林文[1]2003年在《洛伐他汀高产融合子的筛选及其发酵条件的优化》文中提出洛伐他汀(Lovastatin)是一种来源于微生物的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，是一类高效、安全、低毒的治疗高胆固醇症的药物，其主要产生菌为土曲霉(Aspergillus terreus)和红曲霉(Monascus spp.)。 为获得高产洛伐他汀的红曲霉菌株，本文将高产洛伐他汀的土曲霉Aspergillus terreus CA99与低产洛伐他汀的红曲霉Monascus anka M—3进行原生质体融合。在363株融合子中筛选得到19株发酵单位高于出发菌株的高产融合子，其中有10株发酵单位的提高幅度超过60％。 经过发酵实验研究，初步确定了适合于红曲霉液体发酵产生洛伐他汀的初始pH值、碳源、氮源、混合氮源。通过正交实验确定了单一氮源培养基最佳配比和混合氮源培养基最佳配比。研究了K_2HPO_4·3H_2O和MgSO_4·7H_2O对发酵的影响。从而初步确定了红曲霉液体发酵产生洛伐他汀的培养基为：10％葡萄糖，0.5％牛肉浸膏，0.25％(NH_4)_2SO_4，2％蕃茄酱，0.1％MgSO_4·7H_2O，0.1％CaCO_3，pH6.5。出发菌株在此条件下的发酵单位为796μg／ml，融合子在此条件下发酵单位为1216μg／ml。
李亮[2]2016年在《高产洛伐他汀红曲菌株的选育及发酵条件研究》文中认为近年来,随着生活条件的提高,患有心血管疾病的人越来越多,洛伐他汀作为世界公认的治疗心血管疾病的理想药剂,需求量日益增大,但生产过程中的产量低、周期长、成本高等问题限制了红曲洛伐他汀的实际应用。因此,本文对福建古田红曲米中分离得到的产洛伐他汀红曲菌株进行传统诱变及基因组重排育种,获得洛伐他汀高产菌株后,研究其固、液态发酵工艺条件,并初步探讨了固、液态发酵产物中洛伐他汀的分离方法,主要研究结果如下:1、采用单孢子分离法从红曲米中筛选得到产洛伐他汀的红曲菌株SH2-7,结合形态学观察与ITS序列分析,鉴定其为紫色红曲霉(Monascuspurpureus);通过孢子悬液的紫外诱变和微波诱变,获得5株正突变菌株:4-4、5-5、W2、W42、W44,作为基因组重排的初始亲本库。2、红曲霉原生质体制备的最佳条件为:1.0%(w/v)溶壁酶,菌丝菌龄为66h,酶解时间3h,酶解温度30℃,缓冲液为pH6.0高渗磷酸盐缓冲液,再生培养基中渗透压稳定剂为0.6mol/LNaCl。在此条件下,红曲霉原生质体产量达2.47×107个/mL,再生率为1.45%;最佳融合条件为:将经紫外灭活120s和微波灭活300s的原生质体相融合,在30%PEG,0.03mol/LCa2+,30℃条件下融合12min,原生质体融合率可达1.95%。3、以突变菌株4-4、5-5、W2、W42、W44为亲本菌株进行叁轮基因组重排实验后,获得一株遗传稳定、产洛伐他汀能力较强的融合子R"-30,其洛伐他汀产量较出发菌株提高了 52%。其液态发酵最适条件为:甘油3%,黄豆粉1.5%,ZnS04-7H20 0.66%,KH2P04 0.017%,MgS04-7H20 0.15%,pH5,装液量50mL/250mL,转速150r/min,温度30℃,接种龄64h,接种量8%,发酵12d时洛伐他汀产量达615.3mg/L;固态发酵最适条件为:基质初始含水率35%,装米量400g/料层厚度1.1cm,接种量8%,以大米为基础培养基,添加甘油5%,蛋白胨1%,FeSO4·7H2O0.2%,MgSO4·7H2O0.1%,发酵16d时洛伐他汀产量达 10.05g/kg。4、选用不同极性的有机溶剂进行梯度洗脱,先后经硅胶柱和LH20柱层析分离,分别对液态和固态发酵产物中洛伐他汀进行分离,分离后液态发酵:洛伐他汀纯度达93%,收率达45%;固态发酵:洛伐他汀纯度达70%,收率达55%。
李滔滔[3]2013年在《高产洛伐他汀红曲霉菌诱变育种及其在酱油废水中的应用》文中指出自从发现红色红曲霉菌（M.ruber）产生强降胆固醇物质洛伐他汀之后，国内外学者掀起了降脂红曲霉菌的研究热潮。目前洛伐他汀的研究主要集中在洛伐他汀的合成基因、发酵工艺的优化以及高产菌种选育等方面。很少涉及有关发酵基质替代方面的研究，酱油废水中含有丰富的氮源，能被微生物充分利用。因此，利用酱油废水生产洛伐他汀具有一定的社会与经济意义。本研究主要通过氯化锂诱变筛选高产洛伐他汀的红曲霉菌株；研究此菌株高产洛伐他汀的发酵条件及其工艺参数；通过驯化此菌株研究其利用酱油废水生产洛伐他汀的影响因素。其结果如下：对实验室保存的红曲霉菌株进行氯化锂诱变，最终筛选出六株有较好正突变的菌株。其中叁株正突变株的产洛伐他汀能力大大提高，比出发菌株分别提高了214%（HW3）、239%（HW5）、169%（HW6）。菌株HW2、HW3和HW5的遗传稳定性相对较好。在驯化实验中发现，菌株HW2在酱油废水中表现较强适应能力，且生产洛伐他汀的性能较好。目前洛伐他汀含量检测的方法主要为HLPC，其检测过程复杂、耗时，不能直观的检测到高产红曲霉菌株。而红曲霉菌发酵生产洛伐他汀的过程中往往伴随红曲色素的生产。因此，研究红曲色素和洛伐他汀两者之间的相关性，能简便筛选出高产洛伐他汀的红曲霉菌。本研究结果表明，培养基中无论是碳源还是氮源，其色价与洛伐他汀产量之间具有良好的正相关性，其相关系数均达到0.91以上。通过单因素实验和正价实验获得了HW2摇瓶发酵的最佳工艺条件：转速180r/min、6%蔗糖、4%大豆粉、0.5%乙酸钠、温度28℃，最优发酵条件下洛伐他汀的产量为71.48mg/L，较初始含量（24.84mg/L）提高了288%。研究了菌株HW2以酱油废水替代基本培养基中的氮源，生产洛伐他汀的发酵因素的影响。以添加质量分数为6%蔗糖的碳源，生产洛伐他汀的量较高；酱油废水的保存方式和时间对洛伐他汀的合成也有较大影响，以4℃中，时间不超过1.5月的酱油废水生产洛伐他汀的量最好。
林晓波[4]2007年在《洛伐他汀产生菌的原生质体融合育种》文中指出洛伐他汀(lavostatin)是HMG- CoA(3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A)还原酶抑制剂(HMG- CoA -RI)类微生物药物,它可以有效的降低冠心病和心肌梗塞的发病率和死亡率。近年来虽然有很多相关洛伐他汀(lavostatin)基因工程育种研究的报道,但是由于洛伐他汀生产菌土曲霉和红曲霉的遗传背景不清楚,在实际中都还难以应用。而原生质体融合技术有具有重组频率高、可省去遗传标记、避免基因分离、纯化、酶切和拼接操作等优点,这对遗传背景不清楚的土曲霉和红曲霉的育种来说显得格外重要。不同代谢产物产生菌的融合子,有可能将它们的部分生物基因整合在一起产生新的杂合代谢产物,达到与用基因工程方法实现组合生物合成的相同目的。洛伐他汀主要用土曲霉(aspergillus terreus)和红曲霉(monascus rubber)经深层发酵制取,红曲霉(monascus rubber)不仅产生洛伐他汀(也称莫那可林K,monacolin K),而且产生据推测为洛伐他汀生物合成的中间产物的聚酮类物质莫那可林J、L、X,这些物质都是HMG-CoA-RI类物质,具有很强的降低胆固醇、调节血脂的功能。而且红曲霉在我国有着广泛的应用,在酿造红酒、制腐乳、肉制品着色及制备中药方面的应用已有悠久的历史,其调节血脂的功能在许多国家都得到认同。由于其发酵产品可直接用作食品添加剂,因此有着更广的应用面,并且易被人们接受。同时土曲霉是现在国内生产洛伐他汀的原始出发菌,它具有优良的发酵性能、较高的洛伐他汀产生能力、成熟的发酵工艺。本项目将通过土曲霉和红曲霉原生质体融合技术,将土曲霉生产菌优良的发酵性能、较高的洛伐他汀产生能力、成熟的发酵工艺和红曲霉他汀类化合物的结构多样性、色素产生能力以及长期实践证明的安全性结合起来,选育他汀类化合物和色素高产菌株,以及全新他汀类物质的产生菌。在理论上探讨用原生质体融合技术实现组合生物合成的可能性与途径,为实际生产选育目的化合物稳定、高产菌株。在本论文中研究考察了各种细胞裂解酶和渗透压稳定剂等条件对红曲霉和土曲霉的原生质体制备、灭活及融合的影响,同时采用不同的方法对红曲霉和土曲霉的DNA进行提取纯化,探讨了提取液中不同的EDTA浓度对DNA提取和RAPD-PCR的影响,同时采用27条随机引物分别对土曲霉、红曲霉和融合子的DNA进行RAPD-PCR,扩增产物用5%的聚丙烯酰胺电泳的进行分离,并采用紫外分光光度法对土曲霉、红曲霉和融合子2的发酵液进行Lovastatin含量测定。结果表明:土曲霉和红曲霉在加石英砂混合酶体系中获得的原生质体数最多,而最适宜的渗透压稳定剂为0.6 mol/L的NaCL。红曲霉和土曲霉的原生质体分别在紫外灯(18 W)下15cm照射50 min和60oC水浴下保持40 min灭活率达到100%。最适合红曲霉和土曲霉的原生质体融合的条件为20% PEG在28oC下处理15-20 min。采用氯化苄的方法能提到完整的DNA,20mM的EDTA浓度能得到较好的DNA模板和稳定的RAPD-PCR条带,RAPD-PCR结果显示融合子2号在红曲霉和土曲霉的原生质体融合时发生基因重组,并能稳定遗传。Lovastatin在246nm波长处有最大的吸收,融合子2产洛伐他汀的能力不及由原始出发菌土曲霉但是比红曲霉的能力由了一定的提高。从而为构建一株高产量的菌株做好基础。
李桂杭[5]2008年在《洛伐他汀产生菌的选育》文中研究指明洛伐他汀(lovastatin,也称莫那可林K,monacolin K)是一种来源于微生物HMG-CoA(羟甲基戊二酰辅酶A)还原酶抑制剂,是用于治疗高胆固醇症的药物,它能阻止动脉硬化发展,减少心肌梗塞等发病的危险,因此在医学上具有重要意义。目前美国和日本等国家已开发出一系列的他汀类药物,但我国对降脂红曲霉的研究还相对落后,生产中普遍存在产量偏低、生产成本偏高等问题。究其原因,一方面是培养工艺的不足,另一方面是优良菌株的缺乏。因而进行洛伐他汀产生菌的选育具有重大意义。洛伐他汀的主要产生菌为土曲霉(Aspergillus terreus)和红曲霉(Monascusspp.)。红曲霉不仅产生洛伐他汀,而且产生monacolin J、L、X,这些物质都是HMG-CoA还原酶抑制剂,具有很强的降低胆固醇功能。而且红曲色素作为一种天然色素,在我国广泛应用于清酒、酱油、腐乳、豆酱、鱼、肉、糕点等食品的着色。同时土曲霉是现在国内生产洛伐他汀的原始出发菌,它具有优良的发酵性能、较高的洛伐他汀产生能力、成熟的发酵工艺。原生质体融合技术是现代菌种选育技术之一,它有可能实现隐性基因的重组暴露,使一些隐性基因表达或随机产生新的基因表型,且与一般基因重组方法不同,不需遗传标记,对改良生产菌株性能可能更有效。本研究将通过土曲霉和红曲霉灭活原生质体融合技术,将土曲霉生产菌优良的发酵性能、较高的洛伐他汀产生能力、成熟的发酵工艺和红曲霉他汀类化合物的结构多样性、色素产生能力以及长期实践证明的安全性结合起来,选育洛伐他汀高产菌株。研究目的将具有较高洛伐他汀产生能力的土曲霉和具有他汀类化合物结构多样性的红曲霉原生质体融合在一起使其发生基因重组,通过灭活原生质体法初步筛选融合子,再通过洛伐他汀产量测定筛选高产洛伐他汀的融合子,并对目的融合子进行传代培养以确保其遗传稳定性。研究方法对土曲霉与红曲霉的生长曲线和洛伐他汀产生曲线进行探讨,研究红曲霉色素形成的曲线;考察不同酶解时间对原生质体制备与再生的影响,确定紫外线灭活原生质体的时间;比较紫外分光光度法和高效液相色谱法测定洛伐他汀含量的差异,确定洛伐他汀的定量方法;筛选高产洛伐他汀融合子,对其进行了生长特性研究,并传代确定其遗传稳定性。研究结果1.土曲霉摇瓶培养第3天为对数生长期,第7～8天洛伐他汀增长最快;红曲霉摇瓶培养第2天为对数生长期,第5～7天洛伐他汀增长最快。红曲色素在前9天缓慢增长,到第10天开始迅速增长。2.土曲霉和红曲霉用混合酶液分别酶解5小时和3.5小时制得的原生质体较多,再生率较高,加石英砂效果更好。土曲霉和红曲霉原生质体在紫外线(30cm,20W)下分别照射5min和4min可100%灭活。3.建立了两种对洛伐他汀的定量分析方法。一是高效液相色谱法(HPLC),二是紫外分光光度法。实验表明HPLC法在0～50μg/ml浓度范围内对积分面积与洛伐他汀具有良好的线性关系,y=44813x-1330.6,R~2=1;而使用紫外分光光度法,洛伐他汀含量与OD值亦呈线性关系,y=0.0952x+0.1093,R~2=0.9773,精确度稍差,但可达到本实验的筛选目的。4.本实验在87株融合子中筛选得到27株洛伐他汀产量高于出发菌株的稳定融合子,其中有7株产量的提高幅度超过100%,并对其进行了生长特性研究。结论本实验利用灭活原生质体融合方法成功选育出洛伐他汀高产菌株,为工业上高产洛伐他汀菌株的选育提供理论依据。
刘月[6]2012年在《双亲灭活原生质体融合法选育高产Monacolin K红曲菌》文中研究指明红曲菌作为发酵食品应用菌在我国的使用已有悠久的历史了。红曲Monacolin K是胆固醇生物合成限速酶HMG-CoA还原酶的竞争性抑制剂,可有效抑制胆固醇的合成。与土曲霉同类产品(洛伐他汀)相比,红曲菌Monacolin K的产量较低,但由于红曲菌在食品方面的安全性,所以研究如何提高红曲菌Monacolin K的发酵水平具有现实意义。提高红曲菌Monacolin K的发酵水平可以通过选育高产Monacolin K的菌株与改变发酵工艺条件两种途径来实现。本课题主要采取双亲灭活原生质体融合的方法选育高产Monacolin K的红曲菌株。出发菌以发白红曲菌H2和烟色红曲菌9908作为亲本。发白红曲菌H2是经农杆菌介导转化获得有携带潮霉素抗性基因的转化子,可以甘油为原料液态发酵高产Monacolin K,但低产色素。烟色红曲菌9908可以大米为原料固态发酵产Monacolin K,且产色素较多。对其原生质体分别进行热灭活及紫外灭活,然后对灭活双亲用PEG作融合剂进行原生质体融合,从融合子中选出有潮霉素抗性的突变株,通过发酵与亲本对比,筛选得到高产Monacolin K及色素的融合子。主要研究结果:(1)烟色红曲菌9908与发白红曲菌H2的原生质体的制备与再生的最佳条件是:渗透压稳定剂为1.0 mol/L的硫酸镁溶液;最佳菌龄分别是26 h、24 h;复合酶液中的最优纤维素酶浓度为1%,最佳酶解时间分别为3.5 h、4 h;再生培养基为添加了0.6 mol/L蔗糖的PDA培养基;原生质体形成数均可达106个/mL,再生率分别达到80%、25%。融合前对原生质体进行灭活,对发白红曲菌H2采用热灭活,65℃水浴处理25 min;对烟色红曲菌9908进行紫外灭活,在15 W紫外灯10 cm处照射15 min。融合率达到5.63%。(2)用选择性培养基初筛,得到100余株融合子,再对融合子进行液态发酵复筛,得到一株利用甘油高产Monacolin K的融合子F13-2,Monacolin K产量为1752.46 mg/L,较发白红曲菌H2提高了32.98%,发酵液颜色介于两亲本之间。通过稳定性检测,发现融合子13-2的潮霉素抗性能稳定遗传,且液态发酵Monacolin K水平稳定性良好。(3)通过对融合子的菌落形态、发酵液颜色、孢子及菌丝体形态的观察,发现融合子13-2是以发白红曲菌H2为主要亲本获得的,且包含了亲本烟色红曲菌9908色素产量高的优良性状。对亲本及融合子进行PCR验证,从分子水平验证了潮霉素抗性基因已成功并稳定地整合到融合子13-2的染色体DNA上。(4)对高产融合子13-2进行了发酵试验。与原亲本发白红曲菌H2一样,甘油仍是最佳的碳源,其对发酵高产Monacolin K具有重要影响。发酵液中的初始甘油浓度为10%时,最有利于Monacolin K的产出。融合子13-2较两亲本的甘油利用率都高,达到93.8%。
吴学倩[7]2012年在《高产MonacolinK功能红曲的原生质体诱变与融合选育及其发酵条件的优化》文中研究表明功能红曲中MonacolinK是天然降脂药物，其对高血脂患者具有较好的疗效。本试验以产MonacolinK较高的Q-11为原始菌株，对其采先原生质体紫外诱变再融合的双重技术，通过菌种形态初筛和HPLC检测复筛及稳定性试验，获得3株高产MonacolinK且稳定的突变株：（1）试验对原生质体形成与再生的条件、紫外诱变选育及原生质体融合进行了研究，确定了原生质体酶解最佳条件为：菌龄36h，酶解温度28℃，酶解时间2.5-3h，酶系统（0.3%溶菌酶+0.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶）。红曲霉原生质体紫外诱变最适条件：25W紫外灯下20cm处照射80S-100S，致死率达88.7%-91%；并获得稳定高产MonacolinK菌株X-60，比原始菌株提高30%。菌株X-60与Q-11原生质体的融合率为3.56%。最终融合获得比原生产菌株Q-11的MonacolinK产量更高的五株突变株：R-22、R-101、R-39、R-51、R-58，其中R-39提高最多，分别比Q-11和X-60提高120%、69.2%；其次为R-58，分别比Q-11和X-60提高86%、43.1%。（2）将筛选得到的高产突变株R-22、R-101、R-39、R-51、R-58分别进行遗传稳定性试验。结果表明，融合后最高产的菌株R-39变异系数达18.54%，遗传稳定性较差；而R-22、R-51、R-58的变异系数均小于1%，具有稳定的遗传性，无明显的回复突变。其中R-58的MonacolinK含量最高，平均值达2.1396mg/g，故选择R-58进行后续发酵试验。将突变株R-58与原生产菌株Q-11进行比较后发现，菌株R-58和Q-11在不同的培养方式下都呈现出差异较大的现象。以红曲粉为原料，采用超声波法提取红曲中MonacolinK，并利用高效液相色谱法（HPLC）定量检测其含量。在单因素试验基础上，利用Box-Benhnken中心组合设计和响应面分析法，确定了红曲中MonacolinK提取的最佳工艺条件：超声功率68.02%、超声时间28.67min、料液比(m/v)1:5.45。在最佳工艺条件下，红曲中MonacolinK提取含量预测值达300.56ug/g，验证值为296.40ug/g。对红曲霉菌株R-58产MonacolinK进行固态发酵培养基各成分及发酵时间的优化，经单因素试验可知最佳基质初始水含量为35%，最佳碳源是葡萄糖，最优氮源为大豆蛋白粉，最佳发酵时间为15d。但发现ZnSO4并不是R-58发酵过程中所必须的，故选择不添加锌。经过正交设计得到菌株R-58固态发酵产MonacolinK最佳培养基：葡萄糖5%，大豆蛋白粉4%，MgSO40.5%，KH2PO40.3%。在最优条件下验证结果为MonacolinK含量最高达3.206mg/g，是优化前的1.5倍。添加诱导物活性酵母可促进MonacolinK形成，单因素试验表明，当酵母添加时间为红曲霉菌发酵培养第2天，酵母添加量1ml，酵母菌龄60h时，产物MonacolinK含量最高。乙醇、青霉素、超声波在一定程度上可改善细胞通透性，对产物MonacolinK含量产生较大影响。试验结果表明，当乙醇浓度为2.5%时MonacolinK含量最高；青霉素添加量为4万单位，添加时间为红曲霉菌发酵培养第2d时，可对红曲霉的细胞通透性产生最优的影响；超声波处理时间为10min，超声频率设定为40%时能更好的调控红曲霉菌的代谢能力，使MonacolinK含量最高。
王璐[8]2011年在《农杆菌介导转化及原生质体融合法选育红曲菌Monacolin K高产株》文中提出红曲菌发酵产物中含有一种胆固醇合成抑制剂-Monacolin K,它与土曲霉中发现的lovastatin系同一物质,都具有抑制生物体内胆固醇合成途径中关键酶HMG-CoA还原酶活性的作用,从而调节生物体内异常血脂,由于历史上红曲产品具有可直接食用的特性,因此含Monacolin K的红曲产品更为消费者接受和喜爱。叁十年多来,已经发现紫色红曲菌(Monascus purpureus)、发白红曲菌(M. albidus)、丛毛红曲菌(M. pilosus)等可产生Monacolin K,但不同菌种产Monacolin K的性能不同。在长期的研究或生产过程中菌种由于不断的移接传代,而导致生产性能的退化,且与土曲霉发酵产Lovstatin的产率相比,红曲菌Monacolin K产率较低,因此需要持续不断地进行菌种选育获得高产Monacolin K的红曲菌株。为了解红曲菌基因组中Monacolin K合成相关基因,为红曲菌遗传改造奠定基础,并找出更为简便的高产Monacolin K红曲菌种的筛选方法,将分子克隆与原生质体融合育种技术相结合也许是一条可行的途径。本课题的目的是建立根癌农杆菌介导转化红曲菌的方法,将携带遗传标记的T-DNA插入红曲菌基因组中,改变红曲菌遗传信息的排列,影响其生长和代谢,筛选高产Monacolin K突变转化子;从高产Monacolin K红曲菌突变株基因组中,根据已知的T-DNA两端保守序列,扩增出T-DNA插入位点侧翼序列,从而寻找影响Monacolin K合成的带T-DNA标签的突变基因,为研究红曲菌Monacolin K合成功能基因组及代谢调控提供基础信息;通过原生质体融合的方式选育红曲菌Monacolin K高产株并研究适合于遗传改造变异株高产Monacolin K的发酵工艺,为红曲菌工业化生产Monacolin K打下基础。主要研究结果如下:(1)构建了含有gpdA启动子、潮霉素抗性基因hph和trpC终止子的双元载体pCAMBIA 3300-gpdA-hph-trpC并转入根癌农杆菌GV3101;利用根癌农杆菌介导转化技术成功将潮霉素抗性基因转入发白红曲菌(M. albidus)9901,实验优化了抗生素浓度,发白红曲菌孢子浓度,根癌农杆菌细胞密度,共培养温度和时间,以及乙酰丁香酮浓度等转化条件,最终转化效率可达520个转化子/10~6个红曲孢子。对转化子进行潮霉素抗性基因PCR鉴定,结果进一步证实外源T-DNA已整合至转化子的染色体基因组中。在诸多转化子中,通过发酵实验筛选得到了一株比出发菌株发白红曲菌9901高产Monacolin K的T-DNA插入突变转化子H1。采用反向PCR方法对发白红曲菌转化子H1基因组T-DNA插入位点侧翼序列进行克隆,获得了一段0.88 kb的DNA片段,暂命名为mkWL,对DNA片段mkWL进行测序,通过与NCBI公布的丛毛红曲菌Monacolin K合成基因簇比对分析,发现与其中mkH基因(1.46 kb)部分基因序列同源性为97%。由此推断基因mkWL包含发白红曲菌Monacolin K合成关联基因。(2)对烟色红曲菌(M. fumeus) 9908和发白红曲菌转化子H1原生质体制备与再生的条件进行研究,考察了菌龄、渗透压稳定剂、裂解酶组合、酶解时间和再生培养基等条件对这两株红曲菌原生质体制备和再生的影响。将携带潮霉素抗性的转化子H1的原生质体灭活后,与烟色红曲菌9908原生质体融合,以潮霉素抗性作为筛选标记,得到了多株融合子,并对融合子固态发酵产Monacolin K能力进行考察,筛选得到了固态发酵高产Monacolin K的红曲菌融合子HH1,此菌株Monacolin K的产量较亲本烟色红曲菌9908和转化子H1分别提高了404%和27%。(3)对影响融合子HH1固态发酵产Monacolin K的因素进行了单因素考察,根据优化得到的发酵条件,融合子HH1以小米为原料固态发酵20 d后,Monacolin K的产量可达17.50 mg/g。采用Box-Behnken响应面分析法,进一步研究了拌料水加量、拌料水pH和接种量这叁个因素对Monacolin K产量的影响,并建立了模型,模型预测的理论值与实验所得的实际值无显着性差异,说明此模型能够较好的模拟发酵实验。本研究克隆得到了发白红曲菌Monacolin K合成相关基因的DNA片段mkWL,并采用根癌农杆菌介导转化和原生质体融合技术筛选到红曲菌Monacolin K高产株,为发白红曲菌基因遗传改造及Monacolin K工业化生产奠定良好基础。
李桂杭, 朱碧云, 李浩明[9]2012年在《土曲霉与红曲霉双灭活原生质体融合选育洛伐他汀高产菌株》文中研究表明研究原生质体融合技术选育洛伐他汀高产菌株的方法。土曲霉(Aspergillus terreus)和红曲霉(Monascus anka)用混合酶液(体积分数0.5%溶菌酶,0.3%纤维素酶,0.3%蜗牛酶)分别酶解5.0h和3.5h制备原生质体,土曲霉原生质体和红曲霉原生质体在紫外线(20 W,30cm)下分别照射5min和4min灭活,灭活后混合并用PEG(体积分数30%PEG,0.05mol/LCaCl2,0.05mol/L甘氨酸)介导融合。在187株融合子中筛选得到27株洛伐他汀产量高于红曲霉出发菌株的融合子,其中有7株的洛伐他汀产量是出发菌的2倍以上。双灭活原生质体融合方法成功选育出红曲霉洛伐他汀高产菌株。
魏培莲[10]2007年在《土曲霉固态发酵产洛伐他汀的关键技术和新工艺探索》文中研究表明洛伐他汀(Lovastatin)是一种重要的降胆固醇药物,目前主要采用土曲霉(Aspergillus terreus)液体深层发酵的方法生产。根据土曲霉的菌丝生长特性及洛伐他汀为胞内产物的特点,本文提出了采用土曲霉固态发酵生产洛伐他汀,并系统地研究了其中的关键问题。在固态发酵中,准确测定生物量是一项非常重要但又尚未很好解决的问题。本文对叁种细胞组分(核酸、麦角固醇、氨基葡萄糖)作为生物量测定指标的方法进行了比较研究,发现土曲霉菌体中的核酸、麦角固醇和氨基葡萄糖含量都分别与菌体量存在较好的正线性关系。但菌体中麦角固醇含量受培养时间和培养基成分的影响较大;氨基葡萄糖量虽不受培养时间的影响,但与培养基成分的关系密切。因此上述二种细胞组分都不是测定生物量的最优选择。菌体中的核酸含量基本不受培养时间和培养基的影响,且测定方法简单,适合于土曲霉和红曲霉固态发酵时生物量的精确测定。考察了A.terreus ZJU-510菌株的生理和菌丝生长特性。土曲霉具有一定的淀粉酶活和纤维素酶活,适合在富含淀粉和纤维素的固态基质上生长,但在不同培养基上的生长形态差异较大:在马铃薯琼脂培养基上,菌丝的生长较弱,容易产生孢子;在查氏培养基和麦芽汁培养基上,菌丝生长较好而产孢子较少;在大米基质上,土曲霉较容易产孢子,菌丝生长较差,而且底物的利用不完全。由于洛伐他汀是菌丝体内的产物,固态发酵中控制孢子生成是需要注意的重要问题。在叁角瓶中系统地优化了土曲霉固态发酵产洛伐他汀的条件,通过单因素实验,得到了土曲霉固态发酵产洛伐他汀的较优培养基组成和发酵条件,采用二段固体发酵工艺(先32℃培养3天,然后28℃培养8天),洛伐他汀的固态发酵产量达到了3.36mg/g干曲。考察了固态发酵过程中产物、基质含水量和pH值等主要发酵参数的变化规律,研究了lovastatin合成的动力学,发现在固态发酵的1-5天内,菌丝量和洛伐他汀的含量快速增加,以后则增加缓慢,至11天达到最高值。说明洛伐他汀虽然属于次级代谢产物,但与菌丝生长仍有一定的相关性。进一步利用响应面优化法对固态发酵生成洛伐他汀的培养基和培养条件进行了系统优化,所获得的最佳发酵条件为:在大米培养基中添加乙酸钠0.54%、葡萄糖3.36%、蛋白胨1.5%,基质初始含水量为45%,接种量为25%。在此条件下洛伐他汀产量为3.99 mg/g干曲,比未优化前的产量3.36 mg/g提高了18.8%。在小型自制固态发酵罐中,考察了基质装量、翻料操作以及通气情况对发酵的影响,并测定了发酵过程中曲料温度变化曲线。比较了叁角瓶培养、浅盘培养和小型发酵罐培养的结果进行了比较,结果表明,尽管浅盘培养和发酵罐培养的产量都略低于叁角瓶培养,但由于小型发酵罐的通气性优于浅盘培养,洛伐他汀的产量也较高。建立了能够较好反应土曲霉菌体生长、底物消耗和洛伐他汀合成的动力学模型,从而为进一步的固体发酵放大研究奠定了良好的基础。在上述研究工作中,发现土曲霉固态发酵的洛伐他汀产量高于红曲霉,但由于淀粉酶活力较弱,影响了其对固态底物的利用,使菌丝生长较差,容易产生孢子。红曲霉菌株本身具有合成洛伐他汀的能力,而且产淀粉酶活力也较高。研究表明,A terreusZJU-510和M rubber M7双菌株混合固态发酵能够达到优势互补,M rubber M7菌株的高淀粉酶活可以有效地弥补A terreus ZJU-510的不足,促进A.terreus ZJU-510菌株在固态基质中生长,从而提高固态基质中的菌体生物量和洛伐他汀的产量。利用基因组重排技术对土曲霉洛伐他汀的高产菌株进行了选育。利用洛伐他汀浓度梯度平板和淀粉琼脂平板,筛选耐洛伐他汀和高产淀粉酶的突变株,并通过摇瓶液体培养验证洛伐他汀产量。采用UV+LiCl和DES诱变育种,筛选出了六株菌株作为出发菌,然后经过叁轮基因组重排育种,获得了一株高产突变株GS-185,在优化的固态发酵条件下,该菌株的洛伐他汀产量达到了8.17mg/g干曲,约是原始出发菌株的产量3.99mg/g的2倍。
参考文献：
[1]. 洛伐他汀高产融合子的筛选及其发酵条件的优化[D]. 林文. 中国农业大学. 2003
[2]. 高产洛伐他汀红曲菌株的选育及发酵条件研究[D]. 李亮. 福州大学. 2016
[3]. 高产洛伐他汀红曲霉菌诱变育种及其在酱油废水中的应用[D]. 李滔滔. 湖南工业大学. 2013
[4]. 洛伐他汀产生菌的原生质体融合育种[D]. 林晓波. 广东药学院. 2007
[5]. 洛伐他汀产生菌的选育[D]. 李桂杭. 广东药学院. 2008
[6]. 双亲灭活原生质体融合法选育高产Monacolin K红曲菌[D]. 刘月. 江南大学. 2012
[7]. 高产MonacolinK功能红曲的原生质体诱变与融合选育及其发酵条件的优化[D]. 吴学倩. 武汉工业学院. 2012
[8]. 农杆菌介导转化及原生质体融合法选育红曲菌Monacolin K高产株[D]. 王璐. 江南大学. 2011
[9]. 土曲霉与红曲霉双灭活原生质体融合选育洛伐他汀高产菌株[J]. 李桂杭, 朱碧云, 李浩明. 食品与生物技术学报. 2012
[10]. 土曲霉固态发酵产洛伐他汀的关键技术和新工艺探索[D]. 魏培莲. 浙江大学. 2007
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