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【摘要】:高危型HPV感染是目前公认的宫颈癌的危险因素，在80多个类型中，高危型16和18型所导致的宫颈癌高达70%。研究发现，HPV E5、E6、E7癌基因与宫颈癌的发生密切相关，导致了不同程度的宫颈病变，形成了全世界99.7%的鳞状上皮细胞宫颈癌，89%腺癌。本文主要针对HPV16、18癌基因E5、6、7诱导宫颈癌发生的分子生物学机制,标记物的应用以及宫颈癌的防治，综述近年来的研究进展。
【关键词】：宫颈癌 E5、E6、E7 发病机制 标记物 预防
宫颈癌是全球妇女中仅次于乳腺癌的第2个常见的恶性肿瘤, 90%以上宫颈癌伴有高危型HPV感染[1]。HPV主要感染生殖器官,包括宫颈，阴道，阴茎，肛门，其中84.1%的浸润性宫颈癌主要是由高危型HPV16和18型导致的[2]。有证据表明高危型HPV16和18型产生的癌基因蛋白E5、E6及E7在诱导宫颈癌发生过程中起主要作用。随着特殊标记P16INK4A的应用，有许多重要标记用来鉴别HPV感染在细胞进程的不同阶段。标记物不仅可以检测疾病，而且帮助选择治疗方案。因此，我们的目的就是综述HPV16、18型导致的宫颈癌发病机制致，标记物的应用，以及不同的预防措施。
1．HPV分子结构
HPV是一种小的无包膜20面体病毒,含有双链DNA（含有约7000-8000bp），主要分为3个区域，基因座控制区（LCR）、早期区域(E)、晚期区域（L）。早期区域(E)编码的蛋白主要是为了病毒基因的表达，复制，生存，晚期区域（L）主要编码病毒结构蛋白[3]。早期基因（E1-E4）在复制起始点形成发挥重要作用，把病毒基因转入宿主细胞。除外其它的早期基因，E5是最早编码的癌基因蛋白，与各种跨膜蛋白相互作用。在高危型HPV ，第二种癌基因蛋白E6和第三种癌基因蛋白E7联合起来，辅助病毒DNA复制，抑制凋亡。E7单独定向细胞周期调控通路控制S期。
2.HPV分子机制
HPV颗粒通过基底膜微小的损伤进入宿主细胞，并立即在宫颈阴道部鳞状上皮内进行复制。L1衣壳蛋白在HPV表面与α6β4整联蛋白相互作用，导致了基底层的上皮细胞基因表达向上调节，这些促进了病毒与宿主细胞的结合，建立了低等的附加体复制。晚期蛋白L的表达完成病毒组装，病毒从最外层的上皮细胞脱落。一但HPV在上皮细胞内开始复制，它会形成CIN，，并且会导致上皮细胞轻度异生，中度异生，重度异生，最后导致癌变[4]。
2.1 E5的作用
早期研究发现高危型HPV E5仅对E6、E7的致癌性有协同作用，E5可能主要在感染的的早期阶段促进肿瘤增生。通常, 环氧化酶COX-2的表达,与宫颈癌增加的淋巴结转移和放射治疗耐药性有关。E5癌基因蛋白诱导COX-2表达,细胞信号转导和基因转录发生改变,导致血管发生和细胞凋亡异常[5]。E5激活表皮生长因子受体EGFR, 有学者发现E5通过激活EGFR刺激血管内皮生长因子VEGF表达。VEGF在宫颈癌早期血管生成中起关键作用。E5通过影响组织相容性抗原的表达，逃避宿主细胞免疫应答，不被清除，促进损伤细胞通过细胞周期，建立有效的感染。E5抑制了抑癌基因，失活肿瘤抑制蛋白，促进病毒癌基因转化。
2.2 E6的作用
抑癌基因p53能够有效地抑制细胞增殖和促进细胞凋亡。 Notch1基因被认为是抑癌基因P53的新靶点，P53反式激活Notch1，作为一个肿瘤抑制基因诱导分化进程[6]。然而，在E6存在的情况，内源性的Notch1表达显著性减少或者缺失。E6蛋白的另外一个重要作用就是通过E6-AP(E6 associated protein)的介导,连接P53密码子72的多肽性,促进P53基因的降解，从而导致细胞内多条信号转导途径发生异常，细胞增殖加快[7]。此外,E6也干扰其它促进细胞凋亡蛋白,像BaK,FADD, 半胱氨酸天门冬酶前体8,从而抑制细胞凋亡。通常,端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)在正常细胞表达,抑制端粒末端转移酶活性。相反,E6通过激活hTERT的转录活性,从而激活端粒末端转移酶，导致上皮细胞的永生化保持端粒长度，最终导致肿瘤的发生。
2.3 E6和E7联合作用
在HPV DNA整合进宿主细胞基因组后，E6和E7两个病毒基因的过表达，是导致宫颈癌的最主要原因。E6抑制了抑癌基因P53的活性,而E7抑制了PRb的活性，Rb家族是细胞周期的主要调节因子,PRb能通过阻断转录因子的活性调控细胞分化[8，9]。由于E6和E7合成增加,断裂的E2诱导基因通过绑定并阻止它们,调节E6和E7转录,作用于细胞。当E6和E7不绑定到E2,E6 自由结合P53,而E7结合到PRb,从而破坏抑制肿瘤的机制。由于P53的缺失,DNA持续堆积没有修复,没有PRb,细胞经历分化。结果,经过几年后产生的细胞有着恶性表型。此外 ,在多重上皮细胞,基因组不稳定也是由E6和E7导致的,产生了各种染色体异常。这些结构的改变在染色体1,3,5可以被很容易检测到,伴随3p和10p缺失。细胞周期进程不仅靠细胞外的生长因子,同样需要E7表达的细胞蛋白,为细胞进入S期所需。
3.生物标记的研究进展
最新的研究进展认识到检测宫颈癌新的生物学标记需要广泛的生化实体,像核酸,蛋白质类,糖类,脂类,小的代谢产物,在患者体液中发现的肿瘤细胞以及细胞遗传学和细胞动力学参数等。新的生物学标记在HPV导致的宫颈癌检测中发挥了独一无二的作用。
3.1 Ki-6 and p16INK4a
HPV感染的组织中, Ki-6使上皮细胞增殖。这个蛋白在细胞周期的G1,S,G2,M期表达,在G0期不表达,提供了一个细胞生长分数,仍在探索阶段[10]。p16INK4a在HPV-E7癌基因蛋白存在的情况下,通过打断PRb和转录因子E2F的相互作用,增加不规则细胞周期失活。p16INK4a的表达在正常细胞是被紧密控制的,通过抑制CDK4和6以及Rb蛋白的磷酸化使转录因子E2F调控的细胞周期进入S期。
3.2 ProEx C
对抗核蛋白质类MCM2和拓扑异构酶II(TOP2A)以蛋白为基础的抗体,在HPV导致的变异细胞内堆积。由于E7癌基因蛋白导致的S期基因转录的增加(异常的S期诱导)，宫颈腺和鳞状上皮异常增生时,它的表达显著增高[11]。然而,它在正常的宫颈上皮细胞中的表达是受到限制的。ProEx C可以帮助检测核蛋白质类MCM2和拓扑异构酶II(TOP2A)的细胞水平, 由于HPV E6,E7癌基因蛋白与P53和Rb的相互作用,导致S期蛋白异常转录，也可以检测增殖能力。
3.3 Cytoactiv HPV-L1
通常,L1与L2衣壳蛋白形成一个病毒遗传物质保护套,它在基细胞层的上皮细胞糜烂或者粘膜溃疡形成时，作为一个配体与宿主细胞表面的受体结合。L1通常在HPV感染的初始阶段表达，但是在宫颈癌的发生过程中它进行性的消失。因此，HPVL1表达的消失可能预示着病毒DNA整合进人类基因组。随后的细胞活性抗体检测到L1衣壳蛋白，它在弱到中度的细胞发育不良中被发现，然而在高度的上皮细胞瘤变中缺失，频繁检测到L1阴性的上皮损伤[12]。
3.4 Laminin-5 and MIB-1
之前的研究证实Laminin-5的表达可以作为几种浸润性癌的一个标记。它的表达与进行性肿瘤的密切关系在各种类型的恶性肿瘤中被发现[13]。Laminin-5在宫颈鳞状细胞癌早期阶段表达。Laminin-5与上皮细胞在基底膜绑定，通过形成半桥粒使上皮细胞在创伤修复时移行。在宫颈涂片中发现高预示价值的MIB抗体， MIB-1在恶变前和恶变的宫颈组织中表达,在正常的宫颈上皮和各种阶段的CIN都被观察到。MIB-1在G1，S,G2，M期帮助检测Ki-67抗原，但是在G0期缺失。可以在损害的宫颈组织中帮助检测增生活性。
4.预防
HPV疫苗被认为是最有效的预防宫颈癌的方法，最近出现得到认可的疫苗是四价体疫苗和二价体疫苗，通过重组DNA技术，按配方制造的没有传染性的病毒样颗粒，专门针对HPV16和HPV18，大量减少宫颈癌发生率。
4.1预防性疫苗
L1编码的蛋白在不同的乳头瘤病毒种类中均高度保守,可以它用来识别HPV衣壳蛋白质类。因此，疫苗类型用病毒L1衣壳蛋白制作，自我装配形成病毒样颗粒，可以引起高水平的中和抗体。在I期和II期的临床试验中发现,在HPV16感染的宫颈分泌物中,肌肉内注射的病毒样颗粒能够引起高水平的抗体滴度[14]。最近的研究还发现了除HPV16和18型以外其它HPV类型的疫苗。
4.2治疗性疫苗
治疗性疫苗主要针对已经确诊感染HPV的下生殖道。不同于预防，这些抗原决定簇来自早期HPV蛋白（E2，E6，E7）而不是晚期蛋白。因为这些病毒蛋白，像E6、E7有着完整的抗原表位，而不是突变的细胞蛋白。因此,它将是一个很好的靶点发展成一个针对HPV16抗原的特异性疫苗[15]。
4.2.1病毒和细菌载体疫苗
在临床试验II期，活的重组病毒疫苗编码HPV16和18型的E6和E7，E6和E7通过疫苗病毒载体与MHCI类分子结合，在早期宫颈癌患者中产生了强烈的CTL反应[16]。通过使用减毒的细菌作为一个载体，传递质粒编码的感兴趣基因或蛋白给抗原提呈细胞。在吞噬作用后 ，从单核细胞产生的李斯特氏菌溶血素O移动进入细胞质，使抗原提呈给MHCI/MHCII途径都变得容易。减毒沙门氏菌芽孢杆菌-卡介苗（结核分枝杆菌）被认为是安全的细菌载体疫苗。
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4.2.2蛋白、DNA、树突疫苗
以HPV16编码的E7肽为基础的疫苗通过佐剂、融合附加物、或者锚修饰的肽表位可以被加强。成长的DNA疫苗允许持续的抗原表达在MHC-肽复合体,这种绕过以肽为基础的疫苗，在抗原提呈细胞通过直接转导DNA编码抗原，综合肽类出现在患者自身的HLA分子[17]。DCs的结合是DNA疫苗最原始的调节，加强了裸露的DNA弱的本质。它也引起免疫应答，通过修改细胞内或者细胞间的抗原运动来提高DNA疫苗的能力。由于树突状细胞DCs具有有限的寿命，同时使用E7包含DNA和抗凋亡蛋白（bcl XL,Bcl-2），增强DCs的存活和E7特异性免疫反应[18]。另外一个提高DNA疫苗抗原性的方法就是胶囊化的应用、重组体、全长、E7脉冲、自体同源的DCs，可以在HPV16和18型阳性的宫颈癌患者中引起CD8+ CTL细胞表达。最终，与预防性疫苗相比，在刺激免疫和免疫力减弱的癌症患者中治疗性疫苗面临很大挑战。
5.结论
有很多报道讨论HPV导致宫颈癌的病因和治疗方法，人们已初步揭示了HPV致癌的分子机制， E6、E7基因可作为重要的靶基因，对其治病机制的研究将为诊断和治疗、疫苗的设计等提供重要的理论依据。我们相信，会有更多的防治宫颈癌的策略问世，将最大限度的减少HPV对人体的危害，达到预防和治疗宫颈癌的目的。
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论文作者:冷少华 赵小兰
论文发表刊物:《临床医学教育》2017年7月
论文发表时间:2017/8/24
标签：细胞论文; 宫颈癌论文; 蛋白论文; 基因论文; 疫苗论文; 病毒论文; 抗原论文; 《临床医学教育》2017年7月论文;