关键词：乳腺癌；MCF-7细胞；葡萄籽原花青素；紫杉醇；
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率呈逐年递增趋势。手术后化疗是治疗乳腺癌的常用方法，但化疗药物在发挥抗肿瘤作用的同时，可对机体免疫系统造成损伤。紫杉醇是一种由红豆杉属植物树皮和树叶提取的二菇类化合物。紫杉醇及其衍生物具有独特的抗癌机理，临床研究表明，对多种癌症，包括部分常规化疗无效的癌症有明显疗效。葡萄籽原花青素(GSPE)是从葡萄籽中提取出的一大类多酚化合物的总称，属于生物黄酮类，主要由儿茶素和表儿茶素为单体聚合而成。近年来的研究表明葡萄籽原花青素具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、降血糖、抗动脉粥样硬化等多种药理作用，涉及到心血管、内分泌、呼吸等多个系统的疾病[1]。GSPE还有抗疲劳、抗衰老、抗辐射和突变、抗抑郁、抗感染、保护肝肾、改善记忆能力障碍等多种作用，且具有生物适应性好、生物利用度高、毒性低的特点[2]。随着对GSPE药理学研究的不断深入，研究者发现其对多种肿瘤细胞具有抑制作用。本研究探讨GSPE与紫杉醇联合用药对鼠乳腺癌MCF-7细胞增殖及迁移的影响，报道如下。
1材料与方法
1.1 一般材料 鼠乳腺癌MCF-7细胞株（中国医学科学院细胞库）；葡萄籽原花青素（西安兰草生物科技有限公司，CAS号84929-27-1）；紫杉醇（四川康益生物技术制药有限责任公司，国药准字H19990269);MTT(美国Sigma公司）；体积分数15%胎牛血清（杭州四季生物工程材料有限公司）RPMI1640培养基（含青霉素100u/mL和链霉素100u/mL)、DMSO(美国Sigma公司）；Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司）；PBS[中科迈晨(北京）科技有限公司]MTT及RNA反转录试剂盒(上海英拜生物科技有限公司）；GST、Pgp引物[中科迈晨（北京）科技有限公司];SpectraMax i3x酶标仪（美国Molecular Devices公司）。
1.2 方法
1.2.1鼠乳腺癌MCF-7细胞传代培养及分组鼠乳腺癌MCF-7细胞复苏后接种于含体积分数10%胎牛血清RPMI 1640培养基中，37°C、体积分数5%CO2饱和湿度恒温箱中培养24h后换液，细胞生长至80% 90%单层时进行传代，取对数生长期细胞进行实验。将20只鼠乳腺癌MCF-7细胞分为对照组（普通培养液）、紫杉醇组（培养液+紫杉醇）、观察组1（培养液+葡萄籽原花青素），观察组2（培养液+葡萄籽原花青素+紫杉醇）
1.2.2 MTT法检测葡萄籽原花青素+紫杉醇对鼠乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响体积分数0.25%胰蛋白酶消化培养皿中鼠乳腺癌MCF-7细胞，接种于96孔板，分别加入葡萄籽原花青素与紫杉醇浓度为20、40、80、120、160μmol/L的RPMI 1640培养液200μL，对照组加入等量生理盐水，每组设5个平行孔，恒温箱中培养48h后每孔加入5μ/L MTT溶液20μL，继续培养4h，弃上清液，每孔加入DMSO溶解样品200μL，应用酶标仪测定490nm处吸光度值，取5个平行孔的吸光度均值为最终测定结果。计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率=(1-吸光度药物组/吸光度对照组)X100%，根据细胞生长抑制率计算盐酸小檗碱对鼠乳腺癌MCF-7细胞的半数抑制浓度(half inhibitory concentration，IC50)值，重复3次取均值。后续实验参照IC50值进行。
1.2.3细胞划痕实验检测4组鼠乳腺癌MCF-7细胞的迁移能力 使用RPMI1640培养基将4组鼠乳腺癌MCF-7细胞制备成细胞悬浮液600μL，分别接种于96孔板中（每孔约7X104个细胞），待细胞铺满板底，10μL枪头垂直皿底划1条直线，每孔划1次，PBS液洗去划落细胞，置于恒温箱中培养。分别于培养0、24h使用XSZ-N107显微镜（宁波新芝生物科技股份有限公司）拍照，应用Image J图形软件分析迁移率。迁移率=(初始边缘距离一24h边缘距离）/初始边缘距离X100%，重复3次取均值为最终结果。
1.2.4 实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)检测4组鼠乳腺癌MCF-7细胞CYP1A1、CYPlB1 mRNA表达水平 收集4组培养48h的鼠乳腺癌MCF-7细胞，应用Trizol试剂盒提取RNA，按照反转录试剂盒说明书进行操作将其反转录为cDNA，引物设计参考文献，扩增长度约650bp。CYP1A1上游引物5'-GAAGTGTATCGGTGAGACCA3’，下游引物5'-GTAGACAGAGTCTAGGCCTCA3’。CYP1B1上游引物5'-TCACTTGCTTTTCTCTCTCC-3'，下游引物5'-AATTTCAGCTTGCCTCTTG-3'。PCR扩增反应条件：94℃,5min；94℃,45s,55℃,45s,72℃,1min,30个循环；72℃10min。
1.3统计学处理应用SPSS21.0软件进行统计分析，计量资料以均数士标准差G±d表示，比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验，检验水准a=0.05。
2结果
2.1MTT法检测葡萄籽原花青素与紫杉醇联合用药对鼠乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响MTT检测结果显示，葡萄籽原花青素与紫杉醇联合用药对鼠乳腺癌MCF-7细胞具有明显增殖抑制作用，且在一定范围内其抑制作用随葡萄籽原花青素与紫杉醇浓度增加而增强，IC50值为（106±17)pmol/L。见图1。
葡萄籽原花青素与紫杉醇联合用药对人乳腺癌ＭＣＦ－７细胞增殖抑制作用图
2.2葡萄籽原花青素与紫杉醇联合用药对鼠乳腺癌MCF-7细胞迁移能力的影响 鼠乳腺癌MCF-7细胞迁移率在观察组1[(45.50±4.30)%]和观察组2[(37.50±3.43)%]均低于对照组[(84.60±6.88)%],且观察组2低于观察组1（f=3.870 P=0.030)。
2.34组鼠乳腺癌MCF-7细胞GST、Pgp mRNA表达量比较 qRT-PCR检测结果显示，观察组1和观察组2的GST mRNA、Pgp mRNA表达量均低于对照组(P<0.05)；观察组2 的GST mRNA和Pgp mRNA表达量均低于观察组1（P<0.05),见表1。
表1 4组鼠乳腺癌MCF-7细胞GST及Pgp mRNA表达量比较
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3讨论
研究结果显示，葡萄籽原花青素不仅有治疗肠道感染、调节免疫、降低血脂的作用，还可通过诱导肿瘤细胞凋亡、调控肿瘤细胞耐药等多种方式发挥抗肿瘤作用[3]。研究结果显示[4]，近年来的研究表明GSPE能抑制多种肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡[5]。经实验研究发现GSPE使耐阿霉素的MCF-7 ADR细胞的谷胱甘肽巯基转移酶（GST）表达下降却对拓扑异构酶（topoismerase,Topo）表达无相关影响,许多研究者做了大量的实验发现GSPE是通过抑制P-糖蛋白（P-glucoprotein,Pgp）的表达诱导耐药株MCF-7 ADR 细胞凋亡来发挥抑癌作用[6]。同时可通过抑制基质金属蛋白酶(matrixmetall oproteinase，MMP)-1、MMP-2和MMP-9的表达来抑制乳腺癌MCF-7细胞的迁移能力。本研究结果显示，葡萄籽原花青素与紫杉醇联合用药具有明显抑制鼠乳腺癌MCF-7细胞增殖的作用，IC50值为（106±17)pmol/L;细胞划痕实验结果显示，紫杉醇组和观察组2鼠乳腺癌细胞MCF-7迁移率均低于对照组，且观察组2低于紫杉醇组，说明葡萄籽原花青素加强了紫杉醇药理效应，可抑制鼠乳腺癌MCF-7细胞迁移；qRT-PCR检测结果显示，紫杉醇组和观察组2的GST及Pgp mRNA表达量均低于对照组，且观察组2的CYP1A1和Pgp mRNA表达量低于观察组1。研究结果显示[7]，被激活的GST及Pgp可将环境中的多种有机物质如多环芳烃转化为细胞毒素或致癌物质，增加肿瘤发生风险，GST参与多环芳烃受体被激活后的通路调节，通过异二聚效应结合芳烃受体核转运蛋白进而激活癌基因。Pgp主要参与前致癌物代谢，与多种肿瘤发生密切相关。黄秉一[8]等研究结果显示，乳腺癌组织中GST水平高于癌旁组织，其参与17-雌二醇的羟化作用。Pgp可与DNA中的嘌昤反应形成无嘌昤位点，引起DNA发生突变，与多种肿瘤发生密切相关。本研究结果提示，葡萄籽原花青素与紫杉醇联合用药具有抑制鼠乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移的作用，其机制可能与抑制GST及Pgp mRNA表达量有关。
参考文献
[1]丁晓旭,尹洋,崔相国,王萌萌,陈瑜,徐胜群,杨怀安.原花青素对喉癌TU686细胞增殖、凋亡的影响[J].解剖科学进展,2018,24(06):584-587.
[2]许洋. 原花青素在肺癌放疗中的双向作用及机制研究[D].中国人民解放军海军军医大学,2018.
[3]庞海杰. 葡萄籽原花青素调控miR-27a、let-7a对胰腺癌细胞抑制作用的研究[D].蚌埠医学院,2016.
[4]朱月,张海平+,侯亚男,安建辉,封晓茹,温馨亚,李腾,孙爱东.黑果腺肋花楸原花青素的纯化及表儿茶素和原花青素B_2含量测定[J].食品工业科技,2017,38(19):240-244.
[5]杨微,贺宝霞,张斌.松树皮原花青素对乳腺癌细胞增殖和转移作用[J].中国现代中药,2017,19(06):775-778.
[6]吕程程. 葡萄籽原花青素对结肠癌细胞的抑制作用及其机制的研究[D].北京交通大学,2017.
[7]王海,连燕娜,高丽萍.低聚葡萄籽原花青素联合顺铂对A549细胞增殖及细胞周期的影响[J].食品科学,2017,38(07):213-218.
[8]黄秉一,徐朝军,宋岚.原花青素促进三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的作用机制研究[J].湖南中医药大学学报,2017,37(11):1196-1199.
论文作者:唐贞妮
论文发表刊物:《医师在线》2019年22期
论文发表时间:2020/1/9
标签：花青素论文; 紫杉醇论文; 乳腺癌论文; 细胞论文; 葡萄籽论文; 抑制论文; 培养液论文; 《医师在线》2019年22期论文;