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【摘 要】目的：通过观察缺氧过程中大鼠心肌线粒体细胞色素氧化酶(COX)的表达含量的变化,探讨COX-1活性的改变及其调节的可能机制。方法：成年雄性Wistar系大鼠随机分为海拔2600m的对照组、缺氧3d、7d、15d和30d组。缺氧大鼠组于低压氧舱内模拟海拔5000m。采用实时定量PCR方法分析线粒体(COX-I)基因的表达。结果：缺氧15d内,COX活性持续性下降,与海拔2600m的对照组差异有显著性意义;缺氧30d时,COX活性较缺氧15d时明显升高,但仍低于平原水平,差异有显著性意义。各组线粒体COX-I基因表达量差异无显著性意义。结论：缺氧可影响心肌组织线粒体COX活性,这可能是缺氧导致线粒体氧化磷酸化功能改变的原因之一。
【关键词】细胞色素C氧化酶；基因表达；心肌组织；大鼠；缺氧
【中图分类号】R542.2 【文献标识码】A 【文章编号】1764-8999（2015）7-0789-01
高原是一种复杂的低温低压低氧环境，长期生活在高原低氧环境中对人体健康有不同程度的损伤。平原人进入高海拔地区后体内会发生一系列变化以适应这一特定环境，部分人会发生不同程度的高原反应和罹患高原病，从而使劳动能力下降，这是对高原低氧环境习服不良的整体表现。积极寻找促进高原习服和防治高原病的措施是当前高原医学研究的重点和前沿。细胞色素C氧化酶（cytochrome oxidaseCOX）是呼吸链电子传递的限速酶,在调节线粒体氧化磷酸化过程和能量产生中起着重要作用[1]。本实验通过研究不同缺氧时间线粒体功能的改变以及缺氧过程中大鼠心肌组织线粒体COX活性为揭示高原适应的分子机制提供新的线索。
1 材料与方法
1.1 实验材料：
材料：
1.1.1 实验动物：普通级Wistar大鼠，雄性，体重180±250g(兰州大学实验动物中心提供)。
1.1.2主要实验仪器及试剂：
-80℃超低温冰箱，低温超速离心机，匀浆器，PCR仪，氯仿，异丙醇，75%乙醇，无水乙醇，RNA逆转录试剂盒、COX-1引物
1.2 方法
1.2.1实验分组：随机分为实验对照组、缺氧3d、7d、15d和30d组，每组5只。缺氧大鼠于低压氧舱内模拟海拔5000m高原，到时间点后在舱内取材。实验对照组大鼠于舱外同时喂养、取材。
1.2.2总RNA提取
采用PAXgene Blood RNA kit提取冻存心肌组织中的总RNA：首先溶解冷冻心肌组织，裂解心肌组织，依说明书操作，最终样品溶于150ulRNAase free H2O中，用Nano Drop仪测量提取的总RNA的浓度及OD260和OD280的比值。
1.2.3 cDNA合成
根据提取的总RNA浓度，计算出每10ug需要的RNA体积，取出一组新的小离心管，按照计算的体积分别取出RNA将其与RNase-free水混合使总体积为11ul。用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，逆转录过程中使用了Oligo-dT(15)引物和RNA酶抑制剂，所有操作均按照试剂盒操作说明。反应体系的配制在冰上进行，反应体系如下:
1.2.5 Real-time PCR反应
实时定量PCR在Applied Biosystems ViiA7型定量PCR仪上进行，在PCR仪自带软件设定反应条件，94℃预变性3min，94℃30s，60℃45s，重复40个循环，4℃保存。阴性对照以无RNA酶的水代替CDNA模板，每列样品及阴性对照均设3个平行复孔，取均值。反应结束后由电脑自动得出荧光反应曲线。
1.3 统计学方法
统计学方法采用 SPSS 19. 0 统计软件，计量资料组间比较采用成组 t 检验。检验标准P<0.05
2 结果
缺氧组与实验对照组心肌组织线粒体复合物I、IV编码基因实时荧光定量PCR基因扩增曲线见图1 ，目的基因和内参基因的溶解曲线见图2，目的基因相对表达量及缺氧组与实验对照组之间比较结果见表2。
*：表示两组间基因表达量具有统计学意义。
3 讨论
3.1 急、慢性缺氧对大鼠心肌组织线粒体细胞色素氧化酶活性的影响及意义。
COX是调节线粒体氧化呼吸产能的限速酶、在能量代谢中起着重要作用，活组织90%以上的氧消耗与COX有关[2]。从急性到慢性缺氧过程中COX活性变化特点及意义则未见报道。本实验发现，急性缺氧15d内，大鼠心肌组织线粒体COX活性随缺氧时间的延长持续下降。缺氧30d时，COX活性较缺氧15d时明显升高，但仍低于实验对照组，表明心肌的有氧代谢水平有所恢复，这可能与心肌对慢性缺氧的适应以及心肌细胞基础代谢率的下降是缺氧耐受的心肌保护机制[3]。LaManna等[4]报道,缺氧时心肌组织线粒体COX活性下降，提示缺氧可通过影响COX活性而影响线粒体氧化呼吸功能。因此，我们推测，慢性缺氧时，COX活性的部分恢复是心肌对缺氧的适应机制之一。
3.2 缺氧过程中大鼠心肌线粒体COX活性变化与亚基蛋白量的关系
本实验发现，在缺氧的不同时间，线粒体内COX-1、IV的基因表达量并没有显著变化,提示COX亚基I、IV蛋白表达不是调节酶活性的主要因素。 COX活性的调节有两种方式:①定性调节,②定量调节。以往的研究认为，急性缺氧时COX活性变化主要通过定性调节方式,而慢性缺氧时主要以定量调节为主[5]。我们的研究表明，不论急性还是慢性缺氧，COX活性变化与线粒体内COX-I、IV蛋白量无直接关系。因此，缺氧条件下COX活性调节的机制有待进一步深入研究，这对于改善高原环境中循环系统的和加快机体的高原习服有重要意义。
参考文献：
[1] Lenka N .Vijayasarathy C Mullick J .et al . Structural organization and transcription of nuclear genes encoding the mammalian cytochrome c oxidase complex.Prog Nucleic Acid Res Mol Biol,1998,61(3):309-344
[2] Wong-Riley MT.Cytochrome oxidase:an endogenous metabolic marker for neuronal activity.Trends Neurosci,1989,12(3);94-101.
[3] Chavez JC,Pichiule P.Boero J,et al;Reduced mitochondrial respiration in mouse cerebral cortex during chronic hypoxia.Neurosci Lett,1995,193(3):169-172.
[4] LaManna JC,Kutina-Nelson KL,Hritz MA.et al;Decreasde rat brain cytochrome oxidase activity after prolonged hypoxia.Brain Res,1996,720(1-2):1-6
[5] Lutz PL.Mechanisms for anoxic survival in the vertebrate brain .Annu Rev Physiol,1992,54:601-618
论文作者:李欣慧1,周白丽 1
论文发表刊物:《中医学报》2015年7月
论文发表时间:2015/10/19
标签：线粒体论文; 心肌论文; 活性论文; 高原论文; 大鼠论文; 基因论文; 组织论文; 《中医学报》2015年7月论文;