龚娅[1]2000年在《弓形虫P30三种表达形式重组质粒的构建及遗传免疫效果的初步测试》文中指出背景：弓形虫是一种专性细胞内的寄生原虫，呈世界性分布，能引起人兽共患的弓形虫病。全世界约有1/3的成年人感染弓形虫。若孕妇感染弓形虫，则虫体可经胎盘传给婴儿，导致流产、畸胎；而在肿瘤患者、AIDS病人等免疫功能严重受损者，作为一个主要的机会致病因子，弓形虫是引发致死性病变的主要病原之一。因此，为了防治弓形虫病，迫切需要研制出一行之有效的弓形虫疫苗。已有研究表明，弓形虫的主要表面抗原P30具有很强的免疫原性，是非常理想的候选疫苗分子。与传统疫苗相比，90年代发展起来的核酸疫苗技术因其潜在的优势使其得到迅速而广泛的应用。目前，弓形虫核酸疫苗的研究也取得了一些进展，已经证实用编码弓形虫P30抗原的质粒DNA进行核酸免疫，能够引起特异性的抗感染免疫应答，但是，弓形虫P30基因不同表达形式的重组质粒所产生的免疫效果如何，尚不得而知。 目的：通过构建含弓形虫P30基因不同表达形式（膜型、分泌型及细胞内型）的重组质粒，并将其免疫小鼠，测定抗体水平，以期初步筛选出一种对弓形虫感染具有良好保护作用的核酸疫苗分子。 方法：1、弓形虫表膜型P30基因重组质粒的构建：设计并合成了一对引物，利用PCR技术，从弓形虫ZS1株的基因组DNA中扩增出完整的P30编码序列（包括信号肽及疏水尾），将其克隆到真核表达载体pcDNA中，构成pcDNA3-P30Mb。 2、弓形虫分泌型P30基因重组质粒的构建：回收纯化PCR扩增的P30基因片段，用PstI切去C端的疏水氨基酸序列，再克隆到pcDNA中，构成pcDNA3-P30Se。 3、弓形虫细胞内型P30基因重组质粒的构建：用限制性内切酶EcoRI和BamHI将重组质粒pBV220-P30In的小片段切下，亚克隆到pcDNA中，目为pcDNA3-P30In。 4、将质粒DNA与lipofectin以5:2的比例混合，经小鼠股四头肌注射，5ug/只。2周后，加强注射一次。分别于免疫前及免疫后2周、4周、6周自小鼠尾静脉采血，用Westernblot和ELISA检测IgG抗体水 5、诱导含昨T－A SP30 A PI的工程菌表达 P30蛋白并纯化，免疫印D 迹测定其免疫活性，以用于检测小鼠血清中的特异性抗体。同时，对纯DD 化条件进行优化。Dl 结果：l、经双酶切鉴定及DNA序列测定，三种重组质粒中的插入 ll 片段确为弓形虫P30的编码基因且读码框架正确。l12、小鼠血清中IgG抗体的检测：免疫印迹显示，免疫后2周，除lD 细胞内型重组质粒免疫组外，膜型及分泌型兔疫组均出现较弱的反应D 带，且前者显色略浅，在免疫后4周和6周，三个兔疫组均显示IgG抗 体反应带，且各组之间颜色深浅无明显差异。另一方面，从IgG抗体产l 生的时间进程来看，免疫后2周，抗体反应带较弱，而在免疫后4周和l16周，抗体反应显著增强，同时也可看出，4周和6周的反应带深浅无l 明显变化。ELISA定量结果显示，空载体pCDNA3注射组与三种重组质D 粒注射组之间有显著性差异o功刀5），说明弓形虫P3O基因的重组质D 粒确实能够诱导机体产生特异性抗体；免疫后2周，pcDNA3I30In注 射组与PcDNA3P30Mb和PcDNA3I30Se注射组之间的差别具有显著。＠u＜0．05），thegM＃ZredIBARgH0＞0．05）；the＆＆s 4 N和～16周，三个免疫组之间的 IgG抗体水平无显著性差异0＞0．05）；同 l ＃，）A IgG ftWPI％rtfedsfg＄％，m＆ti 2 MghffiW7k4K（ff，f～l 了第4周和6周时，各免疫组的IgG抗体均较二周时明显增加，但4周ll 和 6周之间的 IgG抗体水平无明显变化0＞0．05），表现为一平台期。l13、纯化蛋白能与弓形虫病人阳性血清反应，出现了特异性反应lIw。l14、经免疫印迹显示，浓缩至初始体积的1／3刁历时，纯化蛋白的反”lD 应带颜色最深，说明此时有活性的纯化蛋白的浓度最高。D 结论：l、成功地构建了弓形虫P30基因三种表达形式的重组质D 粒。D12、用编码P30抗原的重组质粒进行核酸免疫，能够诱导免疫小鼠 l 产生特异性的IgG抗体。膜型及分泌型重组质粒诱导IgG抗体的出现先 于细胞内型。但随着时间延长，其抗体水平无明显差别。因此，就产生IIgG抗体而言，三种重组质粒的免疫效果是基本相同的。l 3、本方法表达纯化的P30蛋白具有免疫学活性，可用于体外检 测。在纯化过程中，最佳浓缩程度是浓缩至初始体积的1／3－l／6，此时，D 有活性的纯化蛋白浓度最高。
王琼[2]2007年在《弓形虫缓殖子期特异性抗原的基因克隆、蛋白表达及重组BAG1抗原的初步应用》文中提出研究背景：刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种细胞内寄生的单细胞原虫，能感染几乎所有恒温动物(包括人类)，引起人兽共患的弓形虫病。此虫呈世界性分布，估计全世界成年人中至少有1／3的人感染。弓形虫作为一种机会性致病原虫，在免疫功能正常的宿主体内通常形成包囊，造成隐性感染，短则数月，长则数年甚至终生寄生在人体。而一旦机体免疫功能下降(如肿瘤患者、器官移植者及AIDS患者等)，处于隐性感染状态的虫体就会活化，迅速增生繁殖，在宿主体内播散引起弓形虫病甚至导致宿主死亡。妇女在妊娠期初次感染弓形虫可引起流产、畸胎、死胎，或引起胎儿先天性弓形虫病，表现为智力低下、视网膜脉络膜炎、失明等，这些症状可在胎儿出生时或是成长过程中出现。因此，弓形虫病的诊断及疫苗研制对于保护特殊易感人群以及促进人类优生优育具有重要意义。弓形虫机会性致病的生物学基础是速殖子和缓殖子的相互转换，弄清楚相互转换的机制对于控制弓形虫病有重要意义。速殖子与缓殖子相互转换的过程主要是不同期特异性抗原分子的表达的过程，因此这些特异抗原分子的确定是研究转换机制的先决条件，克隆期特异抗原基因即为研究转换机制创造条件。由于速殖子容易获得，便于对其进行研究，许多弓形虫基因已从速殖子中克隆、鉴定，其中大多数基因编码的蛋白为速殖子与缓殖子共有的，只有少数几个被证实为速殖子期特有的，近年来，由于速殖子与缓殖子相互转换机制引起研究者重视，一些缓殖子及包囊特有的蛋白的基因也已被克隆、鉴定。本研究对缓殖子期特异性抗原BAG1与SAG4进行基因克隆、蛋白表达以及对重组抗原的免疫反应性进行分析；进一步优化蛋白的表达条件，纯化表达蛋白以获得大量高纯度的重组蛋白，为进一步的研究创造了条件。并且探讨重组抗原作为新型诊断抗原的可能性；进一步筛选、鉴定针对重组BAG1的单克隆抗体，为弓形虫缓殖子的进一步研究打下基础。目的：1．克隆与表达弓形虫缓殖子期特异抗原BAG1、SAG4的基因，并分析重组表达抗原的免疫反应性；2．纯化表达蛋白，获取大量高纯度的重组抗原，探讨重组抗原在弓形虫病诊断上的应用；3．制备、鉴定抗重组BAG1的单克隆抗体，为弓形虫缓殖子的进一步研究打下基础。方法：1．诱导体外培养的RH株弓形虫速殖子向缓殖子转化，采用RT-PCR从缓殖子中扩增BAG1基因片段；采用PCR从弓形虫基因组DNA中扩增SAG4基因片段；2．利用酶切、连接反应构建pMD 18-T-BAG1重组质粒、pGEX4T-1-SAG4重组质粒，并进行测序分析；3．利用限制性内切酶双酶切pMD 18-T-BAG1，切下BAG1基因片段插入以同样限制性内切酶双酶切的质粒pET32a(+)中，构建表达重组质粒pET32a(+)-BAG1，并对重组质粒进行酶切及测序鉴定；4．将重组质粒pET32a(+)-BAG1、pGEX4T-1-SAG4分别转入BL21(DE3)中，用IPTG诱导表达；5．优化工程菌pET32a(+)-BAG1／BL21、pGEX4T-1-SAG4／BL21的表达条件，大量诱导表达后对重组蛋白进行纯化；6．Western blotting与ELISA分析重组表达蛋白的免疫反应性；7．通过ELISA试验，用重组抗原对人血清进行检测；8．应用杂交瘤技术，将小鼠SP2／0细胞与经重组BAG1免疫的小鼠脾细胞融合，筛选抗重组BAG1的单克隆抗体，并进行鉴定。结果：1．克隆了弓形虫缓殖子期特异抗原BAG1、SAG4的编码基因；2．成功构建克隆重组质粒pMD18-T-BAG1与表达重组质粒pET32a(+)-BAG1，pGEX4T-1-SAG4，通过IPTG诱导得到以可溶性形式高效表达的重组BAG1与主要以包涵体形式表达的重组SAG4，Western blotting分析显示重组BAG1、重组SAG4均具有特异的免疫反应性；3．用重组BAG1检测350份人血清中弓形虫IgG抗体，结果显示其阳性率高于对照的重组SAG1检测的阳性率，P=0.033；两种重组抗原检测的总阳性率为23.14％；4．筛选了四株针对重组BAG1的单克隆抗体，Western blotting结果显示四株单克隆抗体与弓形虫BAG1抗原具有良好的免疫反应性。结论：1．首次从碱诱导法培养的弓形虫RH株中，克隆出缓殖子期特异抗原BAG1和SAG4的基因编码序列；2．在大肠埃希菌中分别以可溶性形式与包涵体形式高效表达了BAG1基因与SAG4基因，重组表达抗原均具有特异的免疫反应性；3．将重组BAG1应用于人弓形虫感染的检测，结果显示缓殖子期特异抗原可能可以特异检测弓形虫的慢性感染；4．筛选、鉴定的四株抗重组BAG1的单克隆抗体，可进一步应用于弓形虫缓殖子的研究。附篇一种广州管圆线虫新基因——胶原蛋白全长cDNA序列的克隆、鉴定及生物信息学分析研究背景：广州管圆线虫病(Anglostrongyliasis)是由广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)幼虫寄生于人体中枢神经系统而引发的疾病。近年来，由于不少人喜欢生食或半生食水产品，使得广州管圆线虫病的发病率在明显上升。作为一种新发传染病的病原，广州管圆线虫的许多生物学特性，尤其是分子生物学方面，还未被人们所认知。鉴于广州管圆线虫在人体的感染和致病阶段主要为幼虫，本研究根据广州管圆线虫幼虫的cDNA文库表达序列标签(expression sequence tag，EST)测序结果，采用PCR技术克隆并鉴定了广州管圆线虫胶原蛋白(Collagen，COL)基因的全长cDNA序列，为广州管圆线虫病的分子生物学诊断创造条件；并构建了新基因的原核表达重组质粒，为下一步的深入研究创造了条件。目的：1．克隆、鉴定广州管圆线虫(A．cantonensis)新基因——胶原蛋白(Collagen，COL)基因。2．对新基因进行鉴定和生物信息学分析。3．构建重组克隆质粒pMD18-T—AcCOL与重组表达质粒pET32a(+)—AcCOL。方法：1．根据表达序列标签(Expression sequence tag，EST)中部分序列和文库载体序列设计引物，采用PCR技术从广州管圆线虫幼虫的cDNA文库中分段扩增cDNA序列，用DNAMAN软件拼接分段扩增的序列以得到全长cDNA序列。2．用多种生物信息学软件对cDNA全长序列进行同源性搜索与结构分析。3．根据cDNA全长序列，设计新的引物从文库中扩出包含胶原蛋白全长开放阅读框(Open reading frame，ORF)的cDNA片段，PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体上并测序。重组T载体经双酶切后切下的新基因AcCOL，再亚克隆到原核表达质粒pET32a(+)中。结果：1．克隆了一个广州管圆线虫新基因的全长cDNA序列。2．序列比对、蛋白结构域搜索及结构分析结果显示，该新基因所编码的蛋白质具有胶原蛋白的性质。3．构建的新基因重组质粒经双酶切与测序证明目标片段已插入质粒载体中，且插入序列与读码框正确。结论：克隆并鉴定了广州管圆线虫新胶原蛋白基因，构建了该基因的克隆重组体pMD18-T—AcCOL与原核表达重组体pET32a(+)-ACCOL。
吴焜[3]2007年在《弓形虫速殖子与缓殖子体外相互转化模型的建立及可调性RNA干扰的初步研究》文中认为刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种呈世界性分布的专性细胞内寄生原虫，可寄生在除红细胞外的几乎所有有核细胞中，引起人兽共患的弓形虫病。弓形虫是一种机会性致病原虫，机体免疫功能正常者感染弓形虫一般没有明显症状，为隐性感染状态。但对于免疫功能受损或缺陷者，如肿瘤病人，AIDS患者等，弓形虫在患者体内可以大量增殖，引起全身播散性损害，严重者可导致死亡。此外，妊娠期感染弓形虫可通过胎盘垂直传播，引起早产、流产、死胎、畸胎或婴儿发育畸形等。近年来，由于艾滋病的广泛流行和宠物饲养的逐渐增多，弓形虫的危害也日益突出，弓形虫感染成为一个严重的公共卫生问题。弓形虫速殖子与缓殖子的相互转化，是弓形虫致病的中心环节。速殖子可引起宿主的急性感染，而包囊内的缓殖子是形成慢性感染的主要形式，弓形虫速殖子与缓殖子相互转化的机制尚不清楚。目前弓形虫病的治疗尚无特效药物，主要以乙胺嘧啶，乙酰螺旋霉素等药物为主，这些药物对速殖子有杀灭、抑制作用，而对包囊内的缓殖子几乎没有作用。但包囊内缓殖子的活化，能对宿主造成极大的危害。因此，探讨弓形虫速殖子与缓殖子相互转换机制的研究成为弓形虫病研究的热点和难点之一。近年来，以RNA干扰和转基因技术为基础的反向遗传学的发展，为我们提供了一个从基因变化分析基因功能的方法。本研究综合目前弓形虫速殖子与缓殖子相互转化的研究现状及研究中存在的主要问题，采用Transgenesis、RNAi和Reverse genetics的原理和方法，建立弓形虫RH株速殖子与缓殖子体外相互转化的细胞模型，克隆转化早期差显基因的编码序列，构建弓形虫热休克蛋白70(HSP70)基因启动子驱动的反向重复序列RNAi载体系统，建立一套进行弓形虫基因功能分析的Reverse Genetics技术平台，并选取在速殖子向缓殖子转化早期开始表达的基因进行重点分析，以阐明这些分子在速殖子向缓殖子转化过程中的功能与作用。一、弓形虫体外速殖子与缓殖子相互转化模型的建立小鼠腹腔接种弓形虫RH株速殖子，3-4天后收集小鼠腹腔液，用国产4.5号针头注射器反复抽吸虫体悬液破裂宿主细胞释放虫体，虫体悬液用孔径3μm的滤膜过滤纯化速殖子，速殖子纯度可达98％以上。将纯化的弓形虫RH株速殖子按照1：10的比例，接种于NIH3T3细胞单层(NIH3T3细胞单层生长达到60％-70％时接种速殖子，培养基含5％新生牛血清)，置于37℃，5％CO_2的培养箱中培养，速殖子增殖迅速，大量破坏宿主细胞，培养5-6天后收集弓形虫速殖子，进行分瓶培养或实验研究。为探索碱性条件下弓形虫速殖子向缓殖子的诱导转化，按照1：10比例将RH株速殖子接种NIH3T3细胞单层，接种4h后，用pH8.1的DMEM培养基轻轻冲洗细胞单层以移去未侵入细胞的弓形虫速殖子，再加入pH8.1的DMEM培养基(含2.5％新生牛血清)置于37℃空气中培养96h。镜下观察可见NIH3T3细胞胞浆中出现大小不等的圆形囊性小体，囊壁折光性较强。收集培养虫体提取总RNA，采用RT-PCR的方法进行缓殖子期特异抗原缓殖子抗原1(BAG1)mRNA的检测，结果得到700bp左右目的条带，PCR产物克隆到T载体后测序，测序结果与已发表的BAG1基因mRNA同源性高达99.3％，无基因组DNA内含子序列，结果表明成功诱导缓殖子的形成。为监测速殖子向缓殖子转化进程，在诱导第0、24、48、72、96小时，分别取出一瓶培养虫体，提取总RNA，以弓形虫β—微管蛋白的mRNA RT—PCR产物为参照，进行半定量RT—PCR扩增BAG1基因mRNA，结果显示，随着诱导时间的延长，BAG1 mRNA的转录水平逐渐提高，表明随着诱导时间的延伸，有更多的弓形虫速殖子转化成缓殖子。为诱导缓殖子向速殖子的转化，将pH8.1碱性条件诱导形成的缓殖子恢复pH7.2培养基及正常培养条件，24h后可见溶液中出现游离弓形虫速殖子，2-3天后速殖子开始大量增殖，需适当补充NIH3T3细胞才能继续培养。为探索热休克对弓形虫速殖子向缓殖子的转化影响，将常规培养的NIH3T3细胞分别放入37℃，39℃，41℃，43℃，5％CO_2培养箱中培养3h后，按照1：10比例接种纯化的RH株速殖子，接种4h后，用相应温度预热的DMEM培养基轻轻冲洗细胞单层，以移去未侵入细胞的弓形虫速殖子后，分别放置在37℃，39℃，41℃，43℃，5％CO_2培养箱中培养48h，收集培养混合物，提取总RNA，进行RT-RCR。结果表明39℃诱导条件下，速殖子增殖较快，不能诱导形成缓殖子，39℃诱导条件还是适于速殖子的生长条件。43℃诱导条件下，NIH3T3宿主细胞难以生长，不能为弓形虫速殖子提供一个稳定的细胞内环境，不利于弓形虫RH株速殖子向缓殖子的转化。41℃诱导条件下，NIH3T3宿主细胞变性坏死相对较慢，能为弓形虫速殖子提供一个相对稳定的细胞内环境，弓形虫RH株速殖子能诱导转化为缓殖子。二、弓形虫可遗传及可诱导的RNAi载体系统的构建1．弓形虫主要表面抗原1(SAG1)基因启动子驱动的绿色荧光蛋白基因载体的构建：构建该载体的目的是一方面作为转基因弓形虫的一种荧光筛选标志，另一方面作为转基因弓形虫是处于速殖子或缓殖子，还是两者之间中间状态的一种指示。设计引物，通过PCR分别扩增SAG1基因5'UTR启动子序列(SAG1／5UTR)、SAG1基因3'UTR序列(SAG1／3UTR)及绿色荧光蛋白编码序列(eGFP)，通过酶切连接，构建弓形虫SAG1基因启动子驱动的绿色荧光蛋白基因载体pBSK-SAG1／5UTR-eGFP-SAG1／3UTR(pBSK-SAG1／GFP)，序列测定结果正确。2．弓形虫可诱导的反向重复序列RNAi载体的构建：设计引物，通过PCR分别扩增弓形虫HSP70基因5'UTR启动子序列(HSP70／5UTR)、HSP70基因3'UTR序列(HSP70／3UTR)及β-微管蛋白基因内含子C序列(IntronC)，通过酶切连接，构建以弓形虫热休克蛋白HSP70基因启动子进行驱动的，以β-微管蛋白基因内含子C序列作为间隔序列，以HSP70基因3'UTR序列作为转录终止信号的反向重复序列RNAi载体pBSK-HSP70／5UTR-IntronC-HSP70／3UTR，序列测定结果正确。3．弓形虫可遗传及可诱导的RNAi载体系统的构建：利用载体pHANA-0.5具有弓形虫穿梭载体的功能，将载体pBSK-SAG1／GFP中的SAG1／5UTR-eGFP-SAG1／3UTR片段克隆到载体pBSK-HSP70／5UTR-IntronC-HSP70／3UTR中形成载体pBSK-GFP-Hairpin，再将该载体中的GFP-Hairpin片段克隆到载体pHANA-0.5中形成弓形虫可遗传及可诱导的RNAi载体系统pHANA-hairpin，序列测定结果正确。4．弓形虫SAG1基因RNAi载体的构建：为对弓形虫SAG1基因进行RNAi，设计引物，通过PCR分别扩增SAG1基因的正向和反向序列，通过酶切连接，将正向和反向序列克隆到载体pHANA-hairpin相应酶切位点，构建SAG1基因RNAi载体pHANA-hairpin／SAG1，序列测定结果正确。5．弓形虫BAGl基因RNAi载体的构建：为对弓形虫BAG1基因进行RNAi，设计引物，通过PCR分别扩增BAG1基因的正向和反向序列，通过酶切连接，将正向和反向序列克隆到载体pHANA-hairpin相应酶切位点，构建BAG1基因RNAi载体pHANA-hairpin／BAG1，序列测定结果正确。三、转基因弓形虫品系的建立及RNAi初步研究分别将质粒pHANA-hairpin／SAG1和pHANA-hairpin／BAG1通过电转化导入弓形虫RH株速殖子获得两个转基因弓形虫品系。将1X10~7弓形虫速殖子和质粒DNA 10μg重悬于800μl电击缓冲液cytomix中。在4mm间隙电穿孔杯中以电压0.4kv，电容800μF电击1次，时间延迟为6-9msec。转染弓形虫培养24h后，在荧光倒置显微镜下观察，两个品系转基因弓形虫均可观察到绿色荧光的表达，分别提取两个品系转基因弓形虫速殖子总RNA，进行RT-PCR，结果均能检测到GFP基因的转录，证明质粒成功导入弓形虫速殖子并进行了表达。将两个品系转基因弓形虫速殖子进行碱性环境(pH8．1)诱导，诱导培养96h后，在荧光倒置显微镜下观察，均可观测到有绿色荧光表达，分别提取两个品系转基因弓形虫诱导后虫体总RNA，进行RT-PCR，结果均能检测到SAG1、BAG1及GFP基因的转录。出现这种现象可能的原因有：1．部分转基因弓形虫速殖子未转化为缓殖子；2．部分转化的转基因弓形虫处于一种速殖子与缓殖子的中间状态，未形成成熟的缓殖子和包囊；3．诱导干扰的SAG1基因或BAG1基因可能对速殖子向缓殖子转化过程有影响，使得转基因弓形虫仍处于速殖子状态，这些问题尚需进一步研究。
蔡力汀[4]2003年在《弓形虫核酸疫苗pcDNA_3/GRA_1的研究》文中指出目的：构建弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)真核表达质粒，并观察重组质粒DNA接种诱导的保护性免疫应答。 方法：1、用免疫兔血清和2个单克隆抗体筛选弓形虫速殖子cDNA文库，对阳性克隆进行序列分析；2、采用聚合酶链反应(PCR)扩增出编码GRA1目的基因，用EcoRⅠ／XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切，将GRA1定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ／XhoⅠ位点；对重组质粒进行PCR扩增、双酶切初步鉴定后作序列测定；3、大量制备并提取重组质粒pcDNA3／GRA1，肌肉注射法免疫小鼠；用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测特异性抗体水平及PCR检测不同组织DNA中GRA1基因；用免疫荧光法(IFA)检测GRA1蛋白在肌肉组织中的表达；用弓形虫RH株速殖子攻击感染免疫鼠，并观察其存活时间。 结果：1、通过筛选弓形虫cDNA文库，共获得12个阳性克隆。经序列测定发现插入片段的大小在450bp-2400bp之间，查询所有基因库并经EPAS(Expert Protein Analysis System)软件分析鉴定出 3个新的基因，分别命名为Toxo-W5，Toxo-W2，Toxo-W4(GenBank登录号分别为AY223538，AY238892，AY208994)；2、成功构建重组质粒pcDNA3／GRA1，DNA序列测定结果表明将大小为573bp的GRA1片段定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ／XhoⅠ位点；3、经pcDNA3／GRA1免疫的小鼠血清中检测到特异性抗体，以不同组织DNA为模板特异地扩增出GRA1编码基因，用弓形虫免疫兔血清经IFA检测pcDNA3／GRA1免疫的小鼠肌肉组织呈阳性反应，用弓形虫强毒株速殖子攻击感染经pcDNA3／GRA1免疫的小鼠，存活时间明显延长。 结论：从弓形虫cDNA文库中分离3个新基因；成功构建了pcDNA3／GRA1真核表达质粒，初步结果显示用pcDNA3／GRA1质粒DNA免疫小鼠可诱导特异性免疫反应，且对弓形虫强毒株的攻击感染产生一定的保护性。
杨培梁[5]2007年在《弓形虫多表位基因的疫苗研究及其重组抗原在免疫诊断中的应用》文中进行了进一步梳理第一部分弓形虫多表位疫苗研究1．疫苗的制备构建弓形虫多表位基因在真核表达系统中的表达质粒pCDNA3-MAG。以试剂盒大量纯化质粒pcDNA3-MAG、pcDNA3-SAG1和pcDNA3，用于制备核酸疫苗。以脂质体作为免疫佐剂，增强疫苗的免疫效果。诱导并纯化弓形虫MAG的原核表达重组抗原(rMAG1)、SAG1的原核表达重组抗原(rSAG1)及载体质粒pET32a表达的硫氧还蛋白(Trx)，作为DNA疫苗的加强免疫疫苗。2．动物免疫以BALB／C小鼠为免疫对象，按照疫苗的构成和免疫方式不同，将实验动物分为DNA疫苗免疫系列和“基础-加强”免疫系列，前者均以MAG的DNA疫苗进行免疫，后者先以MAG的DNA疫苗免疫，再以重组抗原rMAG进行增强免疫。每系列均设SAG1免疫组、载体对照组和空白对照组。3．免疫应答及免疫保护性小鼠免疫前及末次免疫后第1周、第3周、第5周，分别采集血清，以ELISA试剂盒检测各组小鼠的抗弓形虫IgG抗体、IFN—γ和IL—4含量，末次免疫后6w，以RH株弓形虫速殖子感染小鼠(200个／只)，统计各组小鼠的存活时间和存活率。综合各项检测指标进行统计分析后，结果如下：DNA疫苗实验结果显示，同免疫前、载体对照组和空白对照组相比，MAG的DNA疫苗刺激小鼠产生了特异性抗弓形虫IgG抗体和高水平IFN—γ，而与SAG1组比较，无显著性差异；在对抗致死剂量弓形虫的感染上，同SAG1免疫组、载体对照组和空白对照组相比，MAG组小鼠不仅延长了存活期，还有1只存活90天以上(存活率为8.3％)。DNA疫苗初免、重组抗原疫苗加强免疫的实验结果显示，同免疫前、载体对照组和空白对照组相比，MAG组小鼠产生了特异性抗弓形虫IgG抗体和高水平IFN—γ，与SAG1组比较，IFN—γ含量无显著性差异，但IgG抗体水平有显著差异，MAG组高于SAG1组；在对抗致死剂量弓形虫的感染上，同载体对照组和空白对照组相比，MAG组小鼠不仅显著延长了存活时间，还有4只存活90天以上(存活率为33.3％)，同SAG1免疫组相比，小鼠存活时间无显著性差异，但存活率高于SAG1组的16.7％。就MAG疫苗的两种不同免疫方式——DNA疫苗单独免疫和DNA疫苗初免、重组抗原疫苗加强免疫——进行比较，二者激发的体液、细胞免疫存在非常显著性差异，后者显著高于前者；在对抗致死剂量弓形虫的感染上，两组小鼠的存活时间具有非常显著性差异，后者显著高于前者；两组均有小鼠存活存活90天以上，前者为1只，存活率为8.3％，后者存活4只，存活率为33.3％。结果显示先以DNA疫苗初免、再以重组抗原疫苗加强免疫，较单纯DNA免疫，获得了更好的免疫保护效果。实验中，以弓形虫强保护性抗原SAG1(P30)作为多表位疫苗的平行对照，结果表明多表位疫苗的免疫效果在整体上优于SAG1基因疫苗，尽管后者也获得了较好的免疫保护性(如以其基因的DNA疫苗初免、以其重组抗原疫苗加强，使免疫的小鼠获得了16.7％的存活率)。为了验证弓形虫多表位疫苗在免疫小鼠后各表位的表达和呈递，分别制备了三种重组抗原rSAG1、rGRA2、rROP2，以Western-blot检测小鼠免疫血清和上述重组抗原的特异性结合反应。结果显示，以两种方式免疫后的小鼠血清，均可被上述三种重组抗原所特异识别，表明多表位基因所包含的表位在小鼠体内得到了有效的表达和呈递，并激发了特异的体液免疫反应。本实验中，以弓形虫RH株感染小鼠，空白对照组小鼠在7天内全部死亡。而以MAG的基因疫苗免疫小鼠，小鼠的存活时间显著延长，且有8.3％的小鼠存活90天以上；以DNA疫苗初免、重组抗原疫苗加强免疫小鼠，33.3％的的小鼠存活90天以上。以上结果表明该疫苗具有良好的免疫保护性，验证了以多表位的方法制备弓形虫病疫苗、以复合免疫的方式增强免疫效果的可行性。第二部分重组多表位抗原在免疫诊断中的初步应用1．弓形虫感染小鼠血清的制备及鉴定以B36株弓形虫感染小鼠，采集血清，以ELISA和Western—blot检测抗弓形虫IgG抗体，直接镜检脑内包囊或腹腔速殖子，共获得17只小鼠的感染血清，效价最高可达1：51200。2．弓形虫多表位重组抗原的可溶性表达、纯化及鉴定大量诱导表达可溶性的弓形虫多表位重组抗原(rMAG)，以Ni-NTA agarose和割胶电渗对其进行两步法纯化，最后得到了纯度达95.86％的rMAG。免疫印迹实验证明，弓形虫多表位重组可溶性抗原不仅能够被弓形虫强毒株RH感染的兔血清及抗弓形虫速殖子主要表面抗原SAG1(P30)的单抗所识别，而且能被成囊株弓形虫B36株慢性感染的小鼠血清所识别，提示该抗原既含有弓形虫速殖子抗原表位，也含有缓殖子包囊抗原表位。3．弓形虫多表位重组抗原在检测弓形虫感染中的应用以弓形虫感染血清为一抗，筛选重组弓形虫多表位抗原的最佳包被浓度为3μg／ml，用于制备ELISA检测试剂盒。检测小鼠血清141份，其中阳性小鼠感染血清为117份、正常小鼠血清24份，结果显示，该试剂盒敏感性为88.88％(104／117×100％)，特异性为91.67％(22／24×100％)，一致性为89.36％((104+22)／141×100％)。检测兔血清24份，其中急性感染弓形虫的兔血清18份，正常兔血清6份，阳性血清检出率为94.4％，总一致性为91.5％((17+5)／24×100％)。以上结果显示，弓形虫多表位抗原试剂盒既可以检测弓形虫急性感染血清，又可以检测弓形虫慢性感染血清，初步证实了多表位抗原用于弓形虫感染诊断中的优势，为试剂盒的下一步应用奠定了基础。
吴翔[6]2007年在《具有潜在疫苗价值的弓形虫新基因wx2，wx的筛选与鉴定》文中指出研究背景:弓形虫是一种专性细胞内寄生的机会致病原虫,生活史复杂,涉及的组织器官多,可引起人兽共患的弓形虫病。其危害严重程度在再现疾病之中仅次于结核;孕妇感染弓形虫可引起流产、早产、畸胎、死胎,婴幼儿先天性弓形虫病,小儿智力障碍等,对人口素质和优生优育和计划生育有严重影响。近年来,弓形虫脑炎已成为艾滋病患者的主要死亡原因之一;也是器官移植患者死亡和精神病发病的主要原因之一。危害如此严重,诊断、治疗和预防却还存在很多问题亟需解决。治疗尚无十分理想的药物,采用的化学药物有治疗周期长,药物毒副作用大,不能根治等缺陷,加上至今还无一种药物能够杀灭包囊内的虫体,加之弓形虫的重复感染十分迅速,故虽经多方面的努力,弓形虫病仍未得以很好地遏制。因此,研制有效的新药和安全高效的弓形虫病疫苗,已成为人们的迫切要求,而廉价、安全、高效的疫苗无疑是最为经济、实用的防治措施。弓形虫病疫苗候选分子的筛选一直是研究中的瓶颈,也是研究的焦点和热点。本工作在前期研究的基础上进一步筛选、鉴定更有效的疫苗候选基因或药物分子靶标,制备核酸疫苗进行动物实验并阐明这个基因的功能、作用机制及其潜在的应用价值。研究目的:(1)通过制备具有保护性的单克隆抗体,筛选、鉴定弓形虫病疫苗的新的候选基因。(2)构建该基因的DNA疫苗,观察其动物保护效果以及对宿主机体免疫系统的影响。(3)应用RNA干扰技术,使获得的候选基因在转录后水平沉默,从而使其所表达的蛋白下降或者缺失,以期进一步阐明该基因的功能和作用机制,对该基因的应用前景进行评估,并希望得到弓形虫的减毒虫株,用于制备减毒活疫苗。研究方法:(1)应用杂交瘤技术获得抗弓形虫的单克隆抗体,体内外实验观察其保护性效果。以弓形虫单克隆抗体作为探针免疫筛选弓形虫速殖子cDNA文库,获得其对应的基因序列。经Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST和(http://www.toxodb.org/ToxoDB.html.)进行同源性比较,登录GenBank并获得新基因登录序列号。(2)采用双色免疫荧光抗体定位和真核细胞内表达等方法对该基因编码的蛋白质进行鉴定,应用生物信息学对基因编码蛋白的B细胞表位、氨基酸序列、蛋白质结构等进行预测和同源性分析。(3)以携带wx2基因的pBluescript7C3-C3质粒DNA为模板,通过PCR扩增基因wx2的ORF;以携带wx基因的pBluescript2B9-G1质粒DNA为模板,经PCR扩增获得wx基因的ORF,构建wx2和wx新基因的DNA疫苗并免疫昆明小鼠,观察小鼠死亡时间和检测实验动物的淋巴细胞转化率、脾细胞CD_4~*与CD_8~+淋巴细胞比值、IFN-γ、血清特异抗体等,以期阐明对机体免疫系统的影响。(4)应用RNA干扰技术构建新基因wx2,wx逆病毒表达载体,与真核表达质粒pcDNA3-wx2,pcDNA3-wx一起,经脂质体共转染真核细胞观察体外表达效果;经电穿孔法导入弓形虫体内,获得体内能持续表达siRNA分子的可遗传的RNA干扰虫株。采用Western-blotting,RT-PCR,Northern-blotting等方法鉴定其蛋白质及mRNA水平变化效果;并对有基因沉默效果的干扰虫株进行动物感染实验,观察其的毒力变化;以研究减毒活疫苗的潜在价值。研究结果:(1)获得了两株抗弓形虫的单克隆抗体7C3-C3,289-G1,体外保护性实验提示能抑制弓形虫对宿主细胞的侵袭以及在宿主细胞内的繁殖,其细胞感染率分别为28%和32%,对照组为85.2%;50个HeLa细胞中纳虫泡内平均虫体数目为5.18±3.34与5.50±2.36,对照组为11.12±4.29。被动转移实验提示其能够延长RH株弓形虫攻击小鼠的生存时间(7.2±0.42和7.0±1.41d,对照组为5.0d),表明这两个单抗具有一定的抗弓形虫感染的保护力。(2)通过免疫筛选弓形虫速殖子cDNA文库,获得了两个单抗所对应的基因序列,经同源性比对发现它们为新基因;GenBank的登录号为AY238892和AY208994。通过双色免疫荧光定位和体外表达以及生物信息学分析对两个新基因进行了鉴定,证明WX2为一新的功能膜分子,分子量为49kDa;WX为弓形虫60S核糖体L7蛋白,分子量为47kDa,位于胞质中。(3)成功构建了新基因wx2,wx的真核表达质粒,作为DNA疫苗免疫动物显示pcDNA3-wx2与pcDNA3-wx能显著延长弓形虫RH株攻击感染的生存时间,分别达289.14±46.81h和284.29±47.30h,对照组仅存活176.4±1.98h和172±1.88h,而且攻击感染30天后疫苗接种组21只实验鼠中均有4只小鼠存活,显示其潜在的应用价值。对免疫鼠研究发现,pcDNA3-wx2能刺激机体产生较高水平的IFN-γ(P＜0.05);pcDNA3-wx2与pcDNA3-wx都能使宿主脾细胞CD_4~+/CD_8~+比值下降,及产生特异性抗体,与对照组相比,P值＜0.05;但抗体效价的高低与保护力的强弱并不平行;提示该DNA疫苗主要以CD_8~+的CTL细胞途径激发机体的抗弓形虫效应。(4)成功构建了5个针对基因wx2,wx的干扰表达质粒,获得了2株部分沉默的RNA干扰虫株wx2b-i和wxB-i虫株。经过体外表达以及RT-PCR,Northern-blotting等鉴定,证实基因wx2,wx mRNA水平及蛋白质的表达均有部分下降。干扰虫株wx2b-i腹腔接种小鼠后其存活时间明显延长,平均存活时间为235.4±15.4h,阴性组C-i和野生型RH株组分别为161.2±11.98h与165.4±6.09h,统计学分析具有显著性差异,发病及死亡时间推迟,表明干扰株的毒力有所降低。结论:(1)抗弓形虫的单克隆抗体7C3-C3,289-G1对于弓形虫的感染具有一定的保护性,能抑制弓形虫对宿主细胞的侵袭以及在宿主细胞内的繁殖;被动转移实验提示能够延长RH株弓形虫攻击小鼠的生存时间。(2)WX2为一新的弓形虫功能膜分子,分子量为49kDa;WX为弓形虫60S核糖体L7蛋白,分子量为47kDa,定位于胞质中。wx2,wx是两个较好的弓形虫疫苗候选分子。(3)成功建立了含新基因wx2,wx的DNA疫苗,能显著延长弓形虫强毒(RH株)攻击感染动物的生存时间,显示其潜在应用价值。对宿主免疫系统的影响观察提示其主要以CD_8~+的CTL细胞途径激发机体的抗弓形虫效应。(4)成功构建了5个针对基因wx2,wx的干扰表达载体,并获得了两株部分沉默的RNA干扰虫株wx2b-i、wxB-i,其中wx2b-i虫株的毒力有所降低,为进一步研究基因wx2,wx的功能与作用机制奠定了基础。
古小彬[7]2009年在《兔疥螨虫株的分子分类及其疫苗研究》文中进行了进一步梳理兔疥螨病是家兔常见的多发性寄生虫病,具有高度接触性和传染性,能引起病兔发生剧痒及各种类型的皮炎,严重影响家兔的生长发育,降低皮毛质量,严重时可引起死亡,给养兔业造成巨大的经济损失。对该病病原的准确诊断是尽早对动物实施药物治疗、有效控制该病流行的关键。但长期以来,疥螨属内的螨虫虫种分类还是一个颇具争议的话题,疥螨的免疫机制也尚不清楚。目前,兔疥螨病防治仍以药物为主,尚无可用于免疫防制的疥螨疫苗。但药物长期使用不仅费用高,效果不理想,而且容易导致抗药虫株的出现和较严重的毒副作用,特别是药物在畜产品中的残留,通过食物链会对人体健康造成潜在威胁,有的甚至可能致癌。因此,本研究采用PCR技术扩增兔疥螨虫株的线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ(COI)基因,并进行测序和序列分析;同时克隆兔疥螨的副肌球蛋白基因(Pmy),构建该基因的原核表达载体和真核表达载体,对兔疥螨副肌球蛋白核酸疫苗、重组副肌球蛋白(PmyP)和疥螨全虫蛋白(ScTP)免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫应答进行分析,为解决兔疥螨虫株的分类地位和开发防治兔疥螨病的有效疫苗打下基础。主要研究工作和结果如下:1、采用PCR技术首次扩增了分离自中国兔和猪的4个疥螨分离株的线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ(COI)基因,并与GenBank中注册的14个国外疥螨分离株的同源基因进行了比较。序列分析结果显示:扩增的4个疥螨株COI基因长度均为1427 bp,序列间无插入、缺失,A+T含量(73%)明显高于G+C含量(27%),碱基组成存在明显偏移。兔和猪的4个疥螨分离株间的COI基因同源性较高(99.1%～100.0%),它们与澳大利亚人疥螨株、国外动物疥螨株的同源性范围为98.4%～99.6%。在构建的NJ树中,分离自中国兔和猪的4个疥螨分离株同澳大利亚人疥螨分离株、国外动物疥螨分离株亲缘关系较近。根据疥螨COI基因同源性分析和系统树构建结果,我们认为分离自中国猪和兔的4个疥螨分离株与澳大利亚人疥螨分离株以及国外的动物疥螨分离株均应属于同一个种。2、首次扩增出兔疥螨副肌球蛋白基因的全序列,测序并进行了生物信息学分析。结果表明:兔疥螨副肌球蛋白基因全长2628bp,序列中A+T含量(58.1%)和G+C含量(41.9%)差异不明显;与已报道猪疥螨虫株、红狐疥螨虫株、大熊猫足螨、黑白花奶牛德州足螨、刺翼尘螨、热带无爪螨的副肌球蛋白基因的同源性分别为99.6%、99.5%、83.0%、82.6%、82.1%和82.0%,推导的氨基酸同源性分别为100.0%、97.6%、97.6%、94.4%、97.1%和95.2%。兔疥螨副肌球蛋白基因共编码875个氨基酸,以Glu、Leu和Gln的含量最高,Cys、Pro和Trp的含量最低:副肌球蛋白分子理论值为102.36 kDa,理论pI=5.59,带负电荷,无信号肽,无跨膜区,含有大量的亲水性区域,共有4个潜在的N-糖基化位点;其二级结构中含96.91%的α-螺旋,0.11%的β-转角,2.86%不规则盘绕。3、将构建的原核表达质粒pET32a-Pmy转化表达宿主菌BL21(DE3)进行原核表达,同时对表达条件进行优化,确立了pET32a-Pmy表达的最佳条件为37℃、0.2 mmol/LIPTG诱导6 h,融合表达的副肌球蛋白分子量为124.36 kDa,并以不溶的包涵体形式存在于菌体中:免疫印迹发现该表达蛋白能与疥螨病患兔血清相识别。将构建的真核表达载体pVAX1-Pmy转染COS-7细胞,通过RT-PCR及间接免疫荧光检测,表明pVAX1-Pmy真核表达质粒在COS-7细胞中得到正常转录与表达。4、将构建的兔疥螨副肌球蛋白DNA疫苗pVAX1-Pmy以100μg/只剂量肌肉注射免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,每次间隔2周。一免后24 h、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、49 d、63 d、77 d及105 d采集小鼠的抗凝血、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉及脑组织,提取血液和各组织DNA进行PCR扩增。以纯化后的组织总DNA为模板,PCR法检测质粒DNA整合到小鼠细胞染色体基因组上的可能性,评价疫苗的安全性。结果表明:一免后24 h、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d及49 d能在小鼠血液及各检测的组织器官检测到该质粒;一免后63 d,除脑组织外,其余各组织器官及血液中均有质粒的分布:一免后77d,只在血液、肌肉和心脏中检测到质粒;一免后105 d仅在注射部位的肌肉中检测到该质粒。纯化后的组织基因组DNA经PCR扩增均呈阴性,未发现整合情况,证实该DNA疫苗安全性好。5、pMD18-T-IL-2、pMD18-T-IL-4、pMD18-T-IFN-γ质粒分别经BamHⅠ+XhoⅠ、EcoRⅠ+XhoⅠ、EcoRⅠ+HindⅢ酶切后,与经相同限制性内切酶处理的pVAX1质粒,经胶回收后,连接、转化入DH5α。扩大培养后小量抽提质粒,经PCR和双酶切鉴定正确,表明成功构建了pVAX1-IL-2、pVAX1-IL-4和pVAX1-IFN-γ真核表达质粒。6、将120只BALB/c小鼠随机分成对照组(PBS组、pVAX1组)、DNA疫苗免疫组(Pmy组、Pmy+IL-2组、Pmy+IL-4组、Pmy+IFN组)、蛋白疫苗免疫组[兔疥螨全虫蛋白组(ScTP组)和重组副肌球蛋白组(PmyP组)](共8组)。PBS组:肌肉注射PBS液100μL;pVAX1组:肌肉注射pVAX1质粒100μg;Pmy组:肌肉注射pVAX1-Pmy质粒100μg;Pmy+IL-2组:肌肉注射质粒pVAX1-Pmy和pVAX1-IL-2各100μg;Pmy+IL-4组:肌肉注射质粒pVAX1-Pmy和pVAX1-IL-4各100μg;Pmy+IFN组:肌肉注射质粒pVAX1-Pmy和pVAX1-IFN-γ各100μg;PmyP组:皮下注射重组副肌球蛋白50μg:ScTP组:皮下注射兔疥螨全虫蛋白50μg。共免疫3次,每次间隔2周,检测小鼠的抗体水平(IgG、IgG1、IgG2a、IgE、IgM)、淋巴细胞增殖能力、脾细胞悬液分泌的细胞因子(IL-2、IL-4、IL-5及IFN-γ)含量及外周血CD4~+、CD8~+T淋巴细胞亚群的数量。ELISA检测小鼠血清中的抗体结果显示:ScTP组和PmyP组小鼠的IgG、IgG1抗体水平高于DNA疫苗组,但这两个组小鼠的IgG2a水平低于DNA疫苗组;一免后14d～42d,Pmy+IL-2组、Pmy+IL-4组、Pmy+IFN组小鼠的IgG水平高于Pmy组;Pmy+IL-4组产生IgG1的水平高于Pmy组,除免疫后14 d,其余检测时间内均差异显著(P＜0.05);Pmy+IL-2组、Pmy+IFN组小鼠的IgG2a水平高于Pmy组,免疫后14 d～35 d,Pmy+IL-2组与Pmy组的差异显著(P＜0.05);Pmy+IL-4组产生的IgE水平高于其他免疫组,免疫后14 d,差异显著(P＜0.05);ScTP组和PmyP组产生的IgM水平高于各DNA疫苗组,免疫后7 d～35 d,与Pmy组差异显著(P＜0.05):免疫后21 d～42 d,Pmy+IL-2组小鼠的IgM值高于Pmy组、Pmy+IL-4组、Pmy+IFN组,但差异不显著(P＞0.05)。脾淋巴细胞增殖结果显示:ScTP组、PmyP组、Pmy组、Pmy+IL-2组、Pmy+IL-4组、Pmy+IFN组刺激指数明显高于pVAX1组刺激指数(P＜0.05),且DNA疫苗组的增殖能力大于蛋白疫苗组。脾细胞悬液分泌的细胞因子检测结果显示:Pmy+IL-2组、Pmy+IFN组小鼠脾细胞悬液分泌的IL-2含量显著高于其他免疫组(P＜0.05),它们分泌的IFN-γ显著高于Pmy+IL-4组、ScTP组及PmyP组(P＜0.05),但这两组的小鼠脾细胞悬液分泌的IL-4显著低于其他疫苗免疫组(P＜0.05);Pmy+IL-4组小鼠脾细胞悬液分泌的IL-4、IL-5显著高于其他疫苗免疫组(P＜0.05)。外周血CD4~+、CD8~+T淋巴细胞亚群数量检测结果显示:ScTP组、PmyP组、Pmy组、Pmy+IL-2组、Pmy+IL-4组、Pmy+IFN组小鼠外周血CD4~+、CD8~+T数量明显高于空载体组(P＜0.05)。从检测分析结果来看,疥螨全虫蛋白和重组副肌球蛋白免疫小鼠主要引起小鼠的Th2免疫应答;而pVAX1-Pmy+pVAX1-IL-2和pVAX1-Pmy+pVAX1-IFN-γ免疫小鼠后主要引起小鼠的Th1型免疫应答:pVAX1-Pmy+pVAX1-IL-4则主要引起小鼠的Th2型免疫应答;且疫苗免疫各组小鼠的T淋巴细胞均进行了有效增殖。本研究对兔疥螨全虫疫苗、兔疥螨重组副肌球蛋白疫苗及副肌球蛋白核酸疫苗的免疫应答进行了评价,为研制高效的兔疥螨疫苗奠定了基础。
聂浩[8]2010年在《弓形虫—伪狂犬病毒重组二价基因工程疫苗研究》文中认为弓形虫病(Toxoplasmosis)是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的、在世界范围内广泛流行的人兽共患寄生虫病。猫是弓形虫的终末宿主,会排出感染性的卵囊,卵囊被认为是弓形虫感染的主要来源之一。人经食物、饮水等途径摄入卵囊而感染。不过,也有越来越多的研究将目光关注于人通过食用含有T. gondii组织包囊的肉及肉制品而感染弓形虫的风险。免疫预防是控制弓形虫病的主要手段,但由于弓形虫复杂的生活史中有着多种多样的因素对弓形虫免疫产生影响,目前弓形虫的免疫预防研究进展不大。在弓形虫病诊断方面,尽管已有很多方法用于弓形虫的检测,但在临床实际应用中缺乏操作简便、快速且不需要昂贵仪器的病原学诊断方法。为此本研究对T. gondii LAMP病原学诊断方法及T. gondii-PRV二价基因工程疫苗进行了研究,主要研究结果如下：1.弓形虫LAMP检测方法的建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是由日本学者Notomi于2000年发明的一种新型体外恒温核酸扩增方法,主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域,在等温条件下进行高效扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步完成。目前,该技术已被广泛应用于病毒、细菌、动物原虫等疾病的检测。本研究中,我们针对弓形虫MIC3基因(GeneBank No. EU572718)设计了一组引物,包括有内引物对、外引物对以及促环引物对,通过一系列反应条件的筛选建立了弓形虫LAMP病原诊断方法。敏感性实验结果表明该方法能检测到的极限值为0.4个速殖子,特异性实验结果表明该方法具有特异性强的特点。利用该方法和B1-based Nested-PCR同时检测320份临床采集的猪的血液和组织样品,其阳性检出率分别为11.6%和9.69%,说明LAMP方法更为敏感。另外利用该方法检测猪肉样品中弓形虫的感染,在某屠宰场的45份样品中检测出9份阳性,而在5个市场收集的68份样品检出3份阳性,这些结果说明,猪肉中弓形虫感染的风险是切实存在的。上述结果表明基于弓形虫MIC3基因的LAMP诊断方法具有敏感性高、特异性强的特点,加上该方法具有操作省时、省力,不需要昂贵的仪器,因此具有很好的推广应用前景。2.表达弓形虫SAG1、MIC3和GRA7基因的重组伪狂犬病病毒的构建伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)是一种能引起多种动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要症状的病毒,由该病毒引起的猪伪狂犬病是目前危害全球养猪业的主要传染病之一。伪狂犬病病毒基因缺失标志疫苗是目前应用最为成功的动物标志疫苗之一,同时也是良好的基因工程重组疫苗载体,迄今为止,已有几十种外源基因在PRV中得到表达。本研究中,分别将经PCR方法扩增的SAG1、MIC3和GRA7全基因插入到PRV gG-缺失通用转移载体pgG-Uni的多克隆位点中以构建转移质粒pgG-SAG1、pgG-MIC3和pgG-GRA7。然后再将上述质粒与PRV TK-/gG-/EGFP+基因组共转染IBRS-2细胞,病变后经空斑纯化得到重组病毒TK-/gG-/ SAG1(MIC3,GRA7)+。通过Western blotting检测重组病毒中外源基因的表达。结果表明重组病毒构建正确,且外源基因得到了正确表达。重组病毒的TCID50测定结果表明,外源基因的插入不影响重组病毒在IBRS-2细胞上的增殖。重组病毒传代30代后外源基因仍然存在,同时以不同剂量接种实验动物没有出现毒力增强现象,这些结果说明重组病毒具有很好的遗传稳定性和安全性。3.重组病毒作为疫苗的免疫效果及保护力利用构建的三株重组病毒单独或联合免疫小鼠,所有接种重组病毒的小鼠都产生对弓形虫裂解抗原(TLA)特异性的抗体,伴随着很强的淋巴细胞增殖反应,并且IFN-γ和IL-2的量明显上升。这些结果说明重组伪狂犬病毒能够诱导产生很强的体液免疫和Th1型的细胞免疫。免疫攻击实验结果表明重组伪狂犬病毒免疫后能使小鼠产生抵抗致死性RH株弓形虫攻击的保护力,明显延长攻虫小鼠的存活时间,并同时诱导产生较高水平PRV中和抗体和抵抗致死性PRV的攻击。而那些用两株和三株rPRV混合免疫的小鼠能够产生更高水平的T. gondii-specific IgG抗体、更强的淋巴细胞增殖反应,并且更有效的抵抗弓形虫的攻击。这些结果说明表达弓形虫保护性抗原的重组伪狂犬病毒具备开发成为一种新型疫苗的潜力,可用来同时预防动物伪狂犬病和弓形虫病。
周晓红[9]2004年在《弓形虫MAG和tSAG1在转基因番茄中的表达研究》文中研究说明植物口服疫苗，成本低廉，使用简便，可规模化生产，且具有完整的真核细胞表达系统；果蔬类植物如番茄、香蕉等以其独具的可食(饲)性在疫苗研制方面展示了良好的开发应用潜能。目前已有多种疫苗分子在转基因植株中得到表达，部分植物疫苗经动物实验和志愿者的口服免疫测试结果表明：其可有效激发机体产生特异性的局部粘膜免疫反应和全身体液免疫、细胞免疫反应。 弓形虫：呈世界性分布，宿主广泛，人群感染率高，危害严重，尤其对孕妇、儿童和免疫力低下人群以及畜牧业生产均构成严重威胁。因此，弓形虫感染与弓形虫病最好的防治手段是能研制出价廉易用的疫苗。植物基因工程的发展给弓形虫疫苗研制带来新的思路。 本研究利用自行克隆鉴定的番茄果实特异性E8启动子，以及植物组成型启动子E35S，驱动优势弓形虫疫苗候选分子MAG和tSAG1，转化番茄，筛选鉴定获得转基因番茄植株，并进行转化植株T1代初步的遗传分析，期望获得值得进一步深入研究的能高效稳定表达MAG和tSAG1的番茄转化株系，为研制弓形虫转基因番茄口服疫苗，探索弓形虫感染和弓形虫病的有效防治途径，奠定工作基础。 Ⅰ．番茄果实特异性E8启动子的基因克隆与序列分析 目的 获取番茄果实特异性E8启动子基因，为实现外源基因在转基因番茄中果实特异性表达做准备。 方法 培养中蔬5号(Zhongshu No.5)番茄幼苗，采集叶片，用Omega公司的植物基因组提取试剂盒提取番茄基因组DNA；设计引物，从基因组中通过PCR扩增获得番茄果实特异性E81.1(E8核心启动子区)和E82.2(E8启动子全长)基因；克隆进pGEM-T载体，酶切鉴定；送上海基康公司测序；序列分析。第一军医大学薄士学应论戈摘要结果 从番茄基因组DNA中PCR扩增得到预期大小的启动子片段;构建重组pGEM一T一E81 .1和pGEM一T一E82.2载体，经酶切证实具有预期大小的插入子片段;测序结果分析显示:番茄果实特异性E8启动子序列高度保守，所获得的Zhongshu No.5 E82.2启动子DNA序列与Deikman J.报道的eherry种的E82.2启动子同源性为99%，登陆GENBANK，ID号为AFS 1 5784。结论 成功获得我国优良纯种番茄zhongshu No.5果实特异性E81.1、E82.2启动子基因，这是我国番茄果实特异性E8启动子序列的首次报道。n.弓形虫MAG植物表达载体的构建目的 将含弓形虫多个保护性抗原表位的编码基因即多表位基因(MAG)，分别用植物组成型启动子E35S和番茄果实特异性E82.2启动子以及E35S一E81.1复合式双启动子驱动，构建MAG植物表达载体。方法 1将MAG亚克隆进PBAC55载体，构建中间载体pB35MG，其以含双增强子的花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子(E35S)驱动MAG，3’端携带胭脂碱合成酶基因终止子(NOS3’)序列，组成E35S/MAG/NOS3’结构单元，经酶切和测序证实后，再将其中E35S/MAG/N 053，结构单元亚克隆进pCAMBIA2300质粒中，构建植物表达载体pC35MG。 2用酶切法将番茄果实特异性启动子E81 .1插入pB35MG载体中，构建含E35S一E81.1复合式双启动子驱动MAG的中间载体pB35EIMG，再将其中E35SE81.l/MAG/NOS3’结构单元亚克隆进pCAMBIA23OO质粒中，构建植物表达载体pC35EIMG。 3用酶切法将番茄果实特异性启动子E82.2插入pB35MG载体，构建以E82.2启动子驱动MAG的中I’ed载体pBEZMG，再将其中E82.2/MAG/NOS3，结构单元亚克隆进pCAMBIA2300质粒中，构建植物表达载体pCEZMG。男‘荤诬比拿厚士学游论戈荷要 4植物表达载体PC35EIMG、pCEZMG中的目的基因MAG序列经测序进行鉴定。 5含三种启动子驱动MAG的植物表达载体转化根癌农杆菌乙石火4404感受态细胞后，提取农杆菌质粒进行酶切及PCR鉴定。结果 重组质粒用酶切和PCR鉴定均得到预期大小片段，琳G中间载体pB35MG及植物表达载体pC35EIMG、pCEZMG均经序列测定确证。结论 成功构建MAG中间载体pB35MG、pB35EIMG、pBEZMG，以及植物表达载体pC35MG、pC35EIMG、pCEZMG，并将三种植物表达载体成功导入根癌农杆菌乙石翅4404。m.弓形虫tsAGI植物表达载体的构建目的 将优势弓形虫疫苗分子SAGI基因截短片段(tSAGI)，分别用植物组成型启动子E35S和番茄果实特异性E82.2启动子以及E35S一E81.1复合式双启动子驱动，构建tSAGI植物表达载体。方法 1自本室构建的pET32a一tSAGI载体中PCR扩增得到tSAGI基因，克隆进T载体为pMD一T一tSAGI，酶切鉴定后进行测序确认。 2用BamHI单酶切连接方式将tSAGI分别亚克隆进pB35MG、pB35EIMG、 pBEZMG载体，分别构建中间载体pB35tSAGI、pB35EltSAGI、pBEZtSAGI载体。其中，pB35tSAGI以E35S驱动tSAGI，3，端携带NOS3，终止子序列，组成E35S八SAGI/NOS3’操纵子结构单元。pB35EltSAGI含E35S一E81.1复合式双启动子驱动tSAGI，组成E35SE81.l八SAGI/NOS3，操纵子结构单元。PBEZtSAGI以番茄果实特异性启动子E82.2驱动tSAGI，组成E82.2八SAGI/NOS3，操纵子结构单元。 3 pB35tSAGI、pB35EltSAGI、pBEZtSAGI经酶切证实后，分别将其中E35S八SAGI/NOS3，、E35S一Esl.1八SAGI/NOS3，、E82
黄祥盛[10]2009年在《弓形虫ADF基因亚单位疫苗与核酸疫苗的实验免疫研究》文中研究说明弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种重要的机会性致病原虫,广泛寄生于人体及动物的组织细胞内,引起严重的人兽共患病。据估计全世界1/3的人群感染本病,我国人群的感染率为5%～10%。目前尚未找到理想的防治该病的药物,且由于研制新药成本费用高、药物残留以及减毒疫苗毒力返强等问题的存在,使弓形虫基因工程疫苗的研究成为新的趋势。有学者通过对弓形虫抗原及其诱导的免疫反应进行研究后认为有效的疫苗对该病的防治有一定的作用。为探讨ADF基因对弓形虫感染的免疫保护作用,本研究在已知ADF基因序列的基础上设计引物,扩增ADF开放阅读框,将其克隆入原核表达载体并表达出重组ADF蛋白,并对ADF基因在弓形虫速殖子内的分布进行定位;同时用DNA重组技术将弓形虫ADF基因与真核表达载体pVAX1相连,构建真核表达载体,并将重组真核表达质粒转染Hela细胞,验证其在真核细胞中的表达;将重组ADF蛋白与真核表达质粒分别免疫小鼠检测其免疫保护力。结果显示,扩增出365bp的ADF开放阅读框,经Blast比对显示同源性为98%,并表达出17KDa的重组融合蛋白,应用免疫荧光抗体技术将ADF基因定位于速殖子胞质内及质膜上;用间接免疫荧光方法在重组质粒转染后的Hela细胞中检测到特异蛋白,通过Western blot试验证实所得蛋白具有反应原性;重组ADF蛋白免疫保护结果显示,随着免疫次数的增加抗体滴度逐渐增加,试验组与对照组相比差异极显著(P<0.01)。CD4+与CD8+T淋巴细胞数与对照组相比差异显著(P<0.01),CD4+/CD8+ T淋巴细胞数的值差异不显著(P>0.05)。试验小鼠均未能抵抗弓形虫强毒株攻虫感染,但试验组生存时间延长,与对照组差异不显著(P>0.05),脑组织中包囊数减少,减虫率达30%;核酸疫苗免疫保护结果表明,试验组与对照组相比,特异性抗体滴度、CD4+与CD8+T淋巴细胞数均差异极显著(P<0.01),CD4+/CD8+ T淋巴细胞数的值差异不显著(P>0.05)。攻虫后小鼠生存时间得到延长,与PBS对照组差异显著(P<0.05),与pVAX1对照组差异不显著(P>0.05),包囊减少可达到42.8%。
参考文献：
[1]. 弓形虫P30三种表达形式重组质粒的构建及遗传免疫效果的初步测试[D]. 龚娅. 第一军医大学. 2000
[2]. 弓形虫缓殖子期特异性抗原的基因克隆、蛋白表达及重组BAG1抗原的初步应用[D]. 王琼. 南方医科大学. 2007
[3]. 弓形虫速殖子与缓殖子体外相互转化模型的建立及可调性RNA干扰的初步研究[D]. 吴焜. 第一军医大学. 2007
[4]. 弓形虫核酸疫苗pcDNA_3/GRA_1的研究[D]. 蔡力汀. 中南大学. 2003
[5]. 弓形虫多表位基因的疫苗研究及其重组抗原在免疫诊断中的应用[D]. 杨培梁. 第一军医大学. 2007
[6]. 具有潜在疫苗价值的弓形虫新基因wx2，wx的筛选与鉴定[D]. 吴翔. 中南大学. 2007
[7]. 兔疥螨虫株的分子分类及其疫苗研究[D]. 古小彬. 四川农业大学. 2009
[8]. 弓形虫—伪狂犬病毒重组二价基因工程疫苗研究[D]. 聂浩. 华中农业大学. 2010
[9]. 弓形虫MAG和tSAG1在转基因番茄中的表达研究[D]. 周晓红. 第一军医大学. 2004
[10]. 弓形虫ADF基因亚单位疫苗与核酸疫苗的实验免疫研究[D]. 黄祥盛. 吉林大学. 2009
标签：基础医学论文; 弓形虫论文; 抗原表位论文; 重组蛋白论文; 基因合成论文; 细胞免疫论文; 弓形虫抗体论文; 质粒载体论文; 问题疫苗论文; dna序列论文;