张永江[1]2002年在《海藻凝集素的筛选、纯化及其性质》文中研究说明以抗烟草花叶病毒(Tbacco mosaic virus，TMV)、抗肿瘤(MGc 80-3)及具凝集血红细胞活性为标准，对福建沿海的10种大型海藻(红藻6种、褐藻2种、绿藻2种)进行活性筛选。10种海藻中7种具抗TMV活性，其中6种的抑制效果在60％以上，最高可达84.5％。9种对兔血红细胞具凝集活性，4种对鸡血红细胞具凝集活性，且对兔血红细胞的活性要比对鸡血红细胞高，说明海藻凝集素对兔血红细胞更敏感。10种海藻中多数对胃癌MGc80-3具不同程度的抗性，其中3种抗性在50％以上，最高的达83.2％。 本实验以绿藻孔石莼(Ulva pertusa Kjellm)为试验材料，经硫酸铵分级沉淀(30-80％)、牛甲状腺球蛋白-Sepharose 4B亲和层析分离纯化得到一种凝集素(UPL1)。在PAGE及SDS-PAGE上均显示单一蛋白染色带，测定的UPL1相对分子量约23kD。UPL1抗TMV活性为56％；抗胃癌MGc803(10×)活性为51.5％；对兔血红细胞有凝集作用。其凝血活性可被牛甲状腺球蛋白和N-乙酰-D-氨基葡萄糖抑制，最小抑制浓度分别为5g／L，2.765g／L。UPL1的N-端氨基酸序列为AGITNTDNWETFAGLPLTGA，Genbank登录号为P83209。以纯化的UPL1为抗原，制备了抗血清，效价为1：2~(14)。 部分理化特性的研究结果表明，UPL1的分子中含有约1.2％的中性糖；其在pH6～9范围内相对稳定；具有较高的热稳定性，在70℃以下对兔血红细胞的凝血活性稳定，80℃时丧失一半活性；此外，UPL1对Mn~(2+)、Zn~(2+)、Mg~(2+)和Ca~(2+)等二价离子有不同程度的依赖性。
陈国强[2]2008年在《一种褐藻—铁钉菜（Ishige okamurae）凝集素的研究》文中研究说明本研究以褐藻门的铁钉菜(Ishige okamurae)为试验材料,经PBS浸提、硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose FF离子交换层析和Sephadex G-100分子筛层析,分离纯化得到铁钉菜凝集素(IOL),其对兔血红细胞最小凝集浓度约为156.25μg/mL。IOL在SDS-PAGE上显示单一蛋白染色带,测定的相对分子量约为45KDa。理化特性的研究结果表明,铁钉菜凝集素含有17.877%的中性糖,最大紫外吸收峰为269.3nm;在氨基酸组成中,谷氨酸(Glu)的含量最高,天门冬氨酸(Asp)的含量次之,含量最低的是甲硫(蛋)氨酸(Met),不含色氨酸(Try)。凝集活性只被麦牙糖所抑制。在pH 4.0～9.0范围内相对稳定;具有较高的热稳定性,最高耐热温度为80℃;此外,IOL对二价金属离子Zn~(2+)和Mg~(2+)具有不同程度的依赖性。生物学活性实验显示,IOL对7种供试真菌(菌丝生长及孢子萌发)及11种细菌生长具有不同程度的影响,能够凝集斜生栅藻、湛江叉鞭金藻和绿色巴夫藻,对供试藻类的生长及叶绿素a含量的影响不同,能抑制多纹膝沟藻和棕囊藻的生长,降低叶绿素a含量,但能够促进亚心型扁藻、斜生栅藻和红色蔷薇藻的生长,使它们叶绿素a的含量提高。
刘振宇[3]2004年在《海藻中两种与植物抗病相关铜结合蛋白的分离、特性和基因特征》文中研究表明一直以来，人们与植物病害的斗争就没有停止过。从生物中探寻具有抗病活性的天然产物并将其应用于人类防治植物病害的实践，是科学家所关注的一个重要课题。海藻因其特殊性，其中的活性蛋白质及其编码基因也必然具有特殊性。因此研究海藻中与抗植物病害相关的蛋白质及其基因就有其重要意义。 1．测定了16种海藻蛋白浸提液的抗病毒和抗真菌作用，发现海藻中存在着对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)和马铃薯Y病毒坏死株系(Potato virus Y，strain N，PVY~N)的侵染以及真菌生长具有抑制作用的蛋白质，且具有多种蛋白质组分，其抑制作用大小不一。并发现有7种供试海藻存在着对Gloeosporium musarum孢子的萌发具有抑制作用的蛋白质。 采用(NH_4)_2SO_4盐析，阴离子或者阳离子交换柱层析，以及凝胶过滤层析等步骤，将羊栖菜(Sargassum fusiforme)、沙菜(Hypnea cervicorrnis)、半叶马尾藻(Sargassum hemiphyllum)蛋白进行了部分纯化，得到了不同的蛋白质组分，发现其中含具有抗TMV侵染和真菌生长以及抑制真菌孢子萌发的活性蛋白组分。 2．在活性蛋白初筛的基础上，重点选择了孔石莼(Ulva pertusa Kjellm)作为进一步开展抗病毒活性蛋白纯化的对象。通过DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析和Sephadex G—75凝胶过滤层析，从40％～80％的孔石莼硫酸铵盐析蛋白中获得了一种具有抗PVY~N活性的蛋白，该蛋白不含糖，SDS—PAGE电泳显示，其分子量约为10,000Da，将其命名为UPG75。将该蛋白N端氨基酸测序，获得了其前20个氨基酸序列，并登录SWISS PROT蛋白质数据库，登录号为：P56274。经同源性检索，发现，该蛋白前20个氨基酸序列与海藻中的质体蓝素(plastocyanin)氨基酸序列高度同源，同源性达85％以上。认为该蛋白为质体蓝素家族的成员。质体蓝素是一种含铜离子的蛋白，其在植物的电子传递过程中起着重要作用。 孔石莼40％～80％硫酸铵盐析蛋白在采用CM Sepharose Fast Flow阳离子交换柱层析时，纯化得到一个对TMV侵染具有抑制作用的蛋白，当浓度为50μg／mL时，该蛋白在心叶烟上对TMV侵染的抑制率达85.6％。该蛋白可能是一个碱性蛋白，经SDS-PAGE确定其分子量约为36,000Da，单一亚基，不含糖。命名该蛋白为UPCM40。福建农林大学博士学位论文摘要 3.多酚氧化酶(PPO)是一种与生物的抗病性密切相关的酶，同时也是一种重要的含铜离子金属蛋白。经测定，发现PPO活性在海藻中广泛存在。 以邻苯二酚为底物，系统测定了羊栖菜、铁钉菜、孔石药中40%~80%硫酸按盐析得到的PPO酶溶液的特性，在以邻苯二酚为底物的体系中，存在着一个适宜的底物和酶液的比例，底物浓度过高，往往会产生底物抑制的现象。3种海藻PPO都具有较广的适温范围和一定的热稳定性， NaHS仇、L一半胧氨酸、抗坏血酸、EDTA、NaCI等对PPO活力均有抑制作用。有趣的是，所测定的铁钉菜和羊栖菜这2种海藻的PPO活力都表现出一个在较高pH值时酶活力很高的现象。羊栖菜的最适酶活力pH是9.1，同时在pHll.o、pH12.o时酶活力依旧很高，并有出现峰值的趋势。而铁钉菜PPO则在pH 12 .0时，酶活力表现最大。同时，这两者在酸性条件下，酶活力都很低。pH3.O和pH4.o时，酶没有表现活力，只有当pHS.O时，羊栖菜多酚氧化酶才表现出一定活力，但其活力仅仅是酶在pHg.1时活力的1%，在pH6.6时的酶活力是在pHg.1时酶活力的2.8%;铁钉菜的PPO在pH3 .0，4.0，5.0，6.0时，不能检测到酶活力。 4.采用降落PcR方法并结合RACE技术，克隆得到了对Pv训侵染具有抑制作用的UPG75的cDNA的全部核昔酸序列。 该基因序列共由787个碱基组成，包括40个碱基的5’UTR和417个碱基的开放阅读框架(O盯)以及333个碱基的3UTR。该部分ORF编码一个UPG75的前体肤，共139个氨基酸残基，其中N端41个氨基酸为信号肤序列，其后98个氨基酸序列为成熟肤。’ 发现，UPG75前体肤的核昔酸序列与同属于绿藻门(C址。roPhyta)的斜生栅藻(scenedesm‘obliauus)(AF 1 14235)、短棘盘星藻(Pediastrum bo训num) (ABol78lo)、莱因衣藻(Chla恻domonas reinhan方11)(Joss24)的前体肤同源性较高，同源性分别为60.1%、58.7%和58.5%;而与禾本科(G~ineae)的水稻(。笋。sativa)(AF093636，AFoo9412)、大麦(Hordeum vu电闷re) (Y00704)的同源性为53.5%、52.6%和54.9%;与杨柳科(Salieaceae)的黑杨(尸叩ulusn妙a)(250185)的同源性只有33.2%。 uPG75编码信号肤的基因与短棘盘星藻(p bo勺心num)、莱因衣藻(Ch.reinhardtii)、黑杨(p nigra)、大麦(H vulgare)的基因进行同源性比较，同源性亦很高。相应的，5种生物信号肤的氨基酸序列末端，毗邻的几个氨基酸残基AX’功公钾XXXXGA具有高度的保守性。厂福建农林大学博士学位论文摘要 编码UPG75Plastocy田五n成熟肤的基因序列与4种不同来源生物的基因比较，也有较高的同源性。尤其在PlastocyhanUpG75基因序列的nt228~274和ni95~1 54，核昔酸序列与其它生物的核昔酸序列具有较高同源性的现象很普遍。而这两个区域恰是蛋白质的铜离子结合位点。 ?
王月华[4]2013年在《红藻凝集素的分离纯化及特性研究》文中研究指明1、6种红藻粗提物的血凝集活性检测用兔、鸡、鸭和鸽子血红细胞检测真江蓠、细基江蓠、菊花心江蓠、龙须菜、芋根江蓠和带形蜈蚣藻6种红藻粗提物对血红细胞的凝集作用,发现只有带形蜈蚣藻粗提物对供试的4种血红细胞都没有凝集作用,其它5种海藻的粗提物至少能凝集1种供试的血红细胞。2、真江蓠和细基江蓠凝集素粗品的抑藻、抗菌作用真江蓠和细基江蓠凝集素粗品都只对塔玛亚历山大藻有细胞凝集作用,而对其他7种单细胞藻都没有凝集；但两种海藻凝集素粗品都能抑制球形棕囊藻的生长,当凝集素浓度为45μg／mL,细基江蓠凝集素粗品对棕囊藻的生长抑制率为75%,而真江蓠凝集素粗品对棕囊藻的生长抑制率为85.29%。两种凝集素粗品都能抑制玉米大斑病菌、黑曲霉及圆弧青霉菌丝的生长。细基江蓠凝集素粗品还能抑制枇杷炭疽病菌菌丝的生长。在3种供试细菌中,两种凝集素粗品都只对枯草芽孢杆菌有抑制作用。3、菊花心江蓠凝集素的分离及特性研究菊花心江蓠凝集素粗品经过DEAE和Sephadex G-100两步分离纯化,得到分子量为69.7kDa的凝集素纯品。该纯品凝集素含有12.7%的中性糖。在80℃处理10min就全部失活,但在pH4.0-10.0之间都具有血凝活性。它的凝集活性会被葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖抑制,但不会被其它供试单糖抑制。菊花心江蓠凝集素纯品具有抑制球形棕囊藻的生长、抑制黑曲霉、枇杷炭疽病菌和玉米大斑病菌菌丝的生长及抑制枇杷炭疽病菌孢子萌发的作用。4、龙须菜凝集素的分离纯化及特性研究龙须菜凝集素粗品经过DEAE和Sephadex G-100两步分离纯化,得到分子量为31.8-34.8kDa左右的单亚基凝集素。该纯品经测定含有18.7%的中性糖。龙须菜凝集素纯品在90℃下处理70min仍具有25%的活性,在pH4.0-9.0下都还具有凝集活性。但其凝集活性会被D-木糖、D-果糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、麦芽糖、蔗糖及乳糖抑制。它能抑制中肋骨条藻的生长,抑制黄曲霉、圆弧青霉、黑曲霉、枇杷炭疽病菌及玉米大斑病菌菌丝生长,也能抑制枇杷炭疽病菌孢子萌发。
许高云[5]2009年在《河蚬体内脂类抗菌物质及凝集素的研究》文中认为用7种不同有机溶剂对河蚬(Corbicula fluminea)的软体部分进行浸泡提取,并以细菌和真菌对提取物进行抗菌活性检测。结果表明,乙酸乙酯是提取河蚬体内脂类抗菌物质的一种理想的极性有机溶剂。将河蚬软体部分用乙酸乙酯浸泡提取脂类物质,利用硅胶柱层析法和薄层层析法(TLC)分离粗提物。用圆形纸片法检测粗提物及各步纯化物的抗菌活性。然后用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析抗菌物质的主要化学成分。结果表明,抗菌活性较强的物质中大多是烷烃类物质。用PBS缓冲液对河蚬软体部分进行浸泡提取,得凝集素粗品,然后以13种动物及人的红细胞检测其凝集活力。结果表明,家兔的红细胞最敏感。将河蚬凝集素粗提液经(30%-40%)硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Sephacryl S-200-HR分子筛层析,得到河蚬凝集素(CFL)。测定CFL的分子量、中性糖含量、氨基酸组成,研究CFL的糖结合专一性、热稳定性以及pH值、EDTA和二价金属离子对CFL凝集活性的影响,同时检测CFL对9种藻类、12种细菌的细胞的凝集活性以及对6种真菌孢子萌发的抑制作用。结果表明,CFL分子是由单个的约46 KDa亚基构成的糖蛋白,其中性糖含量约为6.547%;除色氨酸(Try)未测出外,CFL可测出17种氨基酸,其中谷氨酸(Glu)的含量最高;CFL对家兔红细胞的凝集作用可被9种糖溶液不同程度的抑制,其中麦牙糖的抑制作用最明显;CFL在pH=7.0时,凝集活性最强,对碱性环境比较敏感;CFL的热稳定性较好,在80℃下处理15 min,仍有凝集活性;CFL的凝集活性在一定程度上依赖于某些二价金属离子,其凝集活性受到EDTA的抑制:CFL能选择性凝集本实验所用的9种藻类和12种细菌细胞,并能够抑制6种真菌孢子的萌发。
赵小亮[6]2013年在《利用糖芯片研究海洋多糖及其衍生物与蛋白质的相互作用》文中研究说明本论文分别从红藻多管藻(Polysiphonia senticulosa Harv.)和日本新管藻(Neosiphonia Japonica Harv.)中提取制备11种硫酸半乳聚糖，纯化多糖组分14个，从杜梨果实、叶片和银杏果皮制备4种果胶，1种葡聚糖和1种木聚糖，制备淀粉、琼胶和卡拉胶磷酸化与氧化衍生物9种，此40种多糖均为首次获得。活性研究发现，多管藻多糖组分PS3-2能有效延长活化部分凝血酶时间(APTT)，作用效果强于阳性对照低分子量肝素(LMWH)和藻酸双酯钠(PSS)，PS3-2和日本新管藻多糖NJ1-2均能延长凝血酶时间(TT)作用，表明具有较好的抗凝血活性；杜梨果实多糖PBP清除DPPH自由基半抑制浓度(IC50)为61.37μg·mL-1，小于阳性对照VC(197.60μg·mL-1)，PBP和杜梨叶片多糖PBPF均有较好的细胞病变(CPE)抑制活性，而PBPF可能是通过与流感病毒A/PR/8/34(H1N1)神经氨酸酶(NA)相互作用而发挥抗病毒活性；银杏果皮多糖GBC和GBH有抑制肿瘤细胞生长活性，GBLA和GBHA有抑制MDA-MB-231细胞生长活性；Agarose和ι-car磷酸化与氧化衍生物对CPE的抑制率明显增强，Agarose氧化产物不仅溶解性提高，对肿瘤细胞MDA-MB-231也有一定的抑制活性，同时磷酸化衍生物对羟自由基的清除活性得到明显提高，而κ-car衍生物活性均无明显变化；通过对FGF/FGFR介导的BaF3细胞增殖活性研究发现，红藻来源的硫酸半乳聚糖PS3-0.5、PS3-1.5、NJ1-0.8、NJ1-1.4和NJ1-1.6、银杏果胶GBC和木聚糖GBHA具有极显着的促进细胞增殖的活性；磷酸化和氧化修饰可提高ι-car和κ-car对BaF3细胞的增殖活性的，同时脱硫的κ-car (dsκ-car)及脱硫后磷酸化的κ-car (pκ-car)则无细胞增殖活性，表明硫酸基对于该细胞增殖作用强于磷酸基，而Agarose及其修饰物与其分子整体骨架相同，只是空间构型有差异，推测活性的提高在受电荷作用影响的同时，分子空间构象的变化也是重要因素。通过AF或FITC标记新制备荧光标记多糖50个，结合实验室糖库荧光多糖，通过对点样条件探索，首次制备了含有64个多糖探针，16×16方阵共256个样点的海洋多糖芯片。在利用岩藻糖凝集素橘果粉胞凝集素(Aleuria aurantia lectin,AAL)与多糖芯片作用证明多糖芯片研究多糖与蛋白质相互作用可靠的基础上，进一步研究了海洋多糖与H1N1HA蛋白、NA蛋白和NS1蛋白，乙型肝炎病毒(HBV)蛋白、胰淀素(Amylin)、结缔组织生长因子(CTGF)以及α-核突触蛋白(α-Synuclein)7种疾病相关蛋白质的相互作用。结果表明，多糖分子结构对结合活性有直接影响，特别是硫酸基、糖醛酸等酸性基团对活性有重要影响，而多糖的磷酸化、氧化修饰能显着提高多糖与蛋白质的结合活性。根据芯片实验结果利用红外光谱、一维NMR和二维NMR等技术，对与H1N1HA蛋白和NS1蛋白、CTGF和α-Synuclein有较强结合活性的多糖组分PS3-2的结构进行了表征。结果表明，PS3-2是分子C6-OH被硫酸基和丙酮酸取代的琼胶型多糖，二糖重复单元以硫琼胶[→3)β-D-G6S-(1→4)-3,6-AnG(1→]为主，还含有少量的[→3)β-D-GPA-(1→4)-3,6-AnG(1→]，二者的比例约为4.2:1。通过弱酸降解质谱分析，获得了硫琼胶叁糖、五糖和七糖，并首次发现了带有Xyl侧链的硫琼胶叁糖、五糖和七糖。综上，本文从多糖样品制备、芯片构建、与蛋白质相互作用、结果检测分析、活性多糖结构解析等方面，首次成功构建了海洋多糖芯片，并运用此技术研究了海洋多糖与几种疾病相关蛋白的相互作用，明确了与相关蛋白质结合的糖的特点，并对活性多糖进行了详细结构解析，为糖芯片的构建和应用提供了技术参考。
吴丽萍[7]2004年在《两种食用菌活性蛋白的分离纯化及其抗病特性》文中认为植物病毒病害造成重大的经济损失。解决作物上植物病毒的危害，一直是许多研究者的目标。从生物体中提取抗植物病毒物质是防治植物病毒病害的方法之一。本实验从食用菌中获得了两种抗植物病毒蛋白，其结果如下： 用离子交换层析(CM-Sepharose FF)和凝胶层析(Superdex~(TM) 75)方法，从新鲜食用菌毛头鬼伞(Coprinus comatus)子实体中分离纯化出一碱性蛋白y3，经SDS-PAGE及PAGE确定为单亚基组成，MALDI-TOF质谱确定其分子量为12.3kDa。以碘酸—Schiff染色法和酚—硫酸法测定蛋白含糖量高达30％。对其氨基酸组成进行分析后表明含有大量的精氨酸和天冬酰胺。y3蛋白N-端氨基酸序列为NRDVAACARFIDDFCDTLTP，经NCBI中Blast比较未发现同源序列，可能为一新的蛋白序列。在Swiss-Prot上登录号为P83477。制备了高效价抗血清，其效价为2~(-12)-2~(-13)，Western-Blot表明抗血清特异性高。毛头鬼伞菌丝体发酵后用ELISA和Western-Blot检测到菌丝体中同样含有蛋白y3。 y3蛋白活性检测结果显示：当其浓度为12.5μg.mL~(-1)时，在心叶烟枯斑寄主上对烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus，TMV)的侵染抑制率达83.0％；y3蛋白对兔血凝集活性滴度为2~(-5)，对人血凝集活性滴度为2~(-6)，其浓度分别为1.562μg.mL~(-1)和0.781μg.mL~(-1)，凝集活性能被半乳糖、γ-球蛋白、麦芽糖抑制；对叁种细胞即胃癌细胞株MGC80-3、肝癌细胞SMMC-7721，及肺癌细胞SPC-A_1体外抗性测定结果表明，y3蛋白对MGC80-3和SPC-A_1的抑制中浓度约为12.5μg.mL~(-1)，对SMMC-7721的抑制中浓度则较高，约30μg.mL~(-1)形态观察表明蛋白对SPC-A_1具有类似诱导凋亡作用；对供试的植物病原真菌和细菌均无抑制作用。 采用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析(DEAE-SepharoseFF)和凝胶层析(Sephacryl~(TM)-200 High Resolution)方法，从新鲜食用菌榆黄蘑(Plearotus citrinopileatus)中进行了抗病毒蛋白的纯化，结果获得一纯化蛋白YP46-46，经SDS-PAGE可确定为一约27.4 kDa的单亚基的蛋白。以碘酸—Schiff染色法和酚—硫酸法测定该蛋白不含糖。对其氨基酸组成进行分析后表明含有大量的酸性氨基酸。YP46-46 N-端序列为VYINKLTPPCGTMYYACEAV，经NCBI中Blast比较没发现同源序列，可能为一新的蛋白序列。在Swiss-Prot上登录号为P83481。制备了高效价抗血清，其效价为2~(-13)-2~(-14)，Western-Blot福建农林大学博士学位论文表明抗血清特异性高。 以半叶法在枯斑寄主心叶烟上检测Y尹46训陌蛋白对TMV的抑制率，发现有较好的抗TM万活性，其抑制们Mv的中浓度C50为0.240陀.功L.l OY卫46一6蛋白对兔和人血凝集活性滴度为2一7，其浓度分别为0.2 19陀.mL一利用MGCS压3、SMMc-7721，及SPc·A:检测蛋白的体外抗肿瘤活性，其Ics。约为加陀.mL一，.YP4“6蛋白对供试的植物病原真菌和细菌均无抑制作用。 对y3蛋白的抗TM，机制作了初步分析。结果表明y3蛋白对TM，不仅具有较强的体外钝化作用，而且能抑制病毒在系统寄主烟草丸26内的复制。在心叶烟枯斑寄主上对TMv的侵染抑制中浓度约为2.0陀.mL’，;最适工作pH为9.0;TM[V与y3蛋白混合后用RN姗处理，测得侵染率为61.74%，比未用RNase处理的对照降低了38.26%，说明y3蛋白对TMv的外壳蛋白具有一定的破坏作用;蛋白能抑制TMV-CP在体外的聚合，还能阻止 TMV-CP与其抗体的结合;另外电镜观察发现y3可使部分rMV粒体发生裂解，变短。通过叶绿素含盘检测显示蛋白能在一定程度上减缓植株感病后的症状. 提取毛头鬼伞中的总RNA，采用RACE方法和巢式一PCR技术，根据y3蛋白N·端20个氨基酸序列设计引物进行了基因克隆。获得了y3的部分cDNA序列以及3’端非编码区.其序列长度为414bp，其中oRF长度包括终止密码共291饰，编码蛋白序列共96个氨基酸，3，非编码区含有123个碱基，其中polyA为22个.经NcBI中Bl玻比较没找到同源序列，表明该基因为一全新序列(Ge血B助k接收号:602564)。加上N一端未用来设计引物的5个碱基，全长共101个氨基酸。等电点为8.17。该蛋白序列中有7个半耽氨酸，可形成分子内二硫键。蛋白在Swiss一Prot登录号P83811(登录时采用名称为CAP)。
张颖[8]2014年在《虾夷马粪海胆体腔液免疫因子及吞噬细胞活性的研究》文中认为为了探究虾夷马粪海胆体液免疫和细胞免疫机理，本实验对虾夷马粪海胆体腔液免疫因子：调理素样分子和体腔补体B因子进行检测；对影响体腔吞噬细胞吞噬活性的因素，即不同温度下吞噬活性的变化以及注射外源裙带菜凝集素对吞噬活性的影响。1为研究虾夷马粪海胆体液免疫机理，采用其体腔液吞噬细胞在不同介质中对不同处理的酵母细胞进行吞噬活性的测定；对其无细胞体腔液，从调理及非调理酵母细胞分离出的成分进行SDS-PAGE分析，并将无细胞体腔液透析、SephadexG-200凝胶层析和SDS-PAGE分析；在等渗缓冲液和酵母细胞吸附的无细胞体腔液中，不同调理素样分子浓度和不同时间中测定吞噬率的变化。结果显示，吞噬细胞在等渗缓冲液、酵母细胞吸附的无细胞体腔液和无细胞体腔液中对非调理酵母细胞吞噬率是之比为1.00:1.11:1.94，在等渗溶液中对调理酵母细胞的吞噬率是对非调理酵母细胞的吞噬率的1.61倍；从调理的酵母细胞分离出的成分SDS-PAGE分析后显示一条调理素样分子的带，分子量为250.62Ku。结果表明虾夷马粪海胆体腔液中存在能提高吞噬活性的调理素样分子。对虾夷马粪海胆无细胞体腔液经透析和SephadexG-200凝胶层析后，测得纯化的调理素样分子的分子量为250.62Ku；在所测试的浓度范围内，调理素样分子浓度越大，吞噬活性越高，且5.0μg/ml、10.0μg/ml组在各个测试时间均比对照组高。在等渗缓冲液中，反应30min时，10.0μg/ml组和5.0μg/ml组与对照组均有极显着差异(P<0.01)，在酵母细胞吸附的无细胞体腔液中，反应30min时，10.0μg/ml组与对照组有显着差异(P<0.05)。结果表明，在虾夷马粪海胆体腔液中发现一种调理素样分子，分子量约为250.62Ku，一定浓度的调理素样分子能显着提高虾夷马粪海胆体腔液吞噬细胞的吞噬活性。2为研究虾夷马粪海胆体腔液补体B因子，进一步阐明其体液免疫机理，采用高等哺乳动物血清中补体B因子溶血法检测其体腔液中补体B因子。对经过热处理以及不经热处理的虾夷马粪海胆体腔液补体B因子的溶血活性进行检测。结果显示虾夷马粪海胆体腔液中有补体B因子的存在，并且经过热处理的不含补体B因子的海胆体腔液的溶血活性明显低于不经热处理的含补体B因子的体腔液的溶血活性。结果说明虾夷马粪海胆体腔液中有补体B因子存在，且对热不稳定，与哺乳动物溶血法测定补体B因子的特征相同。3在不同时间和不同温度下测定吞噬细胞的吞噬率，以及注射裙带菜凝集素观察吞噬率的变化。结果显示虾夷马粪海胆体腔吞噬细胞在30℃，反应30min时的吞噬率最高；将提取的裙带菜凝集素粗提液注射虾夷马粪海胆，每24h注射一次，连续注射5d后，发现在注射后的不同时间内，叁种浓度的裙带菜凝集素：0.57mg/ml，0.28mg/ml，1.13mg/ml都可以显着或极显着的提高虾夷马粪海胆体腔吞噬细胞的吞噬活性，且0.28mg/ml组在提高吞噬率上的效果最佳，0.57mg/ml组在提高吞噬指数上的效果最佳。
胡艳南[9]2010年在《海萝藻（Gloiopeltis furcata）多糖的提取分离及其结构研究》文中研究表明海萝藻(Gloiopeltis furcata)为一年生海藻,属于红藻门内枝藻科海萝属。虽然从海萝藻的醇提物和水提物中发现了部分具有活性的小分子以及蛋白类物质,但海萝多糖被认为是其中主要的活性成分,表现出抗菌、抗炎、抗肿瘤、降血糖等生物学功能,是一种重要的海洋药物资源。由于海萝藻多糖的种类、成分复杂,要从事其深入构效关系研究,结构与序列的研究十分重要。本文以福建产海萝藻(Gloiopeltis furcata)为原料,依次用冷水、热水和热碱溶液提取,从中获得了3种多糖(GFW, GFH和GFA),其得率分别为57.9%,2.5%和2.6%。运用气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)及核磁共振碳谱(13C-NMR)等方法对其单糖组成、分子量以及结构特征进行了比较分析。结果表明,GFW和GFH属于含有D-半乳糖(Gal)和3,6-内醚-L-半乳糖(AnG)的硫酸半乳聚糖；而GFA除了含有Gal和AnG外,还有木糖,为含有木糖的硫酸半乳聚糖。经FTIR和13C-NMR分析表明,叁种多糖的硫酸基均在半乳糖残基C6位。在对多糖组分GFW基本理化性质研究基础上,运用强阴离子交换色谱(SAX)和低压凝胶渗透色谱(LPGPC)技术从GFW中分离纯化出3个纯品多糖(GW4、GW6和GW7),运用各种化学分析方法(理化性质分析,脱硫分析,气相色谱、甲基化反应)和波谱学方法(红外光谱R、紫外光谱UV和核磁共振波谱NMR等)对3个纯品多糖主链结构及糖基组成情况进行了深入研究。结果表明：GW4主要是由1,4-AnG和1,3-Gal6S结构片段构成,还含有部分1,3-Gal和6-O-Me-1,4-Gal结构片段的直链硫酸半乳聚糖。GW6是由1,4-AnG、1,3-Gal6S、1,3-Gal以及1,4-Gal6S组成的直链硫酸半乳聚糖。与GW4结构不同的是,GW6中没有甲基取代的半乳糖,但含有部分琼胶糖前体,其硫酸根含量高于GW4。GW7纯度高达98%,主要含3,6-内醚半乳糖和半乳糖,且两者摩尔比接近1：1。经1H-1H COSY和HMQC分析,确定GW7为C6位全部被硫酸根取代的琼胶糖,其重复的二糖结构单元为[→3Gal6Sβ1→4 AnGα1→]。本文应用酸水解及还原性酸水解两种方法对多糖组分GW7进行了可控酸降解,通过各种现代分离纯化技术获得系列寡糖,确定通过酸水解得到了5种奇数寡糖(dp3-11)；通过还原性酸水解得到了5种偶数寡糖醇(dp2-10),分别采用质谱序列分析方法对各寡糖结构和序列进行了分析,进一步阐明了该多糖的精细结构,也阐明了该糖的酸法降解机理。此外,将dp3和dp5通过还原胺化方法,首次制备成DHPE拟糖脂化合物,并研究了其与凝集素的相互作用,表明硫琼胶的寡糖脂能与RCA特异性结合,此结果为糖药物的研究和开发提供了理论与技术支持。综上所述,本文对海萝藻多糖进行了系统的提取、分离纯化研究,首次通过各种化学方法以及波谱学方法确定了3种多糖及10种寡糖的结构与序列,这些硫酸多糖和寡糖为从分子水平上进一步从事其构效关系研究,以及糖药物的研究和开发提供了基础。
黄维雅[10]2010年在《正红菇菌丝体凝集素的分离纯化与性质研究》文中研究指明本研究采用响应面法对液体深层培养的正红菇(Russula vinosa)菌丝体产胞内凝集素的培养条件进行了优化,确定了产凝集素的最适条件：淀粉3.04%,酵母粉0.3%,KH2PO40.2%, MgSO40.1%,装液量73 mL,转速250 r/min,初始pH 5,发酵时间5 d。在此条件下,菌丝体产胞内凝集素的总活力可达72127.3,与初始培养条件下的凝集素总活力25044.2相比提高了1.88倍。正红菇菌丝体经PB抽提,硫酸铵沉淀,DEAE-Sepharose FF离子交换层析和Sephadex G-100分子筛层析纯化得到一种凝集素(Russula vinosa Lectin简称RVL)。RVL的比活性比粗提液提高了73.3倍,活力回收率达54.4%。经SephadexG-100测得RVL的相对分子质量约为55kD。RVL在SDS-PAGE上显示单一的蛋白带,只含一个亚基。对RVL理化性质和部分生物学活性进行了研究。结果表明,RVL是一种糖蛋白,其中性糖含量为3.87%；以兔红细胞检测凝集活性,凝集活性在20-60℃温度范围内保持稳定；pH在5-9的范围内,RVL的凝集活性保持相对的稳定；RVL对Mn2+、Zn2+、Ca2+有不同程度的依赖作用；对糖的专一性研究表明,D-甘露糖是RVL的专一性抑制糖,蔗糖、D-半乳糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖在一定程度上对凝集活性有抑制作用；RVL的氨基酸组成分析显示,RVL中含有15种氨基酸,其中组氨酸的含量最高,不含有精氨酸和脯氨酸。抑菌实验显示,RVL对供试的细菌都没有抑制作用,对供试的部分真菌(红色面包霉、绿色木霉、稻瘟病菌、黑曲霉)菌丝生长有一定的抑制作用；对黑曲霉、绿色木霉、黄曲霉和稻瘟病菌孢子的萌发也没有显着的抑制作用。
参考文献：
[1]. 海藻凝集素的筛选、纯化及其性质[D]. 张永江. 福建农林大学. 2002
[2]. 一种褐藻—铁钉菜（Ishige okamurae）凝集素的研究[D]. 陈国强. 福建师范大学. 2008
[3]. 海藻中两种与植物抗病相关铜结合蛋白的分离、特性和基因特征[D]. 刘振宇. 福建农林大学. 2004
[4]. 红藻凝集素的分离纯化及特性研究[D]. 王月华. 福建师范大学. 2013
[5]. 河蚬体内脂类抗菌物质及凝集素的研究[D]. 许高云. 福建师范大学. 2009
[6]. 利用糖芯片研究海洋多糖及其衍生物与蛋白质的相互作用[D]. 赵小亮. 中国海洋大学. 2013
[7]. 两种食用菌活性蛋白的分离纯化及其抗病特性[D]. 吴丽萍. 福建农林大学. 2004
[8]. 虾夷马粪海胆体腔液免疫因子及吞噬细胞活性的研究[D]. 张颖. 大连海洋大学. 2014
[9]. 海萝藻（Gloiopeltis furcata）多糖的提取分离及其结构研究[D]. 胡艳南. 中国海洋大学. 2010
[10]. 正红菇菌丝体凝集素的分离纯化与性质研究[D]. 黄维雅. 福建师范大学. 2010
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