王宏伟[1]2001年在《日本对虾肝胰腺及血细胞的培养》文中研究说明本文研究了日本对虾肝胰腺和血细胞的培养，并采用培养细胞的RNA/DNA值进行细胞生长状况的评定。首先，在日本对虾的肝胰腺和血细胞原代培养的基础上，利用RNA/DNA值进行不同pH值培养基的比较，认为对于肝胰腺细胞pH7.6为最适值，对于血细胞pH7.2为最适值，同时利用光镜及电镜做了一些形态和结构上的观察，在电镜下观察到的日本对虾血细胞为无颗粒状细胞。其次，摸索了肝胰腺细胞的培养条件，实验采用199培养基，并在其基础上添加胎牛血清、NaCl、CaCl_2、MgCl_2、NaHCO_3、葡萄糖和其它无机离子，渗透压用NaCl等调节，分别在叁种pH值、叁种渗透压和叁种Zn~(2+)浓度下，原代培养日本对虾肝胰腺细胞，并以RNA与DNA的比值为指标评定其生长状况。结果为日本对虾肝胰腺细胞在pH7.6、渗透压为730mmol/Kg和Zn~(2+)浓度为80μg/L时，生长最好。然后，探讨了金属离子对培养日本对虾肝胰腺细胞的影响，在培养基中加入Ca~(2+)、Mg~(2+)、Ca~(2+)+Mg~(2+)和Zn~(2+)，以测定细胞的RNA/DNA值作为评价指标，结果表明，加入适量金属离子可促进细胞生长，各组细胞的RNA/DNA值均高于对照组，培养基中混合加入Ca~(2+)和Mg~(2+)有助于细胞贴壁生长。最后，实验在199培养基中加入促进细胞生长的亚油酸，对日本对虾肝胰腺细胞进行传代培养，测定传代细胞的总磷和无机磷含量，当亚油酸的加入量为16×10~(-5)M时，细胞的总磷和有机磷含量均为最高。总之，日本对虾细胞培养需要适宜的pH和渗透压，培养基中加入适量的金属离子Ca~(2+)、Mg~(2+)和Zn~(2+)，可促进细胞生长，混合加入Ca~(2+)和Mg~(2+)有助于细胞贴壁生长，加入适量亚油酸有利于细胞生长。本实验选取日本对虾最易患病的肝胰腺和与免疫机能有关的血细胞进行培养，摸索了一些较适宜的培养条件，为建立细胞株（系）以供病毒的分离、纯化，并进行各种特性的分析，进一步研究单克隆抗体奠定基础。同时，为培养对虾的免疫细胞并研究对虾免疫机能和筛选免疫增强药物提供手段，从而为解决虾病防治问题开辟一条有效途径。
王宏伟, 孟翠丽, 刘晋, 齐小强, 张毅[2]2005年在《不同pH值条件下日本对虾肝胰腺及血的细胞培养》文中认为动物细胞培养是生物技术的一个重要领域 ,因为培养的细胞可以用来分离纯化病毒、生产疫苗和药物。本实验在日本对虾肝胰腺细胞和血细胞原代培养的基础上 ,利用RNA DNA值进行不同pH值培养基的比较 ,认为对于血细胞pH 7 2为最适值 ,而对于肝胰腺细胞pH 7 6比较合适。同时利用光镜及电镜做了一些形态和结构上的观察。
王慧芬[3]2008年在《日本对虾免疫相关基因的克隆及功能的初步研究》文中指出对虾白斑综合症病毒(WSSV)是危害养殖对虾的主要病原,也是制约对虾养殖业发展的最重要因素。要寻找抵御该病原的有效方法,最基本的入手点之一就是充分了解作为病原宿主的对虾的免疫机制,通过提高其自身的抗病毒能力,来达到从根本上防治WSSV的目的。因此本论文以具有重要经济价值的日本对虾(Marsupenaeus japonicus)为对象,首先构建了用于探寻蛋白质相互作用及调控机制网络的酵母双杂交文库,这一平台为后续研究蛋白质在日本对虾抗病毒免疫中的作用奠定了基础。而后,本论文又对几个与日本对虾天然免疫密切相关的基因展开初步的研究,为建立有效的对虾病害防治方法提供科学依据和思路。本论文以日本对虾血细胞和肝胰腺组织混合mRNA为模版,利用SMART技术和酵母体内同源重组的方法构建酵母双杂交文库,并以日本对虾翻译调控肿瘤蛋白TCTP为诱饵蛋白对文库进行初步筛选。文库dsDNA条带最大可达5kb。文库转化效率为4.8×105转化子/ug pGADT7-Rec,文库容量为1.4×106克隆子/ml,重组率大于90%。初筛结果验证了我们所构建的日本对虾酵母双杂交文库有效、可靠。本论文通过巢式PCR及RACE等方法获得了日本对虾的两种丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因——ERK1/2和p38。根据人们在其它物种中的研究报道,这是两种在各项细胞活动包括抗病毒免疫中具有极为重要地位的基因。通过对两种基因的序列分析发现,日本对虾的ERK1/2和p38具备与其他物种中的这两种基因同样的基本特征和功能结构域。而且通过Western blot检测后发现,日本对虾的ERK1/2蛋白在WSSV病毒感染后磷酸化水平即活性上调,且该现象发生在病毒感染早期,说明在日本对虾中,ERK1/2信号转导通路可以被WSSV所激活,且可能是被病毒进入宿主细胞这一过程所诱导。然而,在本研究中,我们还发现日本对虾的ERK1/2和p38蛋白与其他物种之间的不同之处。首先,日本对虾的ERK1/2蛋白在Western blot检测时只显示出一种分子量大小的条带,说明日本对虾的ERK1/2蛋白可能不具有如高等动物中的分化。此外,我们克隆到的日本对虾p38基因编码的蛋白质同其他物种进行比较在C端缺少了近100个氨基酸,但是该现象是否真实,它发生的具体原因还需要进一步的实验确认。本论文中还报道了日本对虾中一个与WSSV感染相关的基因——centaurin-α1。由于在早期实验中,我们已经获得了该基因的部分序列,因此,我们首先通过Real time PCR检测了该基因与WSSV感染的关系。结果显示,该基因转录水平的表达量随着病毒感染时间延长,病毒量增加可以显着升高,而且这种现象是在病毒感染早期到中期时出现的,说明该基因可以被WSSV感染所诱导,且在病毒感染过程的早中期参与细胞活动。然而,有趣的是,该基因的转录水平表达量在抗病虾中相比于普通虾却是明显下调的,在后者中,centaurin-α1基因的转录量约为前者的3.6倍。这样的结果说明,centaurin-α1基因及其编码的蛋白质在日本对虾的天然免疫中的作用可能是双向的,即可能既可抗病毒又可被病毒利用从而协助病毒增殖。因此,我们又进一步通过半巢式PCR获取了日本对虾centaurin-α1基因的全长序列,分析表明它与其他物种中的centaurin-α1一样具有保守的结构域,进而可以推测它可能具有的功能。此外,我们还通过RT-PCR和免疫荧光对日本对虾的centaurin-α1进行了组织和细胞的定位。这些研究结果为日后深入研究该基因的功能奠定了基础。
孙保贞[4]2017年在《日本对虾类甲壳肽（crustin-like）基因在溶藻弧菌和白斑综合征病毒感染过程中的作用机制研究》文中指出抗菌肽是在甲壳动物先天性免疫中发挥重要作用的几类小分子肽的总称,其中crustin是很重要的一类抗菌肽。本研究中,我们旨在研究日本对虾(Marsupenaeus Japonicus)在感染白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)或溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)时,类甲壳肽(crustin-like)基因所发挥的免疫功能。通过cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE),从日本对虾体内克隆到一条全长为660 bp的cDNA序列,软件推测分析显示该基因的开放阅读框大小为507bp,编码一个含有168个氨基酸残基的蛋白,基因3′末端含有一条Poly(A)尾巴,5′和3′的非编码区分别为72 bp和81 bp,推测出蛋白质的相对分子质量为16.22 kDa,pI为8.37。氨基酸序列比对和进化树分析显示crustin-like基因主要存在于甲壳动物中的对虾及少部分螃蟹中,其中在日本对虾发现的crutstin-like与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)亲缘关系较近。通过实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测基因表达的组织特异性发现crustin-like在鳃内表达量最高,在血淋巴、肝胰腺、肌肉和消化腺内表达量较低。通过double-strand RNA(dsRNA)干扰技术,体外构建dsRNA表达载体,将纯化后的dsRNA注射到对虾体内,成功地抑制了crustin-like基因的表达。对已知重要的免疫相关基因的检测结果显示,在crustin-like被沉默后,对虾先天性免疫系统中多个免疫相关基因的表达受到影响,其中Immune deficiency homolog(IMD)、Rab7、L-lectin、mitogen-activated protein kinase(MAPK)、p53、prophenoloxidase(proPO)和Rho基因的表达显着下调,而nitric oxide synthase(NOS)、myosin及Tumor necrosis factor-α(TNF-α)基因的表达显着上调。对虾免疫活性试验显示,在抑制crustin-like基因的表达后,对虾血细胞总数显着减少,酚氧化酶(PO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性显着减低。以上结果说明crustin-like对细胞吞噬作用、凋亡和部分免疫通路有显着的影响。进一步研究发现,在感染溶藻弧菌后,crustin-like基因的表达显着上调。统计死亡率发现,沉默crustin-like基因的表达后,对虾感染弧菌后累计死亡率显着增加。结果说明对虾crustin-like有明显的抗弧菌的作用。血细胞吞噬试验结果显示,对虾crustin-like基因被沉默后,对虾血细胞对溶藻弧菌的吞噬率显着升高,血淋巴细胞凋亡率显着升高,结果说明溶藻弧菌在感染对虾时可能会利用crustin-like来逃避对虾血细胞对弧菌的吞噬作用,这一现象还有待进一步的研究。在感染WSSV后12-72 h,crustin-like基因的表达显着升高。WSSV拷贝数检测和Kaplan–Meier生存分析结果显示crustin-like基因被沉默后,WSSV拷贝数显着降低,对虾存活率显着升高。抑制crustin-like基因的表达后,对虾血细胞对WSSV的吞噬率显着降低,对虾血细胞的凋亡显着升高。以上结果说明对虾crustin-like可以抑制细胞凋亡,而WSSV有可能利用crustin-like抑制细胞凋亡的功能来促进病毒粒子在对虾体内的复制。本文首次揭示了类甲壳肽在对虾病毒感染中有着重要作用,为研究对虾的先天性免疫和WSSV感染宿主的机制提供了重要的理论依据。
吴文林[5]2006年在《对虾Rab GTPase在抗病毒免疫中的作用以及对虾白斑综合症病毒（WSSV）膜蛋白与对虾蛋白的互作研究》文中认为对虾白斑综合症病毒(WSSV)是危害养殖对虾的最主要病原,其致病能力强,传播范围广,给世界对虾养殖业造成了巨大的损失,然而至今仍无有效的防治方法。本论文开展了对虾免疫信号因子Rab蛋白在对虾免疫过程中的作用机理研究,同时探索WSSV病毒膜蛋白在感染过程中的作用,从病毒和宿主两方面入手,为建立有效的防治方法提供科学依据。通过3’RACE和5’RACE获得对虾Rab基因(命名为PjRab)的cDNA全长,其ORF为636bp,编码212个氨基酸。序列分析发现,PjRab具备Rab蛋白的基本特征,但在C-端与已知的Rab蛋白不同,可能是一种新的Rab蛋白,这是首次在海洋无脊椎动物体内克隆到该基因。对该基因进行了原核表达,并得到了有活性的表达产物。RT-PCR和Western blot分析发现,PjRab在对虾组织中均有转录和翻译。Real-time PCR分析发现,在受到病毒刺激后PjRab基因表达上调,说明PjRab参与了对虾的免疫过程。通过GST-pull down、质谱等方法,发现PjRab蛋白与肌动蛋白(actin)、原肌球蛋白(tropmoyosin)以及对虾白斑综合症病毒的膜蛋白VP466之间存在互作。体外和体内试验证明,PjRab与actin之间存在相互作用。采用抗体抑制Rab蛋白、RNAi抑制Rab基因表达、体外注射mRNA等方法,结果都证明Rab参与了血细胞的吞噬过程。因此,Rab蛋白参与抗病毒免疫的一条可能途径是,通过与actin的互作,调控血细胞的吞噬活性。这是动物中首次发现这一新途径,我们的研究结果拓展了对小G蛋白在免疫反应中的作用的认识。采用抗体中和试验发现,WSSV被VP28、VP68、VP281和VP466的抗体中和后能延缓对虾的死亡,PCR进一步证实了这一结果。因此,这4种病毒膜蛋白在WSSV的感染过程中起重要作用。为了进一步了解膜蛋白的作用,选择VP466进行研究。通过FITC标记、GST pull-down、质谱分析,发现了VP466的互作因子——ATP合成酶。克隆了对虾ATP合成酶基因的完整阅读框,该基因ORF含有1431bp,编码477个氨基酸。昆虫细胞内的互作试验表明,VP466与ATP合成酶存在相互作用。
洪宇航[6]2013年在《中华绒螯蟹（Eriochier sinensis）血细胞组成、功能及体外培养的研究》文中研究指明作为细胞免疫的承担者和体液免疫相关免疫因子的提供者，血细胞在甲壳动物非特异性免疫中有着重要的作用，包括吞噬、包囊、黑化、细胞毒性、胞间信息传递以及酚氧化酶原系统的激活等。本研究选取在我国具有较高经济价值的主要淡水养殖品种中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）作为研究对象，通过对其血细胞进行多种细胞学染色和免疫相关酶染色，并测定其在嗜水气单胞菌注射后血淋巴中总血细胞数（THC）和不同血细胞比例（DHC）的变化，研究其血细胞种类、各类型比例，以及在免疫应答过程中各类型细胞比例的变化；通过对血细胞在不同培养基、血清、pH、温度和渗透压条件下进行离体培养，确定了最佳的培养条件；对各类型血细胞进行了分离培养。这些研究为今后血细胞的发生、免疫机制以及建立细胞系的研究提供了基础资料，研究结果如下：1.通过对中华绒螯蟹血细胞进行细胞学染色和免疫相关酶染色分析，将中华绒螯蟹血细胞分为四类：大颗粒细胞（Granulocyte，G）、中间型颗粒细胞（Intermediate Granulocyte，IG）、小颗粒细胞（Semigranulocyte，SG）和透明细胞（Hyalinocyte，H）。四种细胞中，大颗粒细胞体型最大，同中间型细胞一样含有嗜酸性颗粒；小颗粒细胞数量最多，含有大量嗜碱性颗粒；而透明细胞体型最小，基本不含任何颗粒物质。四种细胞中均含有多糖成分而不含脂类物质；只有大颗粒细胞在四种水解或氧化酶检测中显示阳性反应。通过体外注射嗜水气单胞菌，中华绒螯蟹血淋巴THC发生不同程度变化。其中注射组(注射浓度1×109CFU/ml嗜水气单胞菌100μl)较生理盐水组（注射蟹生理盐水100μl）变化更明显，在6h THC达到最大值，显着高于其余两组（P＜0.05）,然后逐渐降低到接近正常水平。而注射组的DHC检测结果显示：透明细胞数量在注射后3h大幅度增加，6h后达到最大值，比最初增加了接近一倍，然后有所回落；小颗粒细胞数量基本保持不变；而其他各类型细胞数量均有不同程度下降，其中大颗粒细胞数量持续下降，在12h降至最低，相比正常值降低了约一倍，然后有所回升。本研究证实，不同类型中华绒螯蟹血细胞有着不同的结构与功能。其中，大颗粒细胞有较高的酶活性而透明细胞有较强的直接抗病菌作用，他们在免疫应答过程中共同作用来抵御病原物质的入侵。2.比较了几种常见血细胞培养基（L-15、2×L-15、3×L-15、 M199和RMPI-1640）对中华绒螯蟹血细胞离体培养中细胞形态以及存活率的影响，以及在筛选获得的最佳培养基中添加不同比例胎牛血清(FBS)(0%、5%、10%和15%)，进一步观察了血清对中华绒螯蟹血细胞培养效果的比较。结果表明，3×L-15培养基培养效果较好，所培养的细胞形态相对完整，数量较多，培养至96h时血细胞存活率仍大于60%;而其他4种培养基效果较差，培养12h存活率均低于50%，且细胞形态结构变化明显。以3×L-15培养基为基础，添加不同比例胎牛血清后发现，对细胞存活有显着影响，存活率明显降低。因此，不添加血清的3×L-15培养基对中华绒螯蟹血细胞的生长较为适宜。3.研究了不同pH（6.4、6.8、7.2、7.6和8.0）、温度（26、28和30℃）和渗透压（500、700、900、1100和1300mOsM kg-1）对中华绒螯蟹血细胞离体培养中细胞存活率和细胞形态的影响，并比较了在不同培养基下（L-15和3×L-15）改变渗透压（1100和1300mOsM kg-1）对其离体培养的影响。结果表明，3×L-15培养基调整渗透压至1100mOsM kg-1，pH6.8，28℃为中华绒螯蟹血细胞离体培养的最佳条件，能提供血细胞＞40%存活率达7d。通过不连续梯度密度离心，初步分离了富含叁种类型细胞的细胞带。将各类型细胞分别在最佳条件下培养，使小颗粒细胞和透明细胞的存活时间显着增加，保持＞50%存活率15d以上。相反，分离后的大颗粒细胞在3d内迅速死亡。
王军霞[7]2000年在《日本沼虾及日本对虾的细胞培养》文中进行了进一步梳理本文首次报道了日本沼虾血细胞的培养，比较了五种不同的培养基（A、B、C、D、E），两种不同的渗透压（472mmol/Kg、750mmol/Kg）中日本沼虾原代培养血细胞的生长状况，并以碱性磷酸酶活力为测定指标。结果表明，培养基A为最适培养基，其次为B，渗透压472mmol/Kg较750mmol/Kg更利于细胞生长。在A培养基的基础上尝试了日本沼虾血细胞原代培养的首次传代并获得成功。基础培养基选用美国GIBCO公司的M199，并添加20％胎牛血清，100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素，用5N NaCl调节渗透压为472mmol/Kg，pH值调至7.0±0.1。我们对原代和传代血细胞进行了比较，并观察了在上述培养条件下加入1g/L葡萄糖，0.1mg/L维生素C对传代血细胞生长及贴壁的影响。讨论了金属离子Cu~(2+)、Zn~(2+)对日本沼虾传代血细胞碱性磷酸酶活性及总磷含量的影响。实验结果表明，加入适量维生素C可促进细胞贴壁，1g/L葡萄糖的加入可促进细胞生长。培养液中加入微量Cu~(2+)可提高日本沼虾传代血细胞碱性磷酸酶的活性，当Cu~(2+)浓度为2μg/L时其活性有显着提高（P＜0.05），在此浓度下总磷含量也最高。Zn~(2+)在80μg/L时对碱性磷酸酶活力无显着影响，但传代血细胞中总磷含量较高，细胞生长较其它组也好。实验最后我们对日本对虾的肌肉和血细胞进行了体外培养的尝试，并对体外培养的血细胞进行了电镜观察。在199培养基中添加20％加热灭活的胎牛血清及一些氨基酸、无机盐等，血细胞在一周内即可形成细胞单层，传代后，细胞不能贴壁。电镜观察表明血细胞贴壁后变形伸展，细胞内可见少许空泡。
赵先银[8]2011年在《pH胁迫对叁种养殖对虾生理生化指标的影响》文中研究说明养殖水体是对虾的生活环境,水质的好坏直接影响对虾的生长和经济效益。在氨氮、pH、溶解氧、温度、盐度等各项常规监测理化指标中,pH是最重要的指标之一,是水体化学性状和生命活动的综合反应,能严重影响水体的生物生产力。目前,国内外虽有关于pH胁迫对对虾生长、离子转运酶及免疫相关因子方面的研究,但有关中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、日本对虾(Marsupenaeus japonicus)叁种养殖对虾在同一条件下的比较研究还未见报道。本文以生长、存活、离子转运酶及免疫因子为指标,研究叁种对虾对水体pH变化的耐受程度。研究共分叁部分:第一部分:比较研究了中国对虾、凡纳滨对虾和日本对虾在对照组(pH 8.2)、低pH胁迫组(pH 7.2)和高pH胁迫组(pH 9.2)养殖水体条件下的存活率、鳃离子转运酶(Na~+-K~+-ATPase)活力及血淋巴诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、酚氧化酶(PO)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、溶菌酶(LSZ)活性及肌肉RNA/DNA比值的变化情况。结果表明:对照组叁种对虾的存活率整个实验期间均为100%;低pH和高pH胁迫条件下,96h时日本对虾存活率分别为96.7%和97.0%;凡纳滨对虾存活率分别为60.1%和54.6%,中国对虾的存活率分别为58.6%和13.3%。对照组条件下,凡纳滨对虾鳃离子转运酶(Na~+-K~+-ATPase)活力最大,中国对虾其次,日本对虾最小;在低和高pH胁迫条件下,中国对虾鳃Na~+-K~+-ATPase活力变化幅度均比凡纳滨对虾大,日本对虾的变化幅度最小,并且叁种对虾鳃Na~+-K~+-ATPase活力在高pH胁迫条件下变化幅度均较大。对照组条件下日本对虾和凡纳滨对虾血清中非特异性免疫酶活性均显着或极显着高于中国对虾,且日本对虾的PO、SOD活力分别显着、极显着高于凡纳滨对虾;在低和高pH胁迫条件下,中国对虾和凡纳滨对虾血清非特异性免疫酶的活力变化幅度均显着高于日本对虾,并且中国对虾PO、SOD、iNOS活力在高pH条件下变化幅度较大。与对照组相比,叁种对虾肌肉RNA/DNA比值随着pH胁迫时间延长而降低,说明对虾生长受到抑制。第二部分:采用荧光定量PCR技术,比较了中国对虾、凡纳滨对虾和日本对虾的离子转运酶(Na~+-K~+-ATPase酶)、酚氧化酶原(proPO)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因在不同pH胁迫条件下的表达变化。主要结果如下:(1)不同pH胁迫条件下,叁种对虾鳃Na~+-K~+-ATPase酶基因表达均随着胁迫时间延长表现出先上升后下降的趋势,与对照组相比差异显着(P<0.05),各个pH胁迫组相比,高pH胁迫组(pH8.7、9.2组)对中国对虾Na~+-K~+-ATPase酶基因表达的影响较大;叁种对虾相比,中国对虾Na~+-K~+-ATPase酶基因表达的变化幅度较大,凡纳滨对虾次之,日本对虾变化幅度较小。(2)不同pH胁迫条件下,中国对虾和凡纳滨对虾proPO基因表达随着胁迫时间延长表现出先上升后下降的趋势,而且出现两个或者叁个表达高峰,与对照组相比差异显着(P<0.05),日本对虾proPO基因表达除pH9.2组外其余胁迫组均随胁迫时间延长先有所下降,然后又升高,达到峰值后又下降的趋势,各个pH胁迫组相比,高pH胁迫组对中国对虾、凡纳滨对虾proPO基因表达的影响较大,pH6.7、7.2组对日本对虾proPO基因表达的影响较大;叁种对虾相比,中国对虾proPO基因表达变化幅度较大,凡纳滨对虾其次,日本对虾表达变化较小。(3)不同pH胁迫条件下,中国对虾和日本对虾Mn-SOD基因表达随着pH胁迫延长表现出先升高后下降的趋势,而且出现两个或叁个表达高峰,与对照组相比差异显着(P<0.05),凡纳滨对虾在pH7.2、7.7胁迫组Mn-SOD基因表达表现出先上升后下降的趋势,而高pH胁迫组则表现出表达量逐渐下降的趋势,各个pH胁迫组相比,pH7.2组对中国对虾影响较大,pH8.7、9.2组对凡纳滨对虾影响较大,pH7.7、8.7组对日本对虾影响较大;叁种对虾之间相比,日本对虾Mn-SOD基因表达的变化幅度较大,中国对虾次之,凡纳滨对虾最小。第叁部分:本章以中国对虾、凡纳滨对虾和日本对虾为实验材料,在解剖学的基础上,分析不同pH胁迫条件下叁种对虾鳃、肝胰腺的外观症状及显微结构的变化。结果表明pH胁迫72h后虾鳃颜色发乌,有的发黑,鳃组织充血、肿胀,出现大量炎症细胞;上皮层增厚,相互间的间隙减小,有的区域出现粘连,鳃丝水肿,核固缩,并且中国对虾、日本对虾鳃组织在pH8.7、9.2条件下比pH6.7、7.2条件下损伤严重,凡纳滨对虾pH6.7组损伤较9.2组损伤严重; pH胁迫72h后肝胰腺由鲜红变为暗红,肝胰腺组织广泛受损,肝小管排列紊乱,边界变得模糊,管腔也在缩小;肝小管之间的结缔组织和上皮细胞出现损伤,细胞大量解体、细胞核固缩或消失,并且中国对虾、日本对虾肝胰腺组织在pH8.7、9.2条件下比pH6.7、7.2条件下损伤严重,凡纳滨对虾pH6.7、7.2组比8.7、9.2组损伤严重。由以上结果分析可知,叁种对虾存活率相比,pH胁迫96h后中国对虾存活率最低,凡纳滨对虾其次,日本对虾存活率最高,并且中国对虾pH9.2组存活率较pH7.2组低;不同pH胁迫组相比,中国对虾pH9.2条件下鳃Na~+-K~+-ATPase,血淋巴PO酶活力及Na~+-K~+-ATPase,proPO基因表达和鳃组织损伤变化均较其他胁迫组大,这与pH9.2条件下存活率较低相一致,因此推测Na~+-K~+-ATPase和PO与pH胁迫较相关;叁种对虾相比,中国对虾对pH胁迫敏感,耐受性较弱,凡纳滨对虾其次,日本对虾耐受范围较广。
杜欣军[9]2007年在《中国明对虾先天免疫的模式识别与效应分子》文中研究指明中国明对虾主要分布于我国黄渤海和朝鲜西部沿海，是我国最具经济价值和营养价值的海产品之一。大量捕捞和各种病原体(细菌、病毒等)的感染，严重威胁着这一物种的生存。自上世纪七十年代以来在我国沿海一带，开展了大量的中国明对虾养殖生产，使得养殖产量大大超过海捕量。但是自从1993年大规模爆发对虾流行病(对虾白斑综合症)以来，中国明对虾的养殖遭到重创，产量一直没有恢复。这一方面与白斑综合症病毒的高度感染性和致死性有关，另一方面也与中国明对虾自身免疫力有关。因此，对于中国明对虾免疫系统的研究显得尤为重要。在理论上可以加深我们对于无脊椎动物先天免疫的认识，丰富先天免疫的理论；在实际应用中，可以为中国明对虾的疾病防治和提高抗病力提供新思路和新方法。本研究通过淘选噬菌体展示文库、同源克隆和抑制性消减杂交的方法从中国明对虾中分别克隆得到了围食膜蛋白基因、脂多糖-β-1，3-葡聚糖结合蛋白(LGBP)和叁种抗菌肽(crustin)基因，并对这些基因的性质做了进一步研究。这些研究使我们对中国明对虾免疫的模式识别和效应分子有了进一步的认识。一、中国明对虾围食膜蛋白基因克隆和性质研究我们用弧菌和金黄色葡萄球菌刺激中国明对虾以后，提取其血细胞的总RNA。再提取mRNA后用其构建了T7噬菌体展示文库。选择了多种配体来进行文库淘选，在用大肠杆菌经过3轮淘选以后获得了一段围食膜蛋白的基因。在这一片段的基础上设计基因特异性引物利用RACE和SMART cDNA技术获得了基因的全长。中国明对虾围食膜蛋白基因(Fc-PTPH)全长为1028bp，开放阅读框为822bp，共编码274个氨基酸。基因的5'端含有17bp的非编码区，3'端含有209bp的非编码区。这一基因编码的蛋白为30.6kDa，其理论等电点为4.92。蛋白前20个氨基酸为信号肽序列，其含有4个围食膜蛋白A样结构域(peritrophin A-like domains)，经过SMART预测，其中后叁个为几丁质结合结构域(chitin-binding domains，CBDs)。通过Northern blot和RT-PCR研究发现，Fc-PTPH组成性高表达于卵巢中，在肝胰腺中没有表达，而在其它组织(血细胞、心、胃、鳃、肠、精巢)中细菌刺激才能诱导这一基因的表达。我们还用Northern blot方法研究了Fc-PTPH在肠和卵巢中细菌刺激后不同时间的表达变化。结果显示，在肠中刺激16小时后能够检测到基因的表达，在24小时时表达量达到最高。而在卵巢中，在刺激后不同时间Fc-PTPH的表达没有变化，一直维持着高表达模式。原位杂交显示这一基因的mRNA存在于颗粒血细胞和卵母细胞的细胞质中。设计了成熟肽表达引物，经过PCR扩增后连入pET-30a(+)载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达。由于表达产物形成包涵体，所以只有经过变性复性后，才能利用His-Bind亲和层析柱进行纯化。利用纯化的蛋白作为抗原刺激家兔获得了多克隆抗血清，免疫双扩散显示抗体滴度可以达到8倍稀释。Western blot检测也能获得清晰、特异的条带。利用重组的围食膜蛋白进行几丁质结合实验，BSA为对照。结果显示重组的围食膜蛋白具有很强的几丁质结合能力，而BSA完全不能结合几丁质。我们还选择了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌验证围食膜蛋白结合细菌的能力，结果显示围食膜蛋白能够结合革兰氏阴性菌，而对革兰氏阳性菌则没有结合能力。二、中国明对虾脂多糖-β-1，3-葡聚糖(LGBP)基因克隆和性质研究根据相近物种的同一类基因设计了两对兼并引物，巢式PCR后获得了中国明对虾LGBP基因(Fc-LGBP)的中间片段，再根据这一片段设计引物从血细胞SMART cDNA中克隆得到了基因全长。基因全长为1253bp，包含1101bp的开放阅读框。在基因的5'端含有7bp的非编码区，3'端含有129bp的非编码区。这一基因编码的蛋白质由366个氨基酸构成，其中前17个氨基酸为信号肽序列。预测成熟肽分子量为39.8kDa，等电点为4.43。通过软件预测，中国明对虾LGBP含有两个N糖基化位点和一个细胞粘连位点(Arg-Gly-Asp，RGD)。从蛋白94位氨基酸至312位氨基酸是一个糖基水解酶结构域。选取正常及细菌刺激的血细胞、心、肝胰腺、胃、鳃、肠的总RNA进行Northern blot分析，结果显示Fc-LGBP仅表达于血细胞中，细菌刺激24小时后基因表达量下降。这一结果在RT-PCR中得到了进一步验证，但是由于RT-PCR更灵敏一些，还可以在肝胰腺和鳃中检测到基因的表达，但是其表达很弱。我们选取了多种组织来研究Fc-LGBP基因表达的组织定位，原位杂交显示Fc-LGBP基因的mRNA只存在于颗粒细胞的细胞质中。根据基因序列设计成熟肽表达引物，将基因片段克隆到载体pET-30a(+)中，转化其感受态细胞进行原核表达。重组表达的蛋白也形成包涵体，变性、复性以后用His-Bind亲和柱进行纯化。利用重组表达并纯化的LGBP作为抗原免疫家兔，9周后获得多克隆抗血清。在获得了LGBP多克隆抗体以后，我们研究了LGBP蛋白在不同组织中的分布。首先利用免疫组化的方法研究了LGBP的组织定位，一抗反应后，再用FITC标记的羊抗兔IgG检测，在荧光显微镜下可以观察到LGBP蛋白定位于绝大多数血细胞的细胞膜上，形成颗粒状的荧光信号。利用多克隆抗体，我们还研究了LGBP蛋白在对虾各组织中的表达模式。将对虾各组织(血浆、血细胞、心、肝胰腺、鳃)蛋白进行SDS-PAGE并转膜后，用LGBP多克隆抗体进行标记，再用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG进行二抗标记，显色后发现，天然的LGBP蛋白主要存在于血细胞中，在肝胰腺也有较弱的表达，天然蛋白的分子量约为40kDa。在其它组织中则没有检测到蛋白的存在。最后，我们选取了9种微生物进行了结合实验，包括：2种革兰氏阴性菌(大肠杆菌，Escherichia coli；肺炎克氏杆菌，Klebsiella peneumoniae)，5种革兰氏阳性菌(金球菌，Staphylococcus aureus；苏云金芽孢杆菌，Bacillus thuringiensis；藤黄微球菌，Micrococcus luteus；蜡状芽孢杆菌，Bacillus cereus；巨大芽孢杆菌，Bacillus megaterium)和一种酵母(毕赤酵母，Pichia pastoris)。结果显示Fc-LGBP对革兰氏阴性菌(K．peneumoniae)的结合能力最强。对革兰氏阴性菌(E．coli)、革兰氏阳性菌(M．luteus，B．megaterium)和酵母(P．pastoris)的结合能力稍弱。而对于其它的革兰氏阳性菌(S．aureus，B．thuringiensis or B．cereus)则没有结合能力。叁、中国明对虾叁种甲壳肽(crustin)类抗菌肽的基因克隆和性质研究我们在中国明对虾血细胞抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)文库测序的EST中发现了一段序列与crustin基因相似，根据这段序列设计特异性前引物从血细胞SMART-cDNA中获得了基因的3'端，又设计特异性后引物，获得了基因5'端的部分序列，将此基因命名为Fc-crustinⅠ。在扩增Fc-crustinⅠ的5'端时，获得的片段与已经获得的Fc-crustinⅠ的部分序列除引物外不能完全重迭，便命名为Fc-crustinⅡ；根据这一基因片段设计基因特异性引物，获得了Fc-crustinⅡ基因的完整序列。在Fc-crustinⅠ3'端克隆时，在卵巢组织中获得的片段与预期大小不一致，将其克隆测序后是一条具有完整的3'端的EST，BLAST结果显示其与crustin具有较高的同源性，便命名为Fc-crustinⅢ；根据Fc-crustinⅢ的这一序列设计引物获得了这一基因的全序列。已经获得的Fc-crustinⅠ部分基因序列含有完整的乳清酸性蛋白(whey acidic protein，WAP)结构域，位于基因的3'端由49个氨基酸构成。Fc-crustinⅡ基因全长473bp，包含一个390bp的开放阅读框，编码130个氨基酸。在基因的5'端有4bp的非编码序列，3'端的非编码序列为79bp。通过ExPASy网站在线预测，这一基因编码的蛋白分子量为14.0kDa，其理论等电点为8.60。蛋白前17个氨基酸为信号肽序列，蛋白C端83-124位氨基酸形成WAP结构域。Fc-crustinⅢ基因全长为574bp，其开放阅读框为462bp，共编码154个氨基酸。基因5'端和3'端的非编码区分别为38bp和74bp。通过软件预测Fc-crustinⅢ基因编码的蛋白分子量为17.79kDa，其理论等电点为4.64。前20个氨基酸形成信号肽，62-127位氨基酸构成WAP结构域。选取正常及细菌刺激24小时中国明对虾血细胞、心、肝胰腺、胃、鳃、肠、卵巢和精巢组织，利用RT-PCR方法分析叁种crustin基因的表达模式。结果显示Fc-crustinⅠ基因广泛表达于各种组织，在血细胞中表达量最高，精巢中表达量最低。在多数组织中细菌刺激前后Fc-crustinⅠ表达变化不大，但是在胃中刺激后表达上调比较明显。Fc-crustinⅡ也广泛表达于各种组织中，在各组织中的表达差异与Fc-crustinⅠ相似，在血细胞中的表达量最高。细菌刺激后在心、鳃、卵巢组织中表达上调比较明显，而在其它组织中，刺激前后表达变化不大。Fc-crustinⅢ的表达模式同Ⅰ和Ⅱ差别比较大，Fc-crustinⅢ只表达于少数几种组织中，包括正常心、刺激胃、正常卵巢和刺激卵巢。另外，在刺激的心和肠中有少量表达。在其余组织中则没有检测到Fc-crustinⅢ基因的表达。设计成熟肽表达引物，将Fc-crustinⅡ和Fc-crustinⅢ分别克隆入pET-30(+)，然后转入大肠杆菌进行原核表达。利用His-Bind亲和柱纯化以后检测其抑菌活性，结果表明原核重组表达的Fc-crustinⅡ和Fc-crustinⅢ的成熟肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都没有抑制活性。又重新设计表达前引物，将信号肽一起进行原核重组表达，用管碟法检测后，Fc-crustinⅢ重组表达蛋白的抑菌活性没有检测到，而Fc-crustinⅡ对藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌两种革兰氏阳性菌具有抑制活性。总之，本研究成功从中国明对虾中克隆到围食膜蛋白基因、LGBP基因和crustin抗菌肽基因，并研究了叁类基因的性质，这些研究使我们对中国明对虾免疫的模式识别和效应分子有了进一步的认识。
许森[10]2014年在《L型凝集素和Toll、IMD信号通路关键因子在日本对虾先天免疫中的功能研究》文中研究说明免疫系统包括先天免疫和适应性免疫,无脊椎动物只有先天免疫。虽然在属于无脊椎动物的模式生物果蝇中,有关先天免疫研究的比较清楚,但是在海洋无脊椎动物中的研究有待投入更多的精力。本文以海洋无脊椎动物,日本囊对虾为研究对象,对其模式识别和免疫相关信号途径进行了研究。发现L型凝集素可能做为一种调理素辅助血细胞进行吞噬作用；Toll和IMD信号通路参与抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的免疫应答,并且发现同一个抗菌肽可以受这两条信号通路的调控。(1)日本囊对虾的一种L型凝集素促进血细胞对病原菌的吞噬作用能力L型凝集素(L-Type Lectin, LTLs)含有糖类识别结构域,与来源于豆科植物种子的凝集素在结构上的折迭方式相似。这是一类I型跨膜蛋白,在动物中LTLs主要参与了蛋白的分泌过程,与糖蛋白的筛选、转运和靶向运输有关。最近有研究表明LTLs可能参与了脊椎动物的免疫应答,但在无脊椎动物先天免疫中的功能尚未见报道。我们从日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)中发现了一种L型凝集素并命名为MjLTL1,它含有一个信号肽、一个L型凝集素结构域和一个跨膜结构域。在鳗弧菌感染的对虾血细胞和肝胰腺中表达上调；在Ca2+的存在下能够凝集细菌,包括多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。并能结合多种细菌,这种结合活性归因于MjLTL1能够结合脂多糖、脂磷壁酸和肽聚糖。MjLTL1能够帮助清除鳗弧菌。在将MjLTL1通过RNA干扰技术敲低表达后,对虾体内残留的鳗弧菌明显比对照组多。进一步的研究发现MjLTL1可能促进血细胞吞噬细菌。为了找到这一作用可能的机制,我们从对虾中克隆到一个解聚素和金属蛋白酶样蛋白(a disintegrin and metalloprotease-like protein)并命名为MjADAM。 ADAM能够水解膜蛋白从而介导一种胞外域脱落机制。研究发现它的组织分布和表达模式与MjLTL1类似。通过注射dsMjADAM将MjADAM的表达下调后,血细胞的吞噬效率降低了。之前有报道ADAM可以剪切位于细胞膜上的LTL,从而释放出游离的N端,这种机制称为胞外域脱落。我们的研究结果说明MjLTL1和MjADAM可能也存在相同的机制,MjADAM将鳗弧菌感染后从细胞质转移到细胞膜上的MjLTL1剪切从而释放出游离端,通过结合和凝集细菌促进血细胞吞噬细菌,做为一种调理素参与对虾的先天免疫。(2) Toll和IMD信号通路调控抗菌肽表达的机制研究果蝇中抗菌肽的表达主要受Toll和免疫缺陷(IMD)信号通路的调控。但在日本对虾中这两条信号通路,尤其是IMD信号通路的研究刚刚开始,并且,日本对虾中Toll和IMD信号通路各自调控哪些抗菌肽(AMPs)的表达,如何调控它们的表达：独立的还是合作,或存在其它机制还不清楚。为此,我们对日本囊对虾(M.japonicus)中两条通路的转录因子,分别命名为MjDorsal和MjRelish,和在信号转导过程中起关键作用的分子,命名为MjMyD88和MjIMD进行了研究。其中MjDorsal和MjMyD88属于Toll信号通路,而MjRelish和MjIMD属于IMD信号通路。MjDorsal含有RHD (Rel homology domain)结构域、ANK结构域和IPT (Ig-like, plexins, transcription factors)结构域；MjRelish含有一个RHD结构域和IκB样结构域(两个串联的ANK结构域)；我们只得到MjMyD88的部分序列,该序列所编码的氨基酸是TIR结构域的一部分；MjIMD含有一个Death结构域。通过qRT-PCR发现MjDorsal主要分布于血细胞、鳃、胃和肠中;MjRelish主要分布于血细胞和肠中；MjMyD88主要分布于肝胰腺和鳃中；MjIMD主要分布于血细胞、肝胰腺、鳃和胃中。在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染日本对虾后,这四种分子在血细胞、胃和肠中表达上调,但是上调表达的起始时间和持续时间不同。为了找到这两条信号通路所调控的抗菌肽(antimicrobial peptides AMPs),我们选择了15种AMPs做为候选效应基因进行表达模式筛选,发现其中5种AMPs:MjALF4, MjALF6, MjALF8, MjCrus12,MjLys4在感染鳗弧菌和金黄色葡萄球菌的对虾组织中会上调表达,但是表达上调时间和存在的组织不同,MjALF4, MjALF6和MjALF8在六种组织中都能都检测到；MjCrus12主要分布于鳃、胃和肠中；MjLys4主要分布于鳃和胃中。我们通过注射双链RNA(dsRNA)将MjDorsal、MjRelish、MjMyD88和MjIMD基因分别沉默后再分别感染鳗弧菌和金黄色葡萄球菌,通过qRT-PCR检测上述五种抗菌肽的表达模式,结果显示在MjDorsal (MjMyD88)干扰组并注射金黄色葡萄球菌后,这五种抗菌肽与对照组(注射dsGFP)相比,其表达量不再被革兰氏阳性菌刺激所诱导而上调,而针对鳗弧菌的感染它们的表达仍然明显上调；在MjRelish和MjIMD干扰组并注射革兰氏阴性菌鳗弧菌后,上述五种抗菌肽不再上调表达,而对金黄色葡萄球菌的感染与对照组相同依然上调表达。以上的结果表明,在日本对虾中,Toll信号通路主要被革兰氏阳性菌的感染所激活,而IMD信号通路主要被抗革兰氏阴性菌的感染所激活,调控抗菌肽的表达。同一种抗菌肽可以受不同信号途径的调控。
参考文献：
[1]. 日本对虾肝胰腺及血细胞的培养[D]. 王宏伟. 河北大学. 2001
[2]. 不同pH值条件下日本对虾肝胰腺及血的细胞培养[J]. 王宏伟, 孟翠丽, 刘晋, 齐小强, 张毅. 动物学杂志. 2005
[3]. 日本对虾免疫相关基因的克隆及功能的初步研究[D]. 王慧芬. 国家海洋局第叁海洋研究所. 2008
[4]. 日本对虾类甲壳肽（crustin-like）基因在溶藻弧菌和白斑综合征病毒感染过程中的作用机制研究[D]. 孙保贞. 浙江农林大学. 2017
[5]. 对虾Rab GTPase在抗病毒免疫中的作用以及对虾白斑综合症病毒（WSSV）膜蛋白与对虾蛋白的互作研究[D]. 吴文林. 厦门大学. 2006
[6]. 中华绒螯蟹（Eriochier sinensis）血细胞组成、功能及体外培养的研究[D]. 洪宇航. 上海海洋大学. 2013
[7]. 日本沼虾及日本对虾的细胞培养[D]. 王军霞. 河北大学. 2000
[8]. pH胁迫对叁种养殖对虾生理生化指标的影响[D]. 赵先银. 上海海洋大学. 2011
[9]. 中国明对虾先天免疫的模式识别与效应分子[D]. 杜欣军. 山东大学. 2007
[10]. L型凝集素和Toll、IMD信号通路关键因子在日本对虾先天免疫中的功能研究[D]. 许森. 山东大学. 2014
标签：水产和渔业论文; 对虾论文; 血细胞论文; 中国对虾论文; 日本对虾论文; 氨基酸残基论文; 基因合成论文; 细胞免疫论文;