吕永杰[1]1995年在《人支气管上皮细胞癌变早期的分子细胞遗传学异常变化的研究》文中研究说明肺癌是人类高发恶性肿瘤，其发病率和死亡率都呈逐年上升趋势，深入研究肺癌发生的分子细胞遗传学机理，为肺癌的预防、早期诊断和治疗提供理论依据，有助于从根本上控制肺癌的发生和发展。 NSCLC主要由支气管上皮细胞恶变而来，占肺癌病例的多数。为了研究肺癌发生早期阶段分子细胞遗传学改变，我室建立了良好的人支气管上皮和肺癌细胞培养体系，并应用含有SV40早期区的重组质粒转染入支气管上皮细胞，建成4例永生化细胞系。本文以FISH为主要技术，配合Southern、Northern、免疫细胞及组织化学染色等方法，对1例人支气管上皮细胞永生化细胞系癌变早期进程中的一些分子细胞生物学政变进行了研究，同时对另外3例支气管上皮细胞系，两例NSCLC细胞系和十几例临床NSCLC及其癌旁支气管上皮标本进行了研究。结果如下： 1．在3例人支气管上皮细胞系M、C45和TR中发现c-myc易位激活，均为t(14；8)(q32；q23)。另外在1例肺腺癌细胞系GLC-82中发现o-myc易位到22号染色体长臂上。在临床NSCLC标本中，我们也观察到两例c-myc易位，一例c-myc易位到14q上IgH位点附近，另一例易位到22q上。RNA原位杂交结果和免疫化学染色结果均显示c-myc易位的各例中有c-myc表达增高，即易位激活了c-myc的表达。由此看来c-myc易位激活在NSCLC中并不罕见，只是应用以往手段不易发现而已。Southern结果表明，发生易位各例均未见带型政变。另外，在一例支气管上皮细胞系和两例临床NSCLC标本中存在c-myc扩增，说明在肺癌中c-myc易位和扩增对c-myc的激活均起作用。 2．3例支气管上皮细胞系，两例NSCLC细胞系及用N-myc杂交的7例临床NSCLC标本的3例(其中1例包括癌旁支气管上皮细胞)中，发现涉及2q24以外区域遗传物质的丢失，说明2q24以外区域遗传物质的丢失在NSCLC中高频发生，并且是早期现象，提示2q上存在一个或几个抑癌基因，其丢失在NSCLC发生中起重要作用。 3．在3例支气管上皮细胞系(Y和C45)、两例NSCLC细胞系和一例临床NSCLC标本(LC13)中发现涉及17q的改变，并且有17q改变的标本同时存在c-erbB-2表达增高，说明这些涉及17q的染色体改变可能与c-erbb-2激活有关。在我们研究的各例中均未见N-myc基因扩增。 4．涉及18q的易位在人支气管上皮细胞系M的晚期代数出现，与M系晚期代数细胞对PDD诱导凋亡抗性增高相对应。另外，在支气管上皮细胞系Y和两例临床NSCLC标本中也发现涉及18q的易位。支气管上皮细胞系M中bclamRNA和蛋白表达晚期代数细胞明显高于早期代效。我们的研究显示，NSCLC中存在涉及18q的染色体易位，可能与bcla的易位激活有关，提示bcla表达升高在支气管上皮细胞癌变过程中也起了一定作用。 5．3p上遗传物质的丢失一直被认为是肺癌的特征。在我们用3号染色体着丝粒研究的4例支气管上皮细胞系和12例临床NSCLC标本中均发现高频率的3号染色体短臂上
刘勇[2]2002年在《肺癌染色体和DNA甲基化异常改变及其诊断价值的研究》文中研究说明肺癌是人类高发恶性肿瘤，其死亡率在我国的肿瘤性疾病中为第二位；在城市其死亡率为第一位；而且肺癌的发病率在我国一直呈上升趋势，严重危害人类健康。降低肺癌死亡率的策略无非在于三个方面：预防、早期诊断和完善治疗方案。目前从国内外研究来看，早期诊断，尤其是分子细胞学诊断可能是最有效的途径之一。因此，寻找有效的早诊、分期分型以及预后的分子生物学标志物和建立有效的辅助性分子诊断方法，有着重要的理论意义和光明的应用前景。同时，深入研究肺癌发生的分子细胞遗传学、尤其是癌前病变的分子机理，不仅可为肺癌的预防、早诊和治疗以及预后提供理论依据，而且有利于从根本上控制肺癌这一恶性肿瘤。 为了筛选较好的分子标记，我们从肺癌分子细胞遗传学入手，利用原位杂交技术，分析肺癌病人痰细胞中细胞遗传学改变；利用原位杂交技术和频谱式染色体核型分析法，检测了永生化人支气管上皮细胞系M、Y中细胞遗传学异常改变。从肺癌遗传外改变入手，利用甲基化特异性PCR技术检测肺癌病人肿瘤、血浆和痰标本中抑癌基因异常甲基化改变；利用全基因组甲基化检测方法扫描了肺癌组织中基因组范围内DNA甲基化的改变情况。结果发现：一、痰细胞标本中染色体数目异常和FHIT基因缺失1、系统分析了1，3，6，7，8，9，10，11，12，15，17，18，X，Y染色体在肺癌病人痰细胞中染色体异常改变，发现染色体拷贝数的异常改变(增加和／或减少)是肺癌中常见的现象，且具有高度复杂性和随机性。从整体上看，1，3，7，8，X等染色体以拷贝数增高为主；9，15、17以拷贝数减少第三军医大学博士研究生论文 肺癌染色体和DNA甲基化异常改变及其诊断价值的研究 为主；6，10，11，12，18，Y等染色体增加与减少共存，没有明显的差 异。此外，同一病例痰细胞中染色体数目异常通常涉及多条染色体，且 同一条染色体数目改变不止一种类型，说明在肺癌发生过程中整个染色 体水平上的调控机制出现紊乱。2、就肺癌痰细胞中染色体数目异常（增加和／或减少）作为肺癌诊断的辅助 指标来看，其特异性和敏感性均明显高于传统的疾细胞学诊断。17，18 号染色体对肿瘤检出率最高O．7O，83、9O），其次是 7，8，9，10，11， 12和X染色体；同时使用任意两条染色体组合对肺癌的检出率可达80％ 以上，说明染色体数目异常（增加或减少）是肺癌辅助诊断较好的指标。3、FHIT基因外显子1，5，6．7在痰细胞中的缺失率均较高，FHIT基因外 显子缺失主要表现为相对缺失，至少一个外显子发生缺失的比例为 76．0％＊），表明FHH基因外显子缺失是其在肺癌中失活的机制之一， 并可作为肺癌诊断的指标。4、我们建立的改良的痰细胞FISH标本制备和分析方法，降低了背景的干扰， 且探针更易于穿透细胞，其杂交信号检测的准确度和信号的强度均较高。 本研究利用多个染色体特异性探针较系统地分析了肺癌痰标本中染色体异常改变，在国内外尚未见相关报道。我们的研究表明染色体拷贝数的异常改变 市癌病人痰标本中常见的现象，是肺癌辅助诊断较好的指标之一；同时，改良的疾细胞FISH标本制备和分析方法为痰细胞分子遗传学研究奠定了基础。二、永生化人支气管上皮细胞系M、Y细胞中分子细胞遗传学异常改变 永生化的人支气管上皮细胞是目前研究肺癌癌变过程中分子遗传学机理的重要体外模型之一。在本研究中，我们分析了处于癌前病变阶段的人支 8 第三军医大学博士研究生论文 肺癌染色体和DNA甲基化异常改变及其诊断价值的研究 气管上皮细胞系M、Y细胞在永生化过程中的分子细胞遗传学异常改变。 1、不同代龄M、Y细胞中3p异常改变的FISH分析： l）M细胞中，3plZ，3pl3，3pl4，3pZI，3p22－23和3p24主要表现为缺 失。在早代龄细胞中有一定比例的特异性缺失和纯合缺失：随着细胞 代龄的增加，主要表现为随3号染色体拷贝数的增加而发生特异性丢 失。3pl4和3p24在早代龄细胞门 代）中有明显易位；3p25和3p26 在早、中、晚代龄细胞中，主要表现为易位；在晚代龄细胞中（180 代），90％以上的细胞具有这一改变。利用染色体着丝粒探针和染色体 涂染探针对3p25上6断裂点进行了分析，结果发现3p25易位到染色 体11pl415 之间。 2）Y细胞中，3plZ、3p13、3pl4、3pZI、3p22－23和3p24、3p25、3p26 在早代龄中均仅有一个拷贝，在体外培养进程中，3plZ、3pl3、3pl4、 3pZI、3p22毛3、3p24主要随着3号染色体数目的增加拷贝数相应增 加，但没有发生明显的相对丢失。3p25、3p26在晚代细胞中具有较 高易位率产70叨。 2、利用SKY进一步分析了39代龄Y细胞分子细胞遗传学改变情况，发 现在Y细胞中存在一系列染色体缺失和?
董向阳[3]1998年在《人肺癌分子细胞遗传学异常改变的研究》文中提出肺癌是人类高发恶性肿瘤，其发病率和死亡率都呈逐年上升的趋势，严重危害人类健康，深入研究肺癌发生的分子细胞遗传学机理，可以为肺癌的预防、早期诊断和治疗提供理论依据，有利于从根本上控制肺癌这一恶性肿瘤的发生和发展。 本文以双色荧光原位杂交(Dual-color FISH)和比较基因组杂交(CGH)技术为主，配合Western Blot、PCR、免疫组织化学染色等技术，对人支气管上皮细胞永生化细胞系M和临床肺癌、癌旁支气管上皮、支气管镜刷片／活检标本细胞中的遗传学改变进行了研究。结果如下： 1．对细胞系M和10例临床肺癌标本的CGH结果表明，肺癌中发生的染色体改变主要是1q，3q，7p，8q，17q，20q等的扩增和3p，4q，5q，8p，10q等的丢失。这些染色体不稳定性改变在肺癌标本中的发生率很高，可能会影响到位于该区域的癌基因或抑癌基因的异常表达，从而促进肿瘤的发生和发展。 2．用双色荧光原杂交技术发现，细胞系M中，P1 1063(p15／p16)基因随着细胞的传代逐渐发生丢失，Western Blot和免疫组织化学显示P16蛋白的表达水平也逐渐下降，而CDK4、Cyclin D1、RB三个相关蛋白的表达没有明显变化，说明p16基因功能的失活是使细胞系M发生恶性转化的重要原因之一。 3．对21例肺癌患者的41份肺癌癌组织和癌旁支气管上皮细胞的短期培养标本中9p21(P1 1063)和3p(CTNNB1)丢失的研究发现，无论是在癌组织还是在癌旁支气管细胞中9p21(P1 1063)的丢失率(分别为80.95％和30％)都比3p(CTNNB1)的丢失率(分别为66.67％和15％)要高，说明在肺癌中，9p21(P1 1063)的丢失比3p(CTNNB1)的丢失更为重要。在14例支气管镜刷片或活检标本中，病理或细胞学诊断为肿瘤的有7例，其中4例(57.14％)同时有9p(p15／p16)和3p(CTNNB1)的丢失，另2例分别有9p(p15／p16)或3p(CTNNB1)的丢失；未见有癌细胞的7例中，有1例发现有9p(p15／p16)的丢失，可见二者的丢失与细胞学／病理诊断结果有很好的相关性，提示9p~-和3p~-能对肺癌的早期诊断有重要参考价值。 4．对16例肺癌组织印片标本中1、3、6、7、8、9、11、12、17、18、X、Y12个染色体拷贝数改变的研究发现，虽然肺癌中染色体的改变具有高度的复杂性和随机性，但染色体7、8、12、17、18、X以拷贝数增多为主，染色体3、9、Y以拷贝数减少为主，它们在肺癌发生及早期诊断上的意义有待进一步研究。 肺癌的发生和发展是一个涉及癌基因激活和抑癌基因失活的多阶段多步骤的过程，在这一过程中会出现大量的分子细胞遗传学改变，有些可能在肺癌的发生发展中起了关键的作用，有些可能只是伴随现象。本研究表明P16蛋白表达水平下降在肺癌发生中起着重要的作用。
袁素波[4]1999年在《环磷酰胺、噻替哌诱导人支气管上皮细胞致癌性转化及相关机制的研究》文中研究表明抗癌烷化剂是人类与肿瘤斗争的有力武器。在获得药物正性抗癌效应的同时,化疗病人也承负了抗肿瘤药物尤其是抗肿瘤烷化剂的遗传毒作用所带来的严重后果……二次肿瘤的发生。临床流调资料表明:现在临床运用最广的环磷酰胺和一线抗癌药物噻替哌已对人类显示出了明显的二次肿瘤效应。既往对环磷酰胺致癌性和致癌机制的研究多集中于动物致癌实验和啮齿类动物成纤维细胞的体外转化实验。对噻替哌致癌性的研究就更滞后和缺乏系统性。大约80%的人类肿瘤起源于上皮组织,因此,建立以人类上皮细胞作为靶细胞的转化细胞模型,从细胞、染色体和分子层面进行化疗药物的致癌机制研究就成为药物毒理和致癌机制研究领域的重要课题。 本研究运用永生化人支气管上皮细胞(BEAS-2B)作为靶细胞,该细胞为正常人支气管上皮细胞转染腺病毒和SV40杂交病毒后永生化。试验观察了亚致死剂量的环磷酰胺、噻替哌处理后,细胞受两药细胞毒作用后的细胞存活、死亡和凋亡效应;受遗传毒作用引起的细胞转化效应;利用染色体G—显带技术、PCR—SSCP和序列分析技术、平行于细胞的转化进程,研究了BEAS—2B细胞转化过程中的染色体变异和癌基因抑癌基因突变情况,主要试验结果如下: 1.环磷酰胺、噻替哌处理细胞的存活和转化效应规律为:小剂量时呈现生长刺激性效应;大剂量时呈现细胞毒效应;亚致死剂量呈现细胞转化效应;噻替哌致BEAS-2B细胞的转化剂量在微克水平、环磷酰胺在毫克水平,噻替哌的细胞转化剂量接近IARC指定的阳性化合物3—MCA(3—甲基胆葸)的转化剂量,提示噻替哌为一强致癌原,而环磷酰胺的致癌效应弱于噻替哌。 2.以亚致死剂量的环磷酰胺处理永生化人支气管上皮细胞,首次建立了能在体外长期传代的转化细胞系BEAS-CP、BEAS-T,转化细胞呈现赘生复层生长、细胞周期中各期细胞百分比改变、软琼脂克隆形成率增高、超微结构呈现癌性增生图像。证实细胞已发生转化。 3.本文首次发现经环磷酰胺、噻替哌作用的BEAS—2B细胞可以生成转化型和非转化型的细胞克隆,提出了鉴别两者的光镜和超微结构形态特征。推测由其它理化致癌原引起的上皮细胞转化过程也存在这样两种类型的细胞克隆,而且转化型克隆的有无和细胞转化程度的差异可能与被检物致癌性的有无和致癌性强弱有关。
颜璐[5]2007年在《苯并（a）芘诱导BEAS-2B细胞恶性转化及其转化过程中基因表达模式的研究》文中认为肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,发病率及死亡率增长迅速,世界卫生组织统计,估计有1352132新发病例和1178918人死亡(WHO, 2002)。发达国家发病率高于发展中国家。肺癌发病率近年来在我国增长很快,2002年我国肺癌发病男性为269650人,女性为126718人(WHO, 2002)。肺癌的自然病程中临床症状出现较晚,传统的放疗、化疗及手术治疗并不能降低病死率。因此,“早期发现、早期诊断.早期治疗”.是降低肺癌死亡率的重要措施,而这些都将基于肺癌发病机制的阐明。肺癌机制研究的方法目前主要包括对人群的研究,以及利用动物模型,细胞恶性转化模型进行研究。对于细胞恶性转化模型的研究大致分为三类细胞,成纤维细胞,胚胎肺细胞,以及人支气管上皮细胞,成纤维细胞与胚胎肺细胞,培养简单,成本低,人支气管上皮细胞的培养较困难,且费用很高,但就肺癌的组织学类型而言,除了肺腺癌中的细支气管肺泡癌之外,其余各种类型的肺癌均起源于人支气管上皮细胞。苯并(a)芘是已知的可致肺癌的致癌物,空气、土壤、水及食物中均有它的存在,食品制作与加工中,温度超过180度就会有苯并(a)芘的产生。它由有机物质的高温分解和不完全燃烧形成,也可由人类生产和生活活动产生以及自然生成,日常生活中经常被摄入到人体,是一种广泛存在的环境污染致癌物。近几年来对肺癌组织及恶性转化的细胞进行了大量的研究,筛选了一批基因及蛋白质,也观察了某些利用肺癌组织筛选出的已知基因在转化细胞中的表达情况,但是由于研究对象是癌变后的细胞和组织,并不一定能说明找到的是真正关键的基因,而且肺癌的发生不是由于一个两个基因而是多个基因共同作用的结果。我们认为要真正解决肺癌的早期发现、早期诊断问题,首先需要寻找癌变的关键阶段,然后阐明其变化特征和机制。本研究首先建立了已知致癌物B(a)P诱导人支气管上皮细胞转化的细胞模型,在确定细胞恶性转化的基础上,利用基因芯片分析致癌物作用后至细胞转化过程中不同代次细胞基因组的表达变化模式,为寻找出可能发生癌变的关键阶段、揭示致癌机制提供科学依据。方法:(1)采用永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B,分设100nmolB(a)P组和DMSO溶剂对照组,染毒时间24h后细胞常规培养,系统观察发生于转化过程中的细胞生物学特性并由血清抗性、锚着独立性生长能力,裸鼠成瘤试验来鉴定细胞的恶性转化情况,建立B(a)P诱导永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B恶性转化不同代次的细胞模型。(2)采用细胞遗传学方法分析了不同代次细胞的染色体改变(3)提取BEAS-2B经B(a)P诱导后第1、5、10、20、30代细胞及对照组同代数细胞的mRNA后逆转录标记cDNA探针,与Affymetrix公司U133 plus 2.0人类全基因组表达谱芯片杂交,经Affymetrix扫描仪扫描,GCOS软件读取、处理数据,分析杂交信号强度获得差异表达基因,并对差异表达的基因进行筛选。结果:(1)形态学观察在光镜下观察到,实验组细胞在20代后细胞形态不规则的数量开始增多,核浆比例增大,出现病理性核分裂像。(2)抗性试验第10代时各组细胞血清抗性试验均为阴性,第20代实验组细胞出现血清抗性和倍增时间增长。(3)软琼脂培养25代时实验组细胞在软琼脂上可形成小的细胞集落,细胞数十个左右聚集成团,但生长缓慢,不能进一步形成较大的克隆,达不到每个集落大于50个细胞的标准;至第30代时,实验组细胞即能在软琼脂上形成克隆。软琼脂克隆形成细胞经体外扩增培养后生长紊乱,极性消失,可见重叠生长。(4)动物致瘤性实验目前试验尚未结束,中途死亡实验组裸鼠两只,常规病理切片检查,有异形上皮细胞聚集成团,性质待定。(5)染色体核型分析从第20代出现染色体核型异常,主要类型有多倍体、染色体断裂、双着丝粒等。(6)差异表达基因和基因表达谱分析经人类全基因组芯片检测,得到第1、5、10、20、30代实验组与对照组细胞不同代次细胞表达的基因谱。发现不同代次细胞表达的基因谱有明显不同的特征,且各代之间差异表达的基因也有很大差异,以1、5、30代细胞表达的差异基因为基准对差异基因进行了聚类分析,揭示了这些差异基因在不同代次细胞的表达模式和特征。并对第10代细胞差异表达基因进行了通路分析。结论:(1)建立了B(a)P诱导永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B恶性转化的细胞模型,该模型的特点是可对从B(a)P作用后至细胞恶性转化过程中不同代次的同一批细胞进行分析。(2) B(a)P诱导永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B发生恶性转化的变化特征:第20代血清促分化作用的抗性反应明显增强,25代时可在软琼脂上形成小的细胞集落,但达不到每个集落大于50个细胞的标准,至第30代时,能在软琼脂上形成克隆,软琼脂克隆形成细胞经体外扩增培养后生长紊乱,极性消失,可见重叠生长。从第20代出现染色体核型异常,主要类型有多倍体、染色体断裂、双着丝粒等。(3)经人类全基因组芯片检测,发现第1、5、10、20、30代实验组与对照组细胞不同代次细胞表达的基因谱有明显不同的特征。并观察到不同代次细胞间共同上调或下调的差异基因中,未知基因占很大的比例,提出揭示这些基因的功能对阐明癌变的特征和机制可能是重要的。(4)从已知的与肿瘤相关的基因变化来看,尽管第5代已有肿瘤相关基因的变化,但以10、20代细胞的变化最明显,提示此阶段可能是癌变的关键阶段,而第10代可能是细胞癌变的早期阶段。创新点:分析了细胞恶性转化不同阶段的基因表达谱,筛选了不同阶段的差异表达基因,推测10-20代可能是细胞癌性改变早期的关键阶段。
秦宏冉[6]2011年在《异常高氡温泉对周围居民健康影响的研究》文中指出氡(222Rn)是普遍存在于环境空气中的天然放射性核素。根据联合国辐射效应科学委员会(UNSCEAR)2000年的报告,人类生活环境中由于吸入氡及其子体所产生的辐射剂量约占全部天然辐射剂量的54%。室内氡的问题一直是辐射防护领域关注的重点,2005年世界卫生组织启动了全球住宅氡项目(IRP),将天然放射性核素氡作为全球疾病负担评价的首选核素。氡是引起人类肺癌的主要因素,氡及其子体已成为仅次于吸烟的第二大肺癌相关致癌因子。流行病学调查显示,长期在氡浓度较高的矿井作业的矿工罹患肺癌的危险性将会增加,去除吸烟因素后,随着氡及其子体暴露量的不断增大肺癌发病率也明显增加。近年来,随着经济的发展,矿山、地热水和核能的开发利用加快,使得地下的放射性物质被转移到地表,形成了一些新的污染区和高氡区。我们在四川省若尔盖降扎乡发现一处异常高氡温泉,由于当地的藏民认为泉水可以治病,所以在温泉周围已经形成了新的生活区。我们的初步检测结果显示,生活区室内和室外氡浓度最高分别达到201164Bq/m3和699Bq/m3,属于罕见的异常高氡区,因此我们在该地区开展了居民健康效应的研究。同时,选取居住在相同海拔高度,生活习惯相似但是未接触过氡泉的藏族居民作为对照。氡可以引起人类外周血淋巴细胞染色体畸变的增加。本研究结果表明,高氡组的断片、染色体型畸变总和、染色单体断裂(以下称,单断)以及染色单体型畸变总和高于对照组(P<0.05)；高氡组和对照组的“双着丝粒体+着丝粒环”(以下称“双+环”)率分别是0.18±0.03(%)和0.12±0.04(%),虽无统计学差异,但均远远高于国内外健康人染色体的自发率(0.03%)；将高氡组研究对象按洗澡次数分组后发现,排除了“0～”组的一个异常值之后,“双+环”率随着洗澡次数的增多而增加,无统计学意义(P>0.05)；高氡组女性的染色体型畸变和染色单体型畸变高于男性,无统计学差异(P>0.05)；高氡组染色单体型畸变随着年龄的增加而增加(P>0.05)。另外,高氡组的微核率和微核细胞率高于对照组(P<0.05),且随着年龄的增加呈上升趋势(P>0.05)。细胞遗传学研究表明,高氡组居民与对照相比,受到了一定的辐射损伤。为进一步了解高氡组居民分子水平的变化,本研究用real-time PCR和western-blot法探索了p53、p16和k-ras基因的转录水平和蛋白水平的变化。研究结果表明,对于p53、p16和k-ras基因,高氡组分别是对照组的0.97倍,1.5倍和1.33倍。对于p53、p16和p21蛋白,高氡组分别是对照组的0.7倍,1.7倍和1.23倍。同时,由于microRNAs广泛存在于生物界,具有高度的保守性,广泛参与细胞分化与发育、细胞凋亡、肿瘤发生等多方面的基因表达调控。本研究着重探索了几种肺癌相关micro-RNAs,包括let-7a、miR-34a/b和miR-145。Real-time PCR结果表明,与对照组相比,高氡组let-7a和miR-145表达下调,分别是对照的0.61倍和0.64倍,但无统计学差异(P>0.05)；而miR-34a/b表达明显升高,是对照的15.7倍和351.24倍。高氡组miR-34a/b表现出异常高表达,提示可能是辐射损伤的早期标记,可为进一步开展氡致肺癌的生物标记物研究提供线索。由于氡引起肺损伤乃至肺癌是一个多基因多步骤的复杂生物学过程,更多的相关基因有待于我们进一步深入研究,以便阐明氡致肺癌的机理,并为氡致肺癌的早期诊断提供充足的理论依据。
周莉[7]2006年在《云锡矿粉体外诱导永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B恶性转化及其机制研究》文中研究指明目的：云南个旧为矿工职业性肺癌的高发区，以往学者在矿粉致癌性、遗传毒性及致癌机制等方面进行了大量研究，但仍有些问题尚未阐明。本研究旨在探讨云锡矿粉对人支气管上皮细胞的体外致癌转化效应，进一步研究云锡矿粉的遗传毒性及P53通路相关蛋白在云锡矿粉诱导的细胞恶性转化过程中的表达变化情况，同时应用基因芯片技术研究矿粉诱导的早期转化细胞与正常BEAS-2B细胞的基因表达谱差异，为揭示云锡矿工肺癌致癌机制提供依据。 方法：(1)采用永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B，设200μg／ml及50μg／ml两个剂量的矿粉染毒组和一个空白对照组，染毒时间72h，隔代染毒直至第9代。系统观察发生于转化过程中的细胞生物学特性及凝集试验、血清抗性、锚着独立性生长能力等转化表型特征。(2)采用单细胞凝胶电泳法(彗星实验)和染色体畸变试验分析观察矿粉对BEAS-2B细胞的遗传毒性，同时结合细胞转化试验观察此细胞受矿粉作用后染色体的动态变化。(3)采用免疫荧光细胞化学染色技术分别检测正常人支气管上皮细胞(BEAS-2B)、矿粉作用后第25代细胞(BEAS-MD-25)及软琼脂克隆形成细胞(BEAS-MD-C)中P53、MDM2、P21、P16的表达。(4)提取BEAS-2B经矿粉诱导后第25代高剂量组细胞及对照组同代数正常细胞的mRNA后逆转录标记cDNA探针，与Affymetrix公司U133 plus 2.0人类全基因组表达谱芯片杂交，经Affymetrix扫描仪扫描，GCOS软件读取、处理数据，分析杂交信号强度获得差异表达基因。 结果：(1)第20代时各组细胞凝集试验及血清抗性试验均为阴性；第25代高低剂量组细胞均出现凝集现象，凝集试验阳性，高剂量组细胞出现血清抗性和倍增时间增长、染色体畸变率增高；30代时高剂量组细胞在软琼脂上可形成小的细胞集落，细胞以数十个左右聚集成团，但生长缓慢，不能进一步形成较大的克隆，
李瑛[8]2008年在《GMA致16HBE细胞遗传物质损伤及对修复基因表达影响的研究》文中认为甲基丙烯酸环氧丙酯(Glycidyl methacrylate,GMA),别名甲基丙烯酸缩水甘油酯,是丙烯酸酯胶的主要组分,是一种高强度合成粘合剂的单体,该化学物分子既含有碳碳双键,又含有环氧基,具有很高的反应活性,能够使相关产品具有优良的防紫外、耐水和耐热等特性,因此在军事和民用工业中应用广泛。本研究课题组自80年代中后期首次从我国现场筛选出来并报道GMA致突变性以后,在国家自然科学基金等的连续资助下对其毒性、致突变性和潜在致癌性进行了一系列的研究工作。结果显示,GMA能与DNA共价结合,诱导原核生物基因突变,哺乳动物染色体损伤,人和大鼠外周血淋巴细胞DNA损伤,抑制DNA半保留复制,在体外GMA可诱导BALB/C 3T3细胞、金仓鼠细胞(SHE)、正常人胚肺成纤维(HELF)细胞等不同类型细胞发生恶性转化,转化作用呈剂量-效应关系,提示GMA具有潜在致癌性。细胞体外转化试验是研究癌变机制的重要方法,以人的上皮细胞为背景进行肿瘤发生发展的试验研究,在种属和组织差异方面更具优势,是化学物致癌机制研究的发展趋势。16HBE(human bronchial epithelial)细胞是SV40 large T抗原永生化的人支气管上皮细胞株,保留着正常人支气管上皮细胞的特定形态和功能,在体外易于培养,裸鼠体内无致瘤性,可以作为一种较理想的靶细胞用于潜在化学致癌物检测及诱发细胞恶性转化机制的研究。本研究选用人支气管上皮细胞(16HBE)作为靶细胞,从染色体和DNA水平观察GMA对16HBE细胞遗传物质的损伤作用,即检测GMA致16HBE细胞染色体的损伤,以及转化细胞DNA修复基因点突变的情况;同时采用“基因组稳定和DNA修复基因芯片”检测GMA致16HBE细胞恶性转化相关DNA修复基因表达改变的情况,以探讨GMA的潜在致癌性。研究获得的主要结果如下:1.GMA致16HBE细胞遗传物质损伤的研究1.1 GMA对16HBE细胞染色体的损伤作用不同剂量GMA染毒16HBE细胞24hr,诱导16HBE细胞染色体发生畸变,呈剂量-效应关系。16μg/ml和20μg/ml剂量组与溶剂对照组相比,细胞染色体畸变率显著增高(P＜0.05)。GMA诱导16HBE细胞产生的染色体结构畸变类型主要有断裂、碎片、双着丝点、环状染色体、三射体等。未观察到染色体数目畸变。低剂量(8μg/ml)GMA多次染毒16HBE细胞染色体畸变分析表明,16HBE细胞连续3次GMA染毒,与溶剂对照比较细胞染色体畸变率显著增高(P＜0.05),且随着染毒时间延长,细胞染色体畸变率升高。细胞染色体畸变以结构畸变为主,未观察到染色体数目畸变。对GMA诱导的16HBE转化细胞进行染色体畸变分析,转化细胞与对照细胞染色体结构畸变发生率无统计学差异(P＞0.05);染色体核型分析显示,转化的16HBE细胞失去正常核型,二倍体细胞减至79%,亚二倍体和超二倍体细胞增多,与溶剂对照相比,核型改变存在显著性差异(P＜0.05)。1.2 GMA致16HBE转化细胞DNA修复基因点突变的分析采用PCR-RFLP方法对GMA致16HBE转化细胞的DNA修复基因hMSH2基因C471A、G322A、IVS12-6(T＞C)及IVS1+9(C＞G)位点,XRCC1基因C26304T、G27466A、G36189A位点,XPD基因G23591A、A35931C位点及XRCC3基因C18067T位点的点突变情况进行分析,并应用DNA测序法(双脱氧末端终止法)对分析结果进行验证。结果显示,与对照细胞相比,转化细胞中hMSH2基因IVS12-6(T＞C)位点突变为TC基因型,未检测到其它位点的突变。2.GMA致16HBE细胞恶性转化相关DNA修复基因表达的改变采用“基因组稳定和DNA修复基因芯片”检测GMA转化细胞和对照细胞中DNA修复基因表达情况,分析两者的差异。应用GEArray Analyzer软件分析显示,GMA转化细胞与对照细胞比较,在113个基因中有8个基因的表达有显著差异,其中7个基因表达上调(ratio＞2),分别是NBS1、RAD50、RAD51、OGG1、XAB2、TOP3a、TNKS;NEIL2基因表达下调(0＜ratio＜0.5)。NBS1、RAD50、RAD51基因是双链断裂修复通路(DSBR)中的重要的功能基因,OGG1及NEIL2基因是碱基切除修复通路(BER)中的重要基因,XAB2是参与核苷酸切除修复(NER)的基因,TOP3a和TNKS是与基因组稳定相关的基因。上述DNA修复基因表达的改变进一步提示GMA致16HBE细胞恶性转化是一个多基因参与的复杂过程,涉及多个基因多条修复通路的协同作用。综上所述,本研究探讨了GMA致16HBE细胞恶性转化过程中对遗传物质的损伤,及其对DNA修复基因表达改变的影响。结果提示GMA可通过对染色体的损伤影响其所携带基因的结构和功能改变,且GMA通过改变DNA修复基因结构及对相关DNA修复基因表达的影响,从而导致细胞修复功能缺陷及损伤—修复的平衡紊乱,基因组稳定性下降,最终导致正常细胞恶性转化。本研究工作为深入探讨GMA的潜在致癌机制提供新的线索,同时也为GMA致癌危险度评定、开展流行病学监测奠定了理论基础。
胡迎春[9]2003年在《α粒子辐射诱发人支气管上皮恶性转化成瘤细胞的生物学特性研究》文中研究表明据估计，人类所受天然辐射中50％的剂量来自于氡及子体衰变时发出的α粒子，流行病学研究表明暴露于高水平的氡及其子体可导致肺癌的发病率增高，因此研究氡或者说α粒子与人类肺癌的关系是辐射致癌研究领域的热点。约80％的人类癌症起源于上皮组织，因而用上皮细胞进行研究能更好地模拟人体癌症发生的自然过程，是辐射致癌研究的发展趋势，但是以前的致癌机理研究多集中于整体动物实验或成纤维细胞的体外细胞恶性转化实验，因此采用上皮细胞的恶性转化模型进行致癌机理研究就具有十分重要的意义。辐射致癌过程大致可以分为启动、促进及恶性进展三个阶段。为了在体外完整地建立起可以模拟辐射致癌各阶段的细胞模型，本研究以我室已建立的α粒子辐射诱发的人支气管上皮细胞恶性转化株BERP35T4为基础，将该细胞接种于裸鼠皮下，在裸鼠体内连续传代三次后，观察到该细胞获得转移潜能，将该肿瘤组织进行体外分离肿瘤细胞并培养建系，获得了具有转移潜能的恶性转化细胞系BERP35T4-Ta；本研究还以三种细胞系：BEP2D、BERP35T4及BERP35T4-Ta为材料，分别从免疫组化、增殖速度、锚着独立生长能力、血清抗性及染色体数日等方面对这三种细胞系的特性进行了研究，还利用Transwell技术分析了BERP35T4-Ta的迁移能力，并进一步分离出转移细胞；最后利用微卫星不稳定性分析技术对肿瘤细胞系中抑癌基因的杂合性缺失情况进行了检测。本研究所获得的主要结果如下：1． BERP35T4(immortalized human bronchial epithelial cell transformed byα-particles)成瘤性实验：以永生化人支气管上皮细胞BEP2D为对照，将BERP35T4细胞接种于5-6周龄裸鼠皮下，每组接种9只，雌雄兼半。16周后，对照组无一长出肿瘤(0／9) ，BERP35T4组相继有4只长出肿瘤(4／9) ，其中1只裸鼠在其胸部及后肢出现肉眼可见的转移瘤，经解剖，发现肺部也出现转移灶。将BERP35T4在裸鼠体内连续传代三次，共接种动物14只，移植瘤均能成活并生长，鼠间肿瘤传代成瘤率达到100%(14／14) 。鼠间传代肿瘤潜伏期明显缩短为7-14天，传代间隔时间也缩短为3． 5周。经病理和免疫组化染色鉴定，皮下瘤组织和肺中的转移a粒子辐射诱发人支气管上皮恶性转化成瘤细胞的生物学特性研究中文摘要瘤组织均为低分化鳞状上皮细胞癌。裸鼠肿瘤组织经体外无血清选择培养获得了具有转移潜能的细胞BE即35T4一T，通过极低密度接种的方法从BERP35T4一T中进一步分离出三株能在体外长期传代的单克隆，分别命名为:BERP35T4一Ta、BE对35T4一Tb、BE即35T4一Tc(tumorigenic human bronchial ePithelial eelltransformed by以一Partieles)。 2.BEpZD、BERP35T4和BE即35T4一Ta的细胞生物学特性研究:①细胞增殖能力:三种细胞的生长速度按快慢依次为BE即35T4一Ta>BERP35T4>BEPZD;倍增时间按长短依次为BEPZD>BERP35T4>BERP35T4一Ta。②锚着独立生长能力:BEPZD细胞在软琼脂中最多可以从一个细胞分裂成八个细胞，基本无法形成克隆，而且在细胞接种一周内陆续死亡，克隆率只有0.05%;而BERP35T4的软琼脂克隆形成率为0.64%，明显高于BEPZD;BE好35T4一Ta的克隆率更是高达1.26%，说明了BE即35T4经过在裸鼠体内连续传代三次后所分离出的BE即35T4一Ta细胞，其锚着独立生长能力得到了加强。③血清抗性:在含有10%血清的培养基中，BE咒D出现鳞状分化，生长速度减慢，细胞变扁大并逐渐死亡，而BERP35T4和BE犯)35T4一Ta细胞则对血清分化产生抗性，持续保持增殖能力，并且BE即35T4一Ta对血清的抗性强于BE即35T4。④染色体众数:BEPZD具有较为稳定的细胞遗传学特性，在传代过程中可保持较为稳定的染色体众数和核型。BERP35T4二倍体数目减少，大量出现亚三倍体(42%)，同时也存在一定比例的四倍体(35%);BERP35T4一Ta染色体数目四倍体率高达82%。⑤细胞的迁移能力:采用Transwell技术检测了三种细胞的迁移能力，发现BEPZD与BERP35T4基本不发生迁移，而BERP35T4一Ta的迁移率可达到l%，我们还对转移细胞进行了进一步的分离和培养。综合以上实验结果，本文认为BE钟35T4一Ta细胞具有较为典型的恶性肿瘤细胞的表型，并且还具有较高的转移能力。 3.微卫星不稳定性分析技术检测抑癌基因的杂合性缺失:针对位于肺癌高缺失染色体区域的9个已知基因(尸z刀T、A尸C、尸RLTS、p肠、尸了石刃、p卯、ATM、BRcA了、p”)，选择了16个位于基因内或与基因紧密连锁的微卫星多态性位点，对上述三种细胞系(BEPZD、BERP35T4及BERP35T4一Ta)进行了微卫星不稳定性分析。结果显示:厂万ZT基因在BERP35T4和BERP35T4一Ta细胞中均发生了杂合性缺失，而p肠基因的杂合性缺失只在BERP35T4一Ta细胞中发现，在BE即35T4细胞中没有发现。该结果提示:月W丁基因在BEPZD细胞的恶性转化过程中起着a粒子辐射诱发人支气管上皮恶性转化成瘤细胞的生物学特性研究中文摘要重要作用，而p了‘基因在该细胞恶性进展获得转移特性的过程中起着一定的作用。 综合以上实验结果，本研究所建立的BE”35T4一Ta细胞与BERP35T4细胞相比，在
李立[10]2001年在《Fhit基因在人支气管上皮细胞癌变发生发展中的异常改变及其作用机制》文中指出肺癌是西方国家最常见的死亡原因，近年来在我国的发病率明显上升。肺癌组织3号染色体短臂的片段缺失是肺支气管癌变过程中的早期事件。 Fhit基因定位于3p14.2，它的异常改变常见于多种上皮来源的肿瘤，尤其是与环境致癌物暴露相关的肿瘤。在肺支气管癌前病变阶段已经可以检测到Fhit蛋白的缺失。在肺癌中，吸烟者Fhit DNA及蛋白的缺失显著高于非吸烟者。 Y细胞是经SV40 LT抗原转染而建立的人支气管上皮永生化细胞系，Western blot的分析结果发现Y细胞缺失Fhit蛋白。为了进一步了解Fhit基因在人支气管上皮细胞癌变发生中的作用机制，本研究用Fhit基因的真核表达载体转染Y细胞，从而得到了稳定高表达Fhit蛋白的Y／Fhit细胞。 表型的研究主要包括Fhit蛋白的高表达对细胞生长、克隆形成、细胞周期及自发性凋亡的影响。与对照Y和Y／pcDNA3.1细胞相比，Y／Fhit细胞的生长速度明显降低、克隆形成率分别下降了14.8％及11.1％，这种抑制作用在培养基中加入血清后更加显著。PI染色后流式细胞仪检测细胞周期发现Y／Fhit细胞G2期的百分含量显著增加。Annexin V染色结果表明Fhit蛋白的高表达并不引起Y细胞的自发性凋亡。
参考文献：
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[3]. 人肺癌分子细胞遗传学异常改变的研究[D]. 董向阳. 中国协和医科大学. 1998
[4]. 环磷酰胺、噻替哌诱导人支气管上皮细胞致癌性转化及相关机制的研究[D]. 袁素波. 中国人民解放军军事医学科学院. 1999
[5]. 苯并（a）芘诱导BEAS-2B细胞恶性转化及其转化过程中基因表达模式的研究[D]. 颜璐. 第二军医大学. 2007
[6]. 异常高氡温泉对周围居民健康影响的研究[D]. 秦宏冉. 中国疾病预防控制中心. 2011
[7]. 云锡矿粉体外诱导永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B恶性转化及其机制研究[D]. 周莉. 昆明医学院. 2006
[8]. GMA致16HBE细胞遗传物质损伤及对修复基因表达影响的研究[D]. 李瑛. 中国疾病预防控制中心. 2008
[9]. α粒子辐射诱发人支气管上皮恶性转化成瘤细胞的生物学特性研究[D]. 胡迎春. 中国人民解放军军事医学科学院. 2003
[10]. Fhit基因在人支气管上皮细胞癌变发生发展中的异常改变及其作用机制[D]. 李立. 中国协和医科大学. 2001
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