（昆明理工大学医学院 云南 昆明 650000）
【摘要】目的：实现APP/PS1双转基因阿尔茨海默病（AD）小鼠的繁殖并采用多对引物同时进行的多重PCR对子代小鼠进行基因型鉴定。方法：将阳性转基因雄鼠与野生型雌鼠一对一进行交配，利用多引物多重PCR鉴定子代小鼠的基因型。结果：在合适的PCR条件下三引物体系可以准确有效鉴定出子代小鼠的基因型。结论：正确饲养繁殖及利用多引物同时进行的多重PCR对子代小鼠进行基因鉴定可以快速有效获得APP/PSl双转基因小鼠，为后续研究提供有效的AD动物模型。
【关键词】阿尔茨海默病；APP/PSl双转基因小鼠；多重PCR；基因型鉴定
【中图分类号】R741 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）15-0234-02
阿尔茨海默病（Alzheimer Disease，AD）是一种最常见的神经退行性疾病，临床表现为进行性认知障碍和神经精神异常，AD的病理学改变包括：神经细胞内的神经元纤维缠结和细胞外的β淀粉样蛋白沉积等[1-2]。阿尔茨海默病的病因尚未完全明了，其发病机制的研究一直是神经科学研究的热点。目前，Aβ假说[3]因其能够较好的符合病理学、实验以及临床流行病学研究结果而受到越来越多的认可。
针对Aβ假说，目前构建了多种实验动物模型。APP/PSl双转基因小鼠被认为是最能够模拟AD自然病理生理过程的动物模型[4]。转基因鼠价格较高，为节约成本并使本课题有充足的AD模型，我们使用APP/PSl双转基因纯合子雄鼠和野生型雌鼠进行繁殖，采用Vazyme公司的试剂盒快速提取鼠尾基因组，采用多引物多重PCR进行子代小鼠基因型鉴定，鉴定结果准确快速。具体方法及结果如下。
1.资料与方法
1.1 一般资料
由南京模式动物研究所提供B6.Cg-Tg（APPswe，PSEN1dE9）85Dbo/Mmjax双转基因小鼠阳性雄鼠10只，野生阴性雌鼠10只（5～6月龄）。雌雄分开每5只一组饲养于昆明理工大学实验动物中心SPF级饲养间。饲养期间遵照国家实验动物饲养和使用指南，饲养环境为温度（22±2）℃ ，湿度：50%～70%，光周期L:D=12h:12h，自由饮水和取食。雄鼠体重28～32g，雌鼠体重23～26g。
1.2 主要试剂和仪器
One Step Mouse Genetyping Kit试剂盒（Vazyme公司）。APP、PSl引物（上海生工）。Genecolour Ⅱ TM核酸染料（北京金博益）。PCR仪（Biometra公司），凝胶电泳成像系统（Bio-Rad公司），低速台式离心机（Sigma公司），电泳仪（Bio-Rad公司）。
1.3 繁殖方法
实验动物购买后在实验室内饲养一月后进行实验。雄鼠与雌鼠一对一进行交配繁殖。子代小鼠出生28天后雌雄分笼饲养并打耳标进行标记。
1.4 基因鉴定
1.4.1鼠尾获取 小鼠出生28天后剪取尾尖2～3mm备用。
1.4.2 DNA提取 （1）根据样品数按每个样品2μl蛋白酶K+100μl缓冲液配制裂解液；（2）每个EP管加入100μl裂解液确保鼠尾完全浸入，混匀，55℃金属浴20min；孵育完成后95℃金属浴5min灭活蛋白酶K；（3）裂解产物振荡混匀，12000rpm，离心5min。取上清液，-20℃保存。
1.4.3 PCR扩增引物序列设计如下 APP（350bp）正义链：5'-GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG-3'；反义链：5'-CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCC-3'。PSl（608bp）正义链：5'-AATAGAGAACGGCAGGAGCA-3'；反义链：5'-GCCATGAGGGCACTAATCAT-3'。GAPDH（224bp）正义链：5'- AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3'，反义链：5'-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3'。PCR反应体系25uL，同时加入三对引物进行扩增。扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火40s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸7min。
PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳后进行光密度扫描，用凝胶成像分析系统进行观察分析。
2.结果
2.1 小鼠繁殖数量
初始繁殖笼10笼，淘汰无法生育，吃崽及不哺乳小鼠后剩余6笼为可繁殖笼。每笼平均约每月繁殖一窝，每次产仔4～6只。合笼3个月后子代小鼠存活状况及基因鉴定结果如表1所示。
图 APP/PSl双转基因小鼠基因型的多引物PCR鉴定结果
M为DL2501 DNA Marker，2、4、5是双转基因阳性鼠，1、3是双转基因阴性鼠。
3.讨论
本实验采用APP/PSl双转基因纯合子雄鼠与野生同窝阴性雌鼠交配繁殖，根据遗传规律后代有1/4的机率为阴性纯合子，所以在使用前必须进行基因型检测。目前大多采用单引物进行基因扩增，鉴定过程较长且耗费较多的DNA样本及试剂。该实验使用Vazyme公司One Step Mouse Genetyping Kit试剂盒快速提取组织DNA，且裂解产物经离心后不需其他处理即可直接用做PCR扩增模板。采用多对引物法同时进行PCR扩增的鉴定结果与双引物法相同，但极大的节省了实验时间，为课题组今后开展AD相关研究提供了理想的动物模型。
【参考文献】
[1] Cummings B J,Pike C J,Shankle R,Cotman C W.Beta-amyloid deposition and other measures of neuropathology predict cognitive status in Alzheimer's disease[J].Neurobiol Aging, 1996,17(6):921-933.
[2]张静爽，王蓉.阿尔茨海默病发生机制的研究进展[J].首都医科大学学报，2014，35(6):721-724.
[3] Hardy J,Selkoe D J.The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease:progress and problems on the road to therapeutics[J]. Science,2002,297(5580):353-356.
[4] Breyhan H,Wirths O,Duan K,Marcello A,Rettig J,Bayer T A.APP/PS1KI bigenic mice develop early synaptic deficits and hippocampus atrophy[J].Acta Neuropathol,2009,117(6):677-685.
论文作者:王玉梅,褚光辉,付玉（通讯作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2019年15期
论文发表时间:2019/7/19
标签：小鼠论文; 引物论文; 转基因论文; 子代论文; 鉴定论文; 基因型论文; 阿尔论文; 《医药前沿》2019年15期论文;