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摘要：抗生素不仅能杀灭细菌而且对霉菌、支原体、衣原体等其它致病微生物也有良好的抑制和杀灭作用，因此用于治疗各种细菌感染或抑制致病微生物感染。在牛饲料中添加预防疾病的含有抗生素的饲料添加剂已经十分普遍，而乳糖作为牛奶的加工产品，也有抗生素残留的风险。乳糖被广泛应用到婴儿食品，因此乳糖质量问题备受关注。本文研究了使用嗜热脂肪芽胞杆菌抑制法检测乳糖中的抗生素残留。
关键词：乳糖；抗生素；检验
食品中抗生素残留的检测方法有理化检测法、微生物检测法、免疫法等多种方法[1]。理化检测法结果稳定、重复性好、精确性高，但是检测程序复杂、费用较昂贵；免疫分析技术操作简单、速度快，但是某些待测物的半抗原难以合成，方法建立过程复杂；[2]而微生物检测法简便、检测成本低，一般实验室均能检测。[3]GB/T 4789.27-2008 《食品卫生微生物学检验 鲜乳中抗生素残留检验》第二法：嗜热脂肪芽胞杆菌抑制法适用于鲜乳中能抑制嗜热脂肪芽胞杆菌卡利德变种的抗生素的检验，也可用于复原乳、消毒灭菌乳、乳粉中抗生素的检测。因此选择这个方法作为检验乳糖抗生素残留的检验方法。
1、设备、材料和培养基
恒温培养箱、冰箱、恒温水浴箱、100μL、200μL微量移液器及吸头、离心机、嗜热脂肪芽胞杆菌卡利德变种、无菌磷酸盐缓冲液、灭菌脱脂乳、溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基、青霉素G参照溶液等。
2、操作步骤
将嗜热脂肪芽胞杆菌菌种划线移种于营养琼脂平板表面，56℃±1℃培养24h后挑取乳白色半透明圆形特征菌落，在营养琼脂平板上再次划线培养，56℃±1℃培养24h后放在室温一个星期（GB/T 4789.27-2008是转到36℃±1℃培养3~4d，经过实验证明用此方法芽胞产率远低于95%，只有不到10%的芽胞产率。），挑取适量菌染色后镜检芽胞产率，观察芽胞产率达到95%以上时进行芽胞悬液的制备。每块平板用1mL~3mL无菌磷酸盐缓冲液洗脱培养基表面的菌苔。将洗脱液5000r/min离心15min。取沉淀物加0.03mol/L的无菌磷酸盐缓冲液（pH7.2），制成109CFU/mL芽孢悬液，置80℃±2℃恒温水浴中10min，密封防止水分蒸发，置2℃~5℃保存备用。
在100mL溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基中加入100μL芽胞悬液，混合均匀，使最终的芽孢浓度为8×105CFU/mL~2×106CFU/mL。混合芽胞悬液的溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基分装小试管，每管200μL，密封防止水分蒸发。
称取16份25g的乳糖，分别加入到225mL的无菌磷酸盐缓冲液中，置于65℃水浴加热溶解，均质。其中4份样品加入1mL3mg/L青霉素G溶液作为加标样品1#~4#，另外4分样品加入1mL750μg/L青霉素G溶液作为加标样品5#~8#，剩下8份样品什么都不加。两个样品分别吸取100μL加入含有芽孢的测试培养基中，轻轻旋转试管混匀。每份检样做两份，另外再做阴性（无菌脱脂乳）和阳性对照（0.006IU/mL青霉素G参照溶液）各一份，于65℃±2℃水浴培养2.5h，观察培养基颜色的变化。如果颜色没有变化，须再于水浴中培养30min作最终观察。
在白色背景前从侧面和底部观察小试管内培养基颜色。保持培养基原有的紫色为阳性结果，培养基变成黄色或黄绿色为阴性结果，颜色处于二者之间，为可疑结果。对于可疑结果应继续培养30min再进行最终观察。
3、检出限
分别吸取100μL 6μg/L、4μg/L、3μg/L、2μg/L、1.5μg/L的青霉素G溶液加入到含有芽胞的溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基中，轻轻旋转混匀。每份检样做7份，另外用灭菌脱脂乳做阴性对照一份，于65℃±2℃水浴培养2.5h。
4、结果与结论
乳糖样品和加标乳糖样品结果见表一：
阴性对照和没有添加青霉素G溶液的乳糖样品检测结果为抗生素残留阴性，阳性对照和加标乳糖样品检测结果为抗生素残留阳性。
检出限结果见表二：
当青霉素G溶液浓度为3μg/L时，抗生素残留结果为阳性，符合GB/T 4789.27-2008要求的检出限3μg/L。
根据上述结果，证明可使用嗜热脂肪芽胞杆菌抑制法检测乳糖中抗生素残留。
5、结束语
嗜热脂肪芽胞杆菌抑制法检测抗生素残留虽然检测成本低，但是嗜热脂肪芽胞杆菌培养芽胞的时间长，配制培养基需要经验丰富的实验员操作。还需要研发一些简便、快速、准确、成本低并且符合国家标准要求的检验方法，方便企业基础实验室对于抗生素残留的监控。
参考文献：
[1]李友杰，许杨，郭杰标，牛奶中抗生素残留及其检测技术的研究进展[J].食品工业科技，2008，29（8）：381-384.
[2]曹亢，曹雪，牛奶中抗生素残留检测方法的研究进展及展望[J].中国乳业，2009，9：62-65
[3]刘安军，高美虹，黄运丽，牛奶中抗生素残留检测方法的研究进展及展望[J].湖北农业科学，2010，49（6）：1481-1483.
论文作者:宋伟清
论文发表刊物:《基层建设》2018年第23期
论文发表时间:2018/9/11
标签：抗生素论文; 乳糖论文; 培养基论文; 样品论文; 杆菌论文; 青霉素论文; 水浴论文; 《基层建设》2018年第23期论文;