李斐[1]2006年在《猪细小病毒VP2蛋白主要抗原表位基因的表达及检测应用》文中研究指明猪细小病毒(PPV)是引起母猪畸胎的主要因素之一。可引起繁殖障碍，给养猪业带来重大的经济损失。目前，国内的检测试剂盒准确率不是太理想，因此，建立快速、特异的检测方法已成为迫切需要。PPV的VP2基因是该病毒的主要中和抗原，基因序列保守，其表达的蛋白具有较强的免疫原性，可应于临床诊断。本研究从以下几个方面研究VP2蛋白，旨在建立一种快速、特异的诊断PPV的检测方法。 1．设计一对引物从李庭构建的PET-VP2 Ⅰ载体中扩增出目的基因，并将扩增的片段插入毕赤酵母表达载体pPICZα-A中，构建出酵母重组质粒pPICZα-A-VP2 Ⅰ，经甲醇诱导表达、SDS-PAGE、间接ELISA及免疫印迹的分析表明分泌表达产物具有良好的免疫学活性。 2．研究了培养条件与表达产量的关系，确定高拷贝重组酵母表达VP2蛋白的最佳条件为：28-30℃，225rpm震荡培养至BMGY中菌体OD_(600)为3时，将菌体转入pH7.0的BMMY培养基中使菌体浓度为OD值1.5，培养72h，每24h加入甲醇使终浓度达1％。在最佳条件下VP2蛋白的表达量为227.6ug／mL，通过比较不同温度下保存VP2蛋白的降解程度得出酵母培养上清应保存于-20℃。 3．通过酵母分泌表达获得的猪细小病毒VP2蛋白经透析纯化后，作为包被抗原初步建立了检测猪细小病毒抗体水平的间接ELISA方法，并对该方法进行了优化，用此优化方法检测了200份来自发病猪场的待检猪细小病毒阳性血清样品，并将其与华中农业大学的乳胶凝集试剂盒相比较，符合率达92.6％。 4．将构建好的重组质粒PET-VP2 Ⅰ转化宿主菌BL21，利用IPTG(1mmol／L)诱导实现了PET-VP2 Ⅰ蛋白主要抗原域VP_2 Ⅰ融合蛋白的高效表达。通过Western-blot检测证明表达的重组蛋白具有良好的免疫学活性。表达产物经His-Bind层析柱纯化后作为诊断抗原初步建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法。结果表明：抗原的最佳包被浓度为3.5μg／mL，血清的最佳稀释度为1：40，待检血清阳性标准初步定为OD_(490)＞0.51，且待检血清的OD_(490)值与阴性血清的OD_(490)值的比值大于2.1。
李霆[2]2002年在《猪细小病毒VP_2蛋白主要抗原域的原核表达与表达产物纯化》文中研究表明根据Genbank已发表的猪细小病毒(PPV)NADL-2株的核酸序列，自行设计了一对引物；SDS-蛋白酶K法提取PPV RP DNA作为PCR扩增模板，进行PCR扩增；获得了猪细小病毒VP_2蛋白主要抗原域的核酸片段；将其克隆入pGEM-T~(?)-easy克隆载体中，经酶切鉴定分析，证实为PPV VP_2蛋白的主要抗原域(命为VP_2Ⅰ)；再将其亚克隆入原核表达载体pET32-α(+)，构建成VP_2蛋白主要抗原域原核表达载体pET VP_2Ⅰ。 用已构建的表达猪细小病毒VP_2蛋白主要抗原域的原核表达载体pET VP_2Ⅰ转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取阳性克隆培养，IPTG诱导后裂解菌体作SDS-PAGE分析，出现大小约45KD的表达产物即融合蛋白TrxA-VP_2Ⅰ，表达量约30％，经Western-blot验证重组蛋白具有PPV特异的反应原性，通过摸索不同诱导时间、不同诱导所需IPTG浓度优化了VP2蛋白主要抗原域VP_2Ⅰ融合蛋白的表达条件：2×YT培养基30℃培养待菌生长至OD600为0.4-0.6时，用终浓度为0.2mM的IPTG诱导，于37℃振荡培养4-5h。由于表达产量较高，融合蛋白以包涵体的形式存在，超声波裂解菌体分离包涵体并离心、洗涤；分别采用不同浓度的尿素与盐酸胍溶解包涵体，证明6M尿素变性能力较好；分别采用了凝胶层析(FPLC)与螯合亲和层析纯化了经变性处理的融合蛋白，前者蛋白回收率达25.8％；冷冻干燥保存了纯化的重组蛋白备做检测抗原，为检测PPV抗体的乳胶凝集试剂盒与ELISA试剂盒的建立奠定了基础。
田丽红[3]2010年在《虎源猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白的原核表达及应用研究》文中研究指明猫泛白细胞减少症是由猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)引起猫科动物以高热、呕吐、脱水、白细胞严重减少和出血性肠炎为主要特征的急性、高度接触性传染病。在自然条件下,FPV可感染虎、豹、狮、水貂、浣熊等多种食肉类动物,具有很高的致死率,严重威胁圈养及野生虎等大型猫科动物的养殖和保护,迫切需要建立能够同时大批量检测多种动物FPV感染的通用诊断方法。VP2蛋白为FPV主要结构蛋白,是FPV衣壳的主要成分,暴露在衣壳蛋白表面,为FPV的主要免疫保护性抗原蛋白,能诱导机体产生中和抗体,是研究FPV诊断抗原制备的首选对象。目前,尚未见有利用原核表达系统完整表达VP2基因的报道。本研究利用CRFK细胞对某东北某虎林园发生传染性出血性肠炎的老虎粪便进行了病毒的分离和鉴定,对分离的虎源FPV保护性抗原VP2蛋白全长基因进行克隆与遗传变异分析。在此基础上,利用原核表达载体PGEX-6P-1在BL21宿主菌中表达该基因。以表达的重组VP2蛋白作为抗原,通过建立检测家猫FPV自然感染抗体的间接ELISA方法来研究2种属来源FPV VP2蛋白的抗原特性变化及该蛋白作为猫科动物猫泛白细胞减少症通用诊断抗原的特性。基于VP2蛋白为检测FPV优势诊断抗原特性,利用纯化的重组VP2蛋白替代传统的全病毒成份作为诊断抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的SPA作为广谱第二抗体,初步建立适用于2种猫科动物猫泛白细胞减少症血清抗体检测的SPA-ELISA方法。用建立的SPA-ELISA方法对临床30份猫血清样本、86份虎血清样本进行检测,同时与HI、间接ELISA方法进行比较。在此基础上,以纯化的重组VP2蛋白为免疫原,FPV全病毒作为筛选抗原,运用淋巴细胞杂交瘤技术,制备虎源FPV VP2蛋白特异性单克隆抗体。结果如下：利用CRFK细胞从老虎粪便中成功分离出强毒株FPV-HLJ2,测得该毒株VP2基因全长为1755个核苷酸,编码584个氨基酸。序列分析表明该病毒与虎源FPV-HLJ株核苷酸同源性为100%,实为同一毒株。利用原核表达系统实现了虎源FPVVP2基因的表达,SDS-PAGE和Western blot显示表达产物以包涵体形式存在,大小约为84 ku,并具有抗原性。其中目的蛋白58 ku, GST标签蛋白26ku。在家猫猫泛白细胞减少症间接ELISA抗体检测法的应用中,该外源表达蛋白亦显示出很好的抗原特异性,VP2蛋白上一些位点氨基酸的变异并未影响FPV抗原性,表达的重组VP2蛋白可以作为诊断抗原用于家猫FPV抗体的间接ELISA检测,初步证明该蛋白具有作为猫科动物猫泛白细胞减少症通用诊断抗原的特性。以纯化的重组VP2蛋白替代传统的全病毒成份作为诊断抗原,建立了SPA-ELISA方法,确定了检测2种猫科动物FPV抗体的SPA-ELISA最佳操作程序,批内及批间重复试验均显示变异系数小于10%。对临床30份猫血清样本、86份虎血清样本的对比检测结果显不,SPA-ELISA方法检出率较高,大于HI法的检出率,与间接ELISA法接近。叁种检测方法检测猫血清的总体符合率为96.7%。在虎血清检测中,SPA-ELISA方法的阳性检出率亦高于HI方法,二者总体符合率为94.2%。以重组VP2蛋白作为免疫抗原,用FPV全病毒作为筛选抗原,采用传统的杂交瘤技术,经过间接ELISA方法筛选和有限稀释法亚克隆,最终获得了1株可稳定分泌虎源FPVVP2蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株3C4。间接ELISA方法测定3C4株单抗腹水效价为1：12800,亚类鉴定为IgG2a类型,间接免疫荧光鉴定试验显示,该株单抗能使接种虎源FPV的CRFK细胞产生亮绿色荧光,而免疫印迹试验显示该株单抗未见特异性反应带。本研究初步明确了2种属来源的FPV抗原性差异,实现了FPV VP2蛋白的初步实践应用。基于FPV VP2蛋白建立的SPA-ELISA诊断方法,解决了目前虎等猫科动物FPV抗体检测方法非常单一、不能大批量检测等问题,有望用于豹、狮、熊猫、豹猫、浣熊、水貂、猞猁等更多种类动物血清猫泛白细胞减少症病毒抗体的检测。对实现适用于更多种圈养及野生猫科动物等猫瘟热病的快速诊断、疫情监测、流行病学调查和免疫抗体效价测定具有重要意义。基于FPV VP2蛋白制备的FPV VP2蛋白特异性单克隆抗体,为FPV、CPV和MEV诊断及分子生物学研究提供一种更为敏感和特异的试剂。
李斐, 任雪枫, 郑其升, 魏建超, 曹瑞兵[4]2005年在《猪细小病毒VP2蛋白主要抗原表位基因的原核表达及应用》文中进行了进一步梳理将构建好的重组质粒PET-VP2转化宿主菌BL21,利用IPTG(1mmol/L)诱导实现了PPV VP2基因的高效表达。通过Western-blot检测证明表达的重组蛋白具有良好的免疫学活性。表达产物经HisBind层析柱纯化后作为诊断抗原初步建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法.结果表明:抗原的最佳包被浓度为3.5μg/ml,血清的最佳稀释度为1:40,待检血清阳性标准初步定为OIM90>0.51,且OD待检血清/OD阴性血清>2.1。
李斐, 曹瑞兵, 周斌, 郑其升, 魏建超[5]2005年在《猪细小病毒VP2蛋白的主要抗原表位基因的原核表达及检测应用》文中提出将构建好的重组质粒PET-VP2Ⅰ转化宿主菌BL21,利用IPTG(1mmol/L)诱导实现了PET-VP2Ⅰ蛋白主要抗原域VP2Ⅰ融合蛋白的高效表达。通过Western-blot检测证明表达的重组蛋白具有良好的免疫学活性。表达产物经HisBind层析柱纯化后作为诊断抗原初步建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法。结果表明:抗原的最佳包被浓度为3.5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶40,待检血清阳性标准初步定为OD490>0.51,且待检血清的OD490值与阴性血清的OD490值的比值大于2.1。
马婧[6]2016年在《博卡病毒MVC结构蛋白VP2多克隆抗体的制备与鉴定》文中进行了进一步梳理目的犬博卡病毒MVC(Minute Virus of canine)是细小病毒家族博卡病毒亚家族的成员之一。而VP2作为MVC病毒的结构蛋白,不仅是构成衣壳蛋白的主要成分,更是细小病毒的主要免疫原性抗原,其具有凝血活性的物质,是作为决定宿主范围以及宿主与病毒之间相互作用的关键影响因素。因此,本文通过构建MVC的VP2结构蛋白的原核表达载体,通过诱导表达、纯化目的蛋白,免疫兔子、制备针对VP2的多克隆抗体,为进一步研究VP2在MVC病毒致病及感染中的作用,深入揭示MVC病毒致病及感染的分子机制奠定研究基础。方法(1)以本实验室保存的博卡病毒MVC的感染性克隆载体p IMVC为模板PCR扩增VP2基因,并将其产物纯化。将纯化产物与表达载体p ET32a(+)经EcorⅠ、XhoⅠ同时双酶切,经T4连接酶连接,转化到克隆菌株Ecoli.DH5α以及表达菌株Ecoli.BL21,通过双酶切鉴定正确后,进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测和鉴定目的蛋白的表达。目标蛋白经大量表达后,回收细菌超声裂解并Ni柱纯化,以纯化产物作为完全抗原免疫新西兰大白兔。(2)ELISA检测抗体效价。(3)以MVC感染WRD(Walter Reed Dog)嗜性细胞,然后运用Western blot和免疫荧光技术鉴定抗体特异性。结果(1)DNA序列测定及双酶切鉴定结果均显示MVC-VP2基因成功构建至原核表达载体p ET32a(+)上,原核表达产物经SDS-PAGE鉴定后证实成功表达一相对分子量(Mr)约为39kd的目的蛋白条带,VP2目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。(2)以纯化得到的MVC-VP2重组蛋白免疫制备得到兔血清,ELISA方法测得其效价为1:200 000。(3)Western blot、免疫荧光方法证实VP2多抗血清能够成功检测MVC感染的WRD细胞,并且具有特性。结论成功构建了MVC结构蛋白基因VP2的原核表达载体p ET32a(+)-VP2,并表达了相应的可溶性蛋白。制备了高效价博卡病毒MVC的VP2多克隆抗体,具有很好的特异性。
陈弟诗[7]2011年在《猪乙型脑炎病毒—细小病毒—伪狂犬病毒活载体疫苗的研究》文中研究指明猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)及流行性乙型脑炎病毒(JEV)是引起猪繁殖障碍性综合征(SMEDI)的叁大主要病毒性病原,临床上常与免疫抑制性病毒：猪瘟病毒(HCV)、猪呼吸繁殖综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)等和一些细菌性疾病等混合或继发感染,除引起严重的繁殖障碍外,更导致猪病临床症状复杂多变性,增加治疗和防控的难度,造成巨大经济损失。为节约人力简化免疫程序、降低免疫干扰、减小动物应激、鉴别疫苗与野毒,研发一种高效、稳定、安全、方便的新型疫苗来同时预防和控制好当前叁种病毒病,是最大幅度降低猪繁殖障碍性综合征(SMEDI)及相关疫病行之有效的途径。PRV活载体和PPV VP2病毒样颗粒的联合应用,为发展新型动物疫苗提供了思路。本研究开展了对四川省猪场猪只PRV和JEV的血清学调查,以掌握其流行现状；研究了密码子优化的JEV多抗原表位串联基因e与PPV VP2嵌合DNA疫苗；并以猪伪狂犬病毒疫苗株SA215为载体,构建了JEV-PPV-PRV活载体疫苗。主要研究内容如下：1、四川省部分猪场伪狂犬和乙型脑炎的血清流行病学调查采用PRV gE ELISA检测试剂盒对2009年-2010年以四川省18个地区的27个具有代表性大中小型猪场不同批次送检的血清1177份进行了伪狂犬野毒的检测,并对数据进行了统计分析。结果显示,各猪场平均gE抗体阳性率为8.2%,阴性猪场占59.3%,川东北区阳性率最高为18.8%,公猪野毒感染率最高达7.4%,基础母猪规模为100头以下的小型猪场猪只伪狂犬野毒阳性率最高为52.7%。对四川省10个地区的14个猪场进行PRVgB抗体ELISA检测,结果显示,各猪场gB抗体阳性率从最低的66.7%到最高100%,14个猪场平均抗体阳性率达87%,表明四川省PRV的免疫情况参差不齐,差异较大。采用JEV抗体ELISA检测试剂盒对四川14个地区21个规模化猪场从2009年2月至2010年10月的1100份样品进行了检测,并对数据进行了统计分析,结果显示,JEV抗体总阳性率为75.1%,川西区抗体阳性率最高为83.6%,4月份抗体阳性率逐渐升高,到5月份阳性率达到第二高水平92.1%。将826份JEV ELISA检测为阳性的样品按照猪群类别分类随机抽样20%,采用JEV RT-PCR进行检测,结果显示,后备猪阳性率为6.5%最高,表明四川省猪群存在JEV感染。2、乙脑E基因多抗原表位基因的设计和原核表达通过生物信息学方法对JEVE蛋白抗原表位进行了预测,结合文献报道筛选出5个B细胞表位和1个T细胞表位,为了增强细胞免疫应答引入通用辅助T细胞表位(PADRE),选取合适的接头Linker序列将各表位进行不同顺序线性串联组合,初步优化获得基于多抗原表位疫苗分子的氨基酸序列,并用生物软件对串联的乙脑多表位肽进行了分析评价。以原核表达质粒pET-32a为载体,构建了含JEV多抗原表位串联基因的原核表达质粒pET-e,经IPTG诱导成功表达,Western blot结果表明,JEV阳性血清能特异性识别JEV多抗原表位串联基因e的表达产物,表明JEV多抗原表达蛋白e具有免疫原性,为后续研究奠定了基础,以便应用于基因疫苗研制。3、猪细小病毒VP2蛋白N端甘氨酸富集区的缺失对病毒样颗粒的形成及免疫原性的影响PPV VP2蛋白N端连续9个甘氨酸富集的编码区是VP3蛋白的切割位点,常规PCR扩增容易导致该区段的缺失,为研究该缺失对PPV VLPs的影响,探索VP2病毒样颗粒上适合外源基因插入的位点,笔者构建了该区段缺失的VP2的真核表达载体pCI-△VP2,并以完整VP2作为对照,采用脂质体介导法转染Vero细胞,通过生物信息学技术,SDS-PAGE和Western-boltting,间接免疫荧光以及正染和免疫电镜对表达产物进行分析观察；进一步将重组质粒以核酸疫苗的方式直接肌注免疫小鼠,采用间接ELISA试验,淋巴细胞增殖试验和T细胞亚群流式细胞技术,分析免疫小鼠的体液和细胞免疫应答。结果显示,缺失△VP2和完整VP2在Vero细胞中均能自我装配成VLPs,并具有与完整病毒粒子类似血凝性,pCI-△VP2和pCI-VP2均可诱导小鼠产生较强的特异性体液免疫应答和良好的细胞免疫应答。结果表明,甘氨酸富集区的缺失不影响VP2病毒样颗粒的装配和免疫原性,△VP2同样可进行PPV VPLs疫苗和抗原转运载体的研制,为VPLs载体改造和修饰位点的探索提供了新方向,为VP2基因结构与蛋白质功能的关系提供了新的理论依据4、密码子优化的JEV多抗原表位e与PPV VP2嵌合真核表达载体pCI-Ve的构建按照哺乳动物密码子偏爱性对JEV多抗原表位串联基因e进行了密码子优化,人工合成密码子优化的e基因,将密码子优化的e基因连接到PPV VP2的N端,以真核表达载体pCI-neo为基础,分别构建了含密码子优化的JEV多抗原表位e的pCI-e和密码子优化的JEV多抗原表位与PPV VP2嵌合基因Ve的真核表达质粒pCI-Ve。构建的重组质粒pCI-e和pCI-Ve由脂质体介导转染Vero细胞,经过SDS-PAGE和Western-blotting,以及间接免疫荧光检测,结果表明e和Ve成功表达,具有免疫原性,电镜观察重组质粒pCI-Ve的细胞表达产物,表明产物可能形成病毒样颗粒。5、JEV-PPV新型核酸疫苗的免疫效果研究将真核表达质粒pCI-Ve、pCI-e和pCI-VP2以肌肉注射方式,100μg/只剂量免疫健康昆明鼠,2周后相同剂量加强免疫一次,检测其体液免疫和细胞免疫情况,同时检测了中和抗体产生情况,还通过攻毒实验对pCI-Ve的免疫保护作用进行了评价。结果表明,pCI-Ve够诱导小鼠产生良好的体液和细胞免疫应答,对致死剂量的JEV强毒攻击能提供75%的保护率,表明pCI-Ve具有作为预防猪乙脑和细小病毒病的新型DNA疫苗的潜力。6、JEV-PPV-PRV活载体疫苗的研究将密码子优化的JEV多抗原表位基因e和PPV VP2嵌合基因Ve连接到本实验室的通用PRV SA215转移载体中,构建了转移载体pPI-Ve,通过与亲本株PRV SA215同源重组,构建了重组PRV SA215(G)。经Western-blot、PCR、绿色荧光和细胞病变的观察鉴定,结果表明PRV SA215 (G)构建成功。通过在Vero细胞上的致病变效应和电镜观察表明插入外源基因Ve几乎不影响亲本株SA215的生物学特性,电镜观察到PRV SA215 (G)在Vero细胞培养物中形成比VP2病毒样颗粒稍大的类似颗粒,推测表达了Ve嵌合病毒样颗粒。猪只免疫试验结果表明,PRV SA215 (G)以106.0TCID50/只,1次性肌肉注射免疫仔猪,能诱导较好的JEV、PPV和PRV体液免疫应答,能诱导良好的Thl型和Th2型细胞免疫应答,主要为Thl型,能产生亲本株类似的中和抗体效价。表明PRV SA215(G)可作为预防JEV、PPV和PRV的活载体疫苗的优良候选株。
梁冬莹[8]2007年在《ADV分离株全基因序列测定及VP2抗原表位区的表达与应用》文中研究说明水貂阿留申病(Aleutian Disease，AD)是由细小病毒亚科(Parvovirinae)阿留申水貂病毒属(Amdovirus)水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus，ADV)引起的免疫系统病理性失调，是一种主要侵染水貂、病程缓慢的传染性疾病。该病以垂直和水平传播两种形式在世界各国的貂群中广泛流行，导致没有抗体的新出生幼貂的急性间质性肺炎甚至死亡，成年水貂的繁殖能力、皮张质量、健康状况下降以及死亡率增加，对水貂养殖业造成不可低估的经济损失。近年来，我国水貂养殖区阿留申病的流行情况在国内时有报道，高水平的AD感染一直是严重影响我国水貂养殖业高效、健康发展的一个非常重要的因素之一。由于目前针对该病缺少有效的防治方法，普遍采用的是通过定期检测，淘汰患病貂群，从而达到净化种群的目的。因此，在国内进行分离鉴定病毒株及进行分子生物学特性研究，建立国内适用的血清学诊断方法，将会对今后国内开展水貂阿留申病的临床诊断、有效防制及进一步的深入研究，提供更多的科学依据。在本研究中，首先通过CIEP以及本实验室建立的ADV PCR检测方法，对黑龙江某水貂养殖场发病送检貂以及辽宁某水貂养殖区疑似阿留申病貂进行检测，将经两种方法检测均为阳性结果的毒株进行PCR扩增产物的序列测定，从中抽取序列较为保守的四株病毒与标准对照毒株进行序列比对和同源性分析，与ADV-G相应片段的核酸同源率分别为92.8％、93.9％、93.2％和93.5％，与参考株ADV-Utah的同源率分别为94.5％、98％、94.6％和95.5％，确定为ADV特异性核苷酸片段。依据鉴定的结果，成功鉴定了四株病毒，分别命名为MS-1、DL-1、DL-2和DL-3。将MS-1、DL-1、DL-2和DL-3株病毒经组织病料提取总DNA，采用依据标准毒株ADV-G的DNA序列设计并合成的四对引物，经PCR扩增后分别构建重组质粒并测序，将测序结果用DNA Star软件中的SeqMan程序进行拼接，获得四株病毒的近全长DNA序列。用DNA Star软件MegAlign程序中的Jotun Hein method将实验测得的毒株与国外病毒参考株的对应核苷酸序列进行同源性比较和进化树分析。结果表明，ADV-Utah与四个实验毒株的序列同源性较高，同源率为92.9-93.4％，ADV-G、ADV-SL3与实验毒株的同源性较低；四个实验毒株和叁个参考毒株被分别划归为两个组，分属于两个进化分支；实验毒株中ADV-DL1与DL2和DL3虽然同为大连分离株，却表现出较远的亲缘关系。用DNA Star软件MegAlign程序中的Clustal W method将实验测得的ADV毒株核苷酸序列、ADV参考株序列以及细小病毒其它四个属的代表毒株全序列进行进化树分析，发现14株病毒共划归为五个相对独立的进化分支，ADV与牛犬细小病毒作为细小病毒亚科中新增的属，与其它属的成员分属于不同的进化分支，分析结果验证了ICTV8公布的新分类体系的合理性。选择VP2蛋白主要抗原表位区相对保守的ADV MS-1毒株作为种毒，分别设计合成两对引物，用PCR方法扩增其VP2基因中主要抗原表位区的两个片段，分别将其克隆到原核表达载体pMAL-c2的多克隆位点中，构建重组表达质粒pMAL-VP2a和pMAL-VP2b，经PCR扩增、酶切和测序分析确证其正确插入到表达载体中，阅读框正确，成功地构建了原核表达载体。阳性重组质粒转化宿主菌TB1，用IPTG进行诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE检测和免疫印迹分析。结果表明两段融合蛋白均以包涵体形式获得了有效表达，表达产物分别占总菌体蛋白的32.7％和37.41％；表达产物的分子质量分别约为63kD和65kD，与理论推测的分子质量一致；在终浓度为1mM的IPTG诱导下，4h时其表达量达到高峰：Western blot分析表明表达蛋白能被兔抗MBP抗体所识别。将分离和初步纯化的表达包涵体蛋白作为抗原，对阳性血清进行CIEP检测，验证其免疫活性，并与标准抗原的CIEP检测结果相比较，二者的符合率达到94.3％。以本实验获得的重组蛋白作为诊断抗原的特异性、重复性、敏感性均较好，初步建立了临床诊断方法。总之，本研究对ADV国内分离毒株进行分离鉴定和全序列测定，为研究国内ADV病毒株的进化特点和规律提供基础性资料；在国内首次利用原核表达载体成功地对VP2主要抗原表位区进行表达，并以其为抗原，初步建立了ADV抗体的CIEP检测方法，将为国内养貂场有效开展阿留申病血清学调查提供有效的技术手段，在貂群的净化中发挥巨大的作用。
闫冰[9]2015年在《番鸭细小病毒非结构蛋白B细胞抗原表位的筛选及应用》文中认为番鸭(Cairna moschata),又称疣鼻栖鸭,属于栖鸭类。华盛顿公约(CITES)将其野生种群列入附录叁物种。野生番鸭栖息于热带地区,目前,在墨西哥、巴西和巴拉圭等国有其野生种群。因为番鸭具有较大的经济价值,其人工饲养数量逐年不断增加。番鸭细小病毒病是由番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus, MDPV)引起,以1-3周龄雏番鸭为易感的一种急性传染性、高死亡率的病毒病。耐过鸭往往生长发育迟缓,成为僵鸭,失去其经济价值。该病呈世界范围分布,给番鸭养殖业带来巨大的经济损失。MDPV只有一个血清型,从世界各地分离的病毒仪有微小差异。番鸭感染MDPV后,主要以体液免疫反应为主。B细胞抗原表位决定着机体产生抗体的特异性,是诱导体液免疫的基本单位。但至今国内外对MDPV蛋白的B细胞抗原表位知之甚少。病毒的非结构蛋白是在病毒复制过程中产生的,感染动物会产生抗非结构蛋白的抗体,而灭活疫苗或亚单位疫苗免疫的动物不会产生针对病毒非结构蛋白的抗体。因此可以利用非结构蛋白抗体的存在与否来区分灭活疫苗免疫动物和自然感染动物。为了对MDPV YL08株NS1蛋白(氨基酸序列全长627 aa)进行抗原表位作图,本研究设计了一套覆盖整个NSl蛋白的短肽,这些短肽长为30个氨基酸左右,有10个氨基酸重迭。为了表达这些短肽,共设计合成了31对互补的寡核苷酸片段。每对寡核苷酸片段5’端磷酸化。上述寡核苷酸片段退火后,插入至原核表达载体pET-32a中,经IPTG诱导获得了相应重组蛋白的表达。利用切胶纯化的方法对表达蛋白进行了纯化。纯化蛋白经抗His单克隆抗体鉴定。应用MDPV YL08株人工感染番鸭血清对表达的31个重组蛋白的抗原性进行了检测,Western blot结果表明,表达的融合蛋白NS (481-510)、NS (501-530)、NS (521-550)、NS (541-570)、NS (561-590)、NS (581-610)和NS(601-627)能被MDPV感染血清所识别,而其他融合蛋白不能被MDPV感染血清所识别。综合上述试验结果,MDPV YL08株NS1蛋白的B细胞线性抗原表位区位于NS1蛋白的羧基末端481-627 aa。Dot-ELISA试验结果表明融合蛋白NS(501-530)的抗原性最强。以纯化的融合蛋白NS(501-530)为包被抗原建立了间接ELISA检测方法。确定了灭活疫苗免疫番鸭和自然感染番鸭的临界值为0.300。对240份阳性血清进行检测,阳性符合率为100%。对100份阴性血清进行检测,检测结果为：30份健康番鸭血清中有1份的检测值略高于临界值；70份灭活疫苗免疫血清中有1份的检测值略高于临界值,检测准确率为98.0%。本研究建立的ELISA检测方法与鸭瘟病毒(Duck plague virus, DPV),鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus, DHV)和鸭呼肠孤病毒(duck reovirus, DRV)等阳性血清无交叉反应。敏感性试验结果表明,该ELISA检测方法的敏感性优于中和实验。ELISA的板内及板间变异系数均小于10%,重复性较好。对含有抗原表位NS(501-530)的重组蛋白抗体消长规律分析表明,重组蛋白抗体在番鸭感染MDPV后第1周即可检测到,第3周达到最高峰,以后效价开始略有下降,一直可持续到第12周。上述实验结果可证明该ELISA检测方法可应用于MDPV灭活疫苗免疫番鸭和MDPV自然感染番鸭的鉴别诊断。本研究建立的基于NS蛋白抗原表位的ELISA检测方法,为MDPV的快速诊断、疫情监测、流行病学调查和免疫抗体效价测定提供了一定的技术支持。特别为将来使用灭活疫苗(或重组结构蛋白亚单位疫苗)免疫番鸭时鉴别自然感染番鸭与疫苗免疫番鸭奠定了一定的技术储备。
范朋举[10]2014年在《展示口蹄疫病毒中和表位的猪细小病毒样颗粒组装》文中进行了进一步梳理猪细小病毒(PPV)编码叁种结构蛋白VP1、VP2、VP3,其中VP2蛋白是PPV主要的衣壳蛋白,也是中和作用主要靶蛋白；研究发现用腺病毒或杆状病毒表达系统进行VP2的体外表达,可以在体外自行组装成病毒样颗粒(VLPs), VLPs具有类似天然病毒粒子的构象和诱导产生中和抗体的能力,具有良好的免疫原性。VP2蛋白上存在VLPs组装的非必需区,在这些区域插入外源基因,不影响VLPs的组装,所以VP2蛋白可以作为一种抗原载体,携带外源表位,组装成嵌合表位VLPs,嵌合表位VLPs免疫动物具有双重的免疫效果。根据研究报道P2N端20个氨基酸(aa)与Loop2为PPV VLPs组装的非必需区。为寻找VP2蛋白上潜在的VLPs组装的非必需区,将FMDV中和抗原表位分别插入PPV VP2蛋白的不同位置,模拟对衣壳蛋白结构的影响,最终选择5个位点用于嵌合FMDV中和抗原表位,研究VLPs组装效率。于VP2N端缺失20aa后插入两个T细胞表位(共34个aa),Loop2缺失20aa后插入FMDV主要中和表位(29aa)构建成L2S嵌合表位蛋白；在L2S基础上分别于VP2Loop1、160aa后、C端第548aa后再嵌合不同长度的FMDV中和表位,构成插入不同长度中和表位的嵌合蛋白,分别命名为L2S1、L2S160与L2SC。根据嵌合表位VP2蛋白氨基酸序列进行基因的优化设计,合成与修饰改造,插入杆状病毒表达载体,研究重组蛋白表达与VLPs的组装效率。将L2SL2S1L2S160与L2SC蛋白编码基因插入pFastBaTMDual载体,转化DH10BacTM感受态菌构建成重组杆粒；重组杆粒转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒；传至第3代病毒经PCR扩增鉴定外源基因未丢失；用病毒噬斑试验确定重组病毒滴度;采用10个MOI病毒感染High FiveTM细胞进行蛋白的表达；表达的蛋白经间接免疫荧光和Western-Blot试验证明外源基因在High FiveTM细胞成功表达,蛋白经硫酸铵沉淀纯化后,进行蔗糖密度梯度离心,电子显微镜观察VLPs的形成。初步试验结果表明：L2S与L2S160嵌合表位VP2蛋白可组装产生VLPs,而其他两种嵌合表位蛋白没有可见的VLPs结构,仍需要进一步观察确认。说明N端缺失20aa后插入34个aa的T细胞表位、Loop2缺失20aa后插入29aa的中和表位后可组装产生VLPs结构,VP2160位五重轴肩部位置也可以嵌合长度为23aa的外源表位。组装成的VLPs结构大小约为30nm,电子显微镜下呈球形,形态大小与全病毒粒子相似。而Loopl与C端嵌合口蹄疫中和表位后未见VLPs,可能是因为插入的中和抗原表位影响PPV VP2的空间构象,使氨基酸之间的作用力改变,不能形成稳定的VLPs结构。同时,为了检测表达的嵌合VLPs免疫动物后的PPV抗体水平,利用原核表达的VP2蛋白主要抗原表位区(248～579aa)建立了检测VP2抗体的ELISA方法。根据对不同背景猪血清的检测,确定了PPV抗体的间接ELISA方法的临界值为0.18,抗体效价大于0.18可定性判定为PPV抗体阳性,通过与商品化试剂盒对比,证明该方法可用于PPV免疫动物的免疫效果检测评估,具有较好的敏感性与特异性。本研究为嵌合FMDV中和表位的PPV VLPs亚单位疫苗的研究奠定了基础。
参考文献：
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[2]. 猪细小病毒VP_2蛋白主要抗原域的原核表达与表达产物纯化[D]. 李霆. 南京农业大学. 2002
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[4]. 猪细小病毒VP2蛋白主要抗原表位基因的原核表达及应用[C]. 李斐, 任雪枫, 郑其升, 魏建超, 曹瑞兵. 第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集. 2005
[5]. 猪细小病毒VP2蛋白的主要抗原表位基因的原核表达及检测应用[J]. 李斐, 曹瑞兵, 周斌, 郑其升, 魏建超. 中国病毒学. 2005
[6]. 博卡病毒MVC结构蛋白VP2多克隆抗体的制备与鉴定[D]. 马婧. 宁夏医科大学. 2016
[7]. 猪乙型脑炎病毒—细小病毒—伪狂犬病毒活载体疫苗的研究[D]. 陈弟诗. 四川农业大学. 2011
[8]. ADV分离株全基因序列测定及VP2抗原表位区的表达与应用[D]. 梁冬莹. 东北林业大学. 2007
[9]. 番鸭细小病毒非结构蛋白B细胞抗原表位的筛选及应用[D]. 闫冰. 东北林业大学. 2015
[10]. 展示口蹄疫病毒中和表位的猪细小病毒样颗粒组装[D]. 范朋举. 中国农业科学院. 2014
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