
2.5 试剂盒灵敏度检测
应用间接法对试剂盒灵敏度进行检测。在已包被抗原的微量反应板分别加入25цl稀释抗体、阳性对照、阴性对照，37℃温育60min，洗板5次，拍干。每孔再加入最适工作浓度酶标抗体25цl，37℃温育60min，洗板5次，拍干。加底物、终止液。酶标仪测定OD值，确定试剂盒灵敏度并建立标准曲线。
3.实践应用
在临床免疫学检验中，试剂盒的使用频率很高。增加学生学习与训练机会，并“以考促学”，自制ELISA试剂盒在其中扮演重要角色。现以2015级医学检验技术专业z1511作为实验班为例，介绍自制试剂盒在免疫学检验实验教学中的应用。
3.1 操作训练
每个学生一个包被抗原的微量反应板，已知效价抗体，工作浓度酶标抗体，底物，终止液。将抗体进行倍比稀释（见表1），分别加入已包被抗原的微量反应板中，设阴性对照及空白孔。分别加入酶标抗体、底物。让学生从分掌握ELISA间接法实验原理及操作要点，并明确显色深浅与抗体浓度的关系。最后加入终止液，上机（酶标仪）读数。让学生学会使用酶标仪，并理解读数的意义。
表1 抗体倍比稀释（单位：ml）
3.2 操作考核
给测试者提供包被抗原微量反应板、工作浓度酶标抗体、底物、终止液外，已知效价抗体、待测抗体。要求测试者利用已知效价抗体，判断待测抗体效价。具体考核要点：
①将已知效价抗体进行倍比稀释（见表1）。
②加样。将稀释抗体、待测抗体分别加入已包被抗原的微量反应板中，设置重复孔、空白孔、对照孔。
③显色、读数。
④数据分析。根据测试结果，以抗体效价为横坐标，测得OD值为纵坐标绘制标准曲线，并判断待测抗体效价。
4.结论
对于培养应用技术型人才的高职院校，通过自制酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒的应用可以有效避免因市售试剂盒价格高昂，学生缺少动手机会的弊端；通过自制试剂盒的独立使用，为今后的临床工作做好铺垫，同时也为学校与岗位的无缝对接奠定坚实的基础。
【参考文献】
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论文作者:洪宇
论文发表刊物:《医药前沿》2017年4月第11期
论文发表时间:2017/5/3
标签：抗体论文; 试剂盒论文; 包被论文; 抗原论文; 免疫学论文; 读数论文; 浓度论文; 《医药前沿》2017年4月第11期论文;