于春泳[1]2002年在《成熟大鼠脑神经干细胞的分布及损伤后的表达与增殖》文中指出目的：探讨成熟大鼠脑内神经干细胞的分布部位以及在脑组织受损后神经干细胞的表达与增殖情况。方法：取成熟大鼠，通过Nestin免疫组化染色观察神经干细胞在脑内的分布；根据立体定向仪横断成熟大鼠皮质和内囊，于术后1周、2周、3周、4周分别杀死动物。用Nestin免疫组化染色和Nissl染色的方法，观察损伤后成熟大鼠脑内神经干细胞的反映模式。结果：成熟大鼠神经干细胞主要分布在侧脑室室管膜下区。在损伤后伤侧侧脑室、对侧侧脑室和叁脑室室管膜下区的神经干细胞明显分裂增殖，伤后1周最显着；在伤口处表达为一个以伤口为中心的梯度递减模式，伤后2周最显着。结论： 第网军医大学硕士学位论义 成熟大鼠神经干细胞主要分布在侧脑室室管膜下区，脑损 伤后可诱导室管膜下区的神经干细胞增殖，进而表达为伤 D周围的神经干细胞梯度递减反应模式，提示神经于细胞 对于脑组织损伤后的修复起着重要作用。
任秀君[2]2007年在《针刺对高血脂合并脑缺血大鼠神经干细胞和神经营养因子的影响》文中指出研究目的:高脂血症(hyperlipidemia,HLP)由血中脂蛋白合成与清除紊乱所致,表现为血浆脂蛋白异常、血脂增高等,属于祖国医学的“痰浊”“瘀血”范畴。它是动脉粥样硬化等心脑血管疾病发生的重要危险因素,有效地防治HLP是防治心脑血管疾病的重要途径。脑血管疾病是目前严重危害人类健康的主要疾病之一。在我国死于脑血管病者居叁大死因首位。其中缺血性脑血管疾病占60%～80%。脑血管病具有发病率高、致残率高、死亡率高的“叁高”特点,是威胁人类尤其是中老年人健康的常见病、多发病。为了减少和延缓中风的发生,减轻中风后机体状态,从高血脂阶段早期进行针刺干预,是针刺防治中风的新视角,具有重要流行病学研究意义。高血脂与中风,神经干细胞与神经营养因子之间的关系是目前研究尚未进行探讨的部分,本研究试图通过建立高血脂合并脑缺血动物模型,并观察针刺的影响,探讨在高血脂阶段积极早期进行针刺干预,是否可通过升高神经营养因子的合成与分泌,从而促进神经干细胞的增殖、迁移和分化,促进脑损伤的修复和再生。研究方法:应用大鼠喂养经典高脂饲料,化学诱导大脑中动脉血栓闭塞制造高血脂合并脑缺血模型。将动物随机分为八组:正常对照组、高血脂模型组、高血脂治疗组、脑缺血模型组、脑缺血治疗组、高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ、Ⅱ组。高血脂治疗组用电针叁阴交、丰隆穴治疗10天。脑缺血治疗组用针刺人中、百会穴治疗7天。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ、Ⅱ组,先给大鼠喂养高脂饲料造成高血脂模型,治疗Ⅰ组电针叁阴交、丰隆穴10天后,两组同时电针叁阴交、丰隆穴,针刺人中、百会穴,7天后处死。正常对照组和模型组均不针刺。用生化方法检测各组治疗前后血脂四项。应用神经行为学指标观察治疗前后神经症状的改善情况。实验结束用免疫组化方法检测海马区和额叶皮层脑缺血病理改变、室管膜下区和大脑额叶皮层nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达情况。用酶联免疫法(ELISA)检测右侧大脑匀浆中神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)浓度。实验结果:1高血脂合并脑缺血模型的建立本实验选用经典高脂饲料喂养6周造成高脂血症大鼠模型,在此基础上用大脑中动脉FeCl3刺激血栓性闭塞法造成局灶性脑缺血,最终造成高血脂合并脑缺血模型。预实验结果显示,与同时段正常对照组比较,高血脂组4周、6周CHO、LDL-C、TG升高有显着差异,P<0.01,HDL-C没有显着差异。说明高脂饲料喂养4-6周可以造成大鼠高血脂模型。由于高血脂形成时间较长,饲养6周的高血脂症大鼠模型更近似于人类高血脂症的病理变化,正式实验定为6周。正式实验,42天,高脂饮料喂养的各组大鼠的CHO和LDL-C、TG与正常对照组大鼠比较,升高有显着性差异,P<0.01。HLD-C降低有显着性差异,P<0.01。证明高血脂症大鼠造模成功,可以进行实验。52天脑缺血造模后,在MCAO清醒(术后约1h)后,在1～2h内观察模型动物有脑缺血模型出现的神经功能缺失症状,各组大鼠在造模后1～2h的神经症状行为在评定上均有阳性反应,与正常对照组比较均有显着性差异p<0.01。HE染色结果可见,实验组动物脑缺血造模后,缺血灶出现在额叶,位置比较恒定,缺血灶内细胞排列散乱,并见大量神经元变性坏死,出现脑水肿表现,海马区大量神经元变性坏死,排列紊乱,各组有不同程度的神经元脱失现象等病理改变,说明本实验的脑缺血模型制作是成功的。本实验首次建立高血脂合并脑缺血的动物模型,此模型成功率高,死亡率小,重复性好,充分模拟了人类疾病的病理及生理改变。2正常大鼠血脂、HE染色结果、神经干细胞、NSE、神经营养因子的表达正常大鼠CHO 51.92±9.46mg/dL, HDL-C 26.80±8.16 mg/dL,LDL-C 30.50±8.19 mg/dL,TG47.98±12.18 mg/dL。HE染色结果显示,大鼠右侧海马区和额叶皮层神经细胞排列清楚,细胞形态清晰。神经干细胞标志,nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞,在正常大鼠右侧脑内表达较少,在前脑背外侧伸展、侧脑室外侧壁可观察到散在的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的阳性细胞(背外侧伸展nestin:阳性细胞数63±9.40;面密度0.62±0.10%;光密度0.50±0.03%。PCNA:阳性细胞数185±10.60;面密度1.93±0.11%;光密度1.22±0.07%。vimentin:阳性细胞数95±6.31;面密度0.61±0.04%;光密度0.34±0.02%。Tuj-1:阳性细胞数56±7.69;面密度0.96±0.13%;光密度0.22±0.03%。侧脑室外侧壁:nestin:阳性细胞数41±5.61;面密度0.35±0.05%;光密度0.23±0.03%。PCNA:阳性细胞数114±22.79;面密度1.25±0.25%;光密度0.94±0.19%。vimentin:阳性细胞数48±11.85;面密度1.05±0.26%;光密度0.58±0.14%。Tuj-1:阳性细胞数35±4.69;面密度0.88±0.12%;光密度0.45±0.06%。)正常对照组大脑右侧额叶皮层相应区域表达更少。(nestin:阳性细胞数14±3.47;面密度0.11±0.03%;光密度0.09±0.02%。PCNA:阳性细胞数58±6.52;面密度0.64±0.07%;光密度0.39±0.04%。vimentin:阳性细胞数56±6.46;面密度0.22±0.03%;光密度0.11±0.01%。Tuj-1:阳性细胞数13±5.14;面密度0.08±0.03%;光密度0.05±0.02%。)右侧大脑匀浆中NSE(41.70±3.47 ng/dL)及神经营养因子NGF(79.36±7.07 pg/ml)、BDNF(5.66±0.86μg/L)、bFGF(51.20±6.05 ng/L)含量呈基础表达。3针刺对实验性高血脂大鼠的治疗作用3.1针刺对实验性高血脂大鼠血脂的作用经针刺治疗后,和高血脂模型组相比,高血脂治疗组大鼠的CHO、LDL-C、TG降低有极显着差异,P<0.01。HLD-C升高有极显着差异,P<0.01。说明针刺能降低实验性高血脂大鼠CHO、LDL-C、TG,升高HLD-C,调节血脂水平。3.2针刺对实验性高血脂大鼠右侧大脑SVZ和额叶皮层神经干细胞的作用nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1在实验性高血脂造模后大鼠脑内表达较少,在室管膜下区SVZ、背外侧角可观察到散在的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的阳性细胞,额叶皮质表达更少,与正常对照组相比,其阳性细胞数、面密度、光密度没有显着差异,P>0.05。针刺对实验性高血脂大鼠nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达影响不大。3.3针刺对高血脂大鼠右侧脑组织匀浆中NSE的作用高血脂造模后,右侧脑匀浆中NSE浓度与正常脑匀浆中NSE浓度没有显着差异,P>0.05,说明高血脂本身不能影响右侧脑组织中NSE的分泌与合成。高血脂大鼠治疗组和模型组之间没有显着差异,说明针刺不能影响实验性高血脂大鼠NSE的分泌。3.4针刺对实验性高血脂大鼠右侧脑组织匀浆中神经营养因子的作用与正常对照组比较,高血脂模型组大鼠大脑匀浆中NGF、BDNF、bFGF含量明显降低,P<0.05或P<0.01;与高血脂模型组比较,针刺治疗组BDNF显着升高,P<0.05,NGF、bFGF没有显着差异,P>0.05,但有升高的趋势。实验结果提示高血脂可降低大鼠大脑中NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成,针刺可升高高血脂状态某些神经营养因子的含量,如BDNF。4针刺对实验性脑缺血大鼠的治疗作用4.1针刺对实验性脑缺血大鼠脑缺血后神经行为评分和脑缺血病理改变的作用59天,与正常对照组比较,脑缺血模型组和脑缺血治疗组神经症状评分升高有极显着性差异,p<0.01;与脑缺血模型对照组比较,脑缺血治疗组的神经症状评分降低有极显着性差异,p<0.01。HE染色结果显示,脑缺血治疗组缺血区周围组织水肿减轻,无明显的细胞空泡变性,细胞核正常。海马CA3区结构完整的神经细胞明显增多,变性坏死细胞较少,细胞周围间隙明显缩小,血管病变主要以内皮细胞肿胀,空泡形成为主。说明针刺治疗对局灶性脑缺血大鼠具有显着的治疗作用。4.2针刺对实验性脑缺血大鼠脑缺血后缺血侧SVZ和额叶皮层神经干细胞的作用脑缺血后,大鼠缺血侧前脑室管膜下区(背外侧伸展、侧脑室外侧壁)、缺血区额叶皮层nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1强表达,并有多层阳性细胞,背外侧角可见大量的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞,并向外形成了背外侧伸展,脑缺血区可见散在的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达。与正常对照组比较,脑缺血模型组、治疗组nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异,P<0.01;与脑缺血模型组比较,脑缺血治疗组各项升高均有极显着差异,P<0.01。脑缺血后存在神经干细胞的增殖,并有一部分神经干细胞有向胶质细胞和神经元祖细胞定向分化的趋向。针刺后各项指标高于脑缺血组。说明针刺可提高实验性脑缺血大鼠大脑侧脑室背外侧伸展、侧脑室外侧壁、缺血区nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的表达。针刺结果显示,针刺可促进大脑SVZ和额叶皮层神经干的增殖,并能促进神经干细胞向胶质细胞和神经元祖细胞定向分化,同时可能促进神经干细胞从SVZ区向缺血区迁移。4.3针刺对实验性脑缺血大鼠缺血侧脑组织匀浆中NSE的作用与正常组相比,脑缺血模型组大脑匀浆中NSE含量明显上升,有极显着性差异,P<0.01;与脑缺血模型组相比,脑缺血治疗组大脑匀浆中NSE含量降低有极显着差异,P<0.01。实验结果提示:脑缺血后,脑匀浆中NSE浓度显着升高,说明出现脑损伤。针刺可降低NSE浓度,从而减轻脑损伤。4.4针刺对实验性脑缺血大鼠脑缺血后缺血侧脑组织匀浆中神经营养因子的作用与正常组相比,脑缺血模型组缺血侧脑组织匀浆中NGF、BDNF、bFGF含量明显上升,有显着性差异,P<0.05;与脑缺血模型组相比,脑缺血治疗组缺血侧脑组织匀浆中NGF、bFGF含量升高有显着差异,P<0.05或P<0.01。实验结果提示脑缺血后,缺血侧脑组织匀浆中NGF、BDNF、bFGF浓度显着升高,说明脑缺血后,自身可分泌神经营养因子,从而产生一定的脑保护作用。针刺可通过促进缺血侧大脑NGF、bFGF的分泌与合成,加强脑保护作用。5针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠的治疗作用5.1针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠血脂的作用经针刺治疗后,与正常对照组比较,高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血模型治疗Ⅰ组、Ⅱ组CHO、LDL-C升高有极显着性差异,P<0.01;高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血模型治疗Ⅱ组TG升高,有极显着性差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血模型组比较,治疗Ⅰ组CHO、TG、LDL-C降低有显着性差异,P<0.01或P<0.05,治疗Ⅱ组没有显着差异,P>0.05;与治疗Ⅰ组比较,治疗Ⅱ组CHO、LDL-C、TG没有显着差异,P>0.05;HDL-C,各组之间比较没有显着差异,P>0.05,但与42天比较,治疗Ⅰ组HDL-C升高有显着差异,P<0.01。本实验表明,针刺可降低高血脂合并脑缺血大鼠CHO、TG、LDL-C水平,升高HDL-C水平,高血脂合并脑缺血模型治疗治疗Ⅰ组疗效好于治疗Ⅱ组,从而说明从高血脂阶段积极介入针刺治疗,可更好、更有效地调节血脂水平。5.2针刺对实验性高血脂合并脑缺血脑缺血后神经行为评分和脑缺血病理改变的作用与合并模型组比较,合并治疗组神经症状评分显着降低,p<0.05;与合并治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组没有显着差异,p>0.05,说明针刺治疗对局灶性脑缺血大鼠具有显着的治疗作用。针刺后缺血区HE结果显示,针刺后缺血区周围组织水肿减轻。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组水肿程度最轻,无明显的细胞空泡变性,细胞核正常。海马CA3区结构完整的神经细胞明显增多,变性坏死细胞较少,细胞周围间隙明显缩小,血管病变主要以内皮细胞肿胀,空泡形成为主。说明电针在高血脂成模后积极治疗可减轻脑损害。5.3针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠缺血侧SVZ和额叶皮层神经干细胞的作用高血脂合并脑缺血模型组前脑侧脑室背外侧伸展、侧脑室外侧壁、额叶缺血区nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞的表达弱于单纯脑缺血模型组。与正常对照组比较,高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组、Ⅱ组阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组、Ⅱ组阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组比较,高血脂合并脑缺血Ⅱ组各项降低有极显着差异,P<0.01。实验结果提示高血脂可减弱脑缺血后nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞的表达。即高血脂可减弱脑缺血后神经干细胞的增殖,迁移和分化。针刺可提高高血脂合并脑缺血模型大鼠大脑侧脑室背外侧伸展、侧脑室外侧壁、缺血区nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的表达。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组比Ⅱ组各项表达要强,说明在高血脂阶段介入治疗,更能提高nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达。针刺结果显示,针刺可促进高血脂合并脑缺血模型大鼠大脑SVZ和额叶皮层神经干的增殖,并能促进神经干细胞向胶质细胞和神经元祖细胞定向分化,同时可能促进神经干细胞从SVZ区向缺血区迁移。说明在高血脂阶段介入治疗,更能促进神经干细胞的增殖,分化和迁移。5.4针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠缺血侧脑组织匀浆中NSE的作用与正常对照组和脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血模型组大脑匀浆中NSE含量显着上升,有显着性差异,P<0.05,P<0.01。与正常对照组相比,合并各组缺血侧大脑匀浆中NSE含量明显上升,有极显着性差异,P<0.01;与合并模型组比较,合并治疗Ⅰ组、Ⅱ组下降有显着差异P<0.01,P<0.05;与高血脂合并脑缺血模型治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组升高有显着差异P<0.05。实验结果提示,高血脂合并脑缺血可加重脑缺血后脑损伤,针刺可减低高血脂合并脑缺血大鼠的脑损伤,尤其在高血脂阶段介入针刺治疗的治疗Ⅰ组疗效远远好于治疗Ⅱ组。5.5针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠缺血侧脑组织匀浆中神经营养因子的作用与正常对照组、脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血模型组NGF、BDNF、bFGF降低有极显着差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血模型组比较,治疗Ⅰ组和治疗Ⅱ组NGF、bFGF上升有显着差异P<0.01;与高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组NGF、BDNF降低有显着差异P<0.01。实验结果提示:高血脂可降低脑缺血后脑自身的保护作用,针刺可通过促进NGF、BDNF、bFGF的分泌和合成,从而起到脑保护的作用。针刺治疗Ⅰ组的NGF、BDNF高于Ⅱ组,说明在高血脂阶段积极进行针刺治疗可更好的提高神经营养因子分泌,从而起到脑保护的作用。实验结论:1高血脂合并脑缺血模型的建立是成功的。2高血脂本身并不能影响实验性高血脂大鼠右侧室管膜下区和右侧额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,和右侧脑匀浆中NSE的表达,但能降低右侧大脑匀浆中神经营养因子,如NGF、BDNF、bFGF的分泌。3脑缺血能增强实验性脑缺血大鼠缺血侧室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,促进缺血侧脑组织中NSE的分泌,促进缺血侧脑组织中NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。4高血脂合并脑缺血,可减弱脑缺血后室管膜下区和右侧额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,促进缺血侧脑组织NSE的分泌,降低缺血侧脑组织NGF、BDNF、bFGF的分泌,减弱大脑的自我保护作用。5针刺“丰隆”、“叁阴交”,可降低实验性高血脂大鼠CHO、TG、LDL-C,升高HDL-C水平。针刺不能影响实验性高血脂大鼠高血脂后大脑右侧室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,和右侧脑组织中NSE的分泌,但能促进右侧脑组织中BDNF的分泌与合成。6针刺“百会”“人中”可改善实验性脑缺血大鼠神经行为症状评分,改善脑缺血状态,降低缺血侧NSE的分泌,增强实验性脑缺血大鼠缺血侧大脑室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,促进大脑缺血侧脑组织NGF、bFGF的分泌与合成。7针刺可降低高血脂合并脑缺血大鼠CHO、TG、LDL-C水平,升高HDL-C水平,改善高血脂合并脑缺血模型大鼠神经行为症状评分,改善脑缺血状态,可提高高血脂合并脑缺血后缺血侧室管膜下区和缺血区神经干细胞的增殖、迁移与分化,降低缺血侧脑组织中NSE的分泌,促进缺血侧脑组织中神经营养因子NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。8从高血脂阶段积极介入针刺治疗,可更好、更有效地调节血脂水平,改善脑缺血状态,明显提高高血脂合并脑缺血后缺血侧室管膜下区和缺血区神经干细胞的增殖、迁移与分化,降低缺血侧大脑NSE的分泌,促进缺血侧大脑匀浆中神经营养因子NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。9针刺能通过促进缺血侧脑组织NGF、BDNF、bFGF的分泌,降低NSE分泌,促进神经干细胞的增殖、迁移和分化,从而促进神经元的修复和再生。综上所述本实验结果显示,神经营养因子和神经干细胞增殖、迁移、分化之间存在必然联系。在实验性脑缺血和实验性高血脂合并脑缺血大鼠脑缺血造模后,神经营养因子含量的升高,往往同神经干细胞的增殖同时出现,所以猜测本实验脑缺血后是神经营养因子的升高促进了神经干细胞的增殖、迁移和分化。实验结果表明,针刺作为一种治疗手段在一定程度上促进了神经营养因子的分泌,从而最终促进了脑缺血后神经干细胞增殖、迁移、分化,尤其在高血脂阶段针刺治疗可减轻脑缺血后损伤,促进神经元的修复与再生。
佚名[3]2006年在《神经发育、损伤和再生》文中研究表明1．学习记忆能力与齿状回神经干细胞增殖的关系研究杨伯宁周叁国龚健古蓝玲广西医科大学人体解剖学教研室南宁 530021 探讨学习记忆能力与齿状回神经干细胞增殖之间存在的关系。成年雄性昆明小鼠随机分为水迷宫训练组和对照组(不学习组)。而水迷宫训练组,又根据小鼠找到平台时间的长短,分为学习记忆能力强和学习记忆能力较弱二组。在水迷宫训练后的第1、7、14天,分别检测3组小鼠海马齿状回神经干细胞的增殖情况。结果表明,学习能力弱的小鼠其海马齿状回神经干细胞增殖的数目与对照组(对不学习组)相比较,无显着性差异,而学习记忆能力较强的小鼠,其海马齿状回神经干细胞增殖的数目显着多于学习记忆能力较弱的小鼠和不学习组,并且增殖细胞的存活时间也比学习记忆能力较
熊雷[4]2010年在《生理性低氧对神经干细胞中miR-210的表达调控及功能研究》文中认为神经干细胞(neural stem cells, NSCs)具有自我更新和分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力,在神经功能损伤修复以及相关中枢神经系统疾病的治疗中具有重大的应用价值。NSCs体外培养技术的发展为干细胞移植提供了稳定而安全的来源。对临床应用来说,NSCs是否具有良好的增殖状态和定向分化能力十分重要。传统NSCs培养系统一般都采用20%O2的大气氧浓度,实际上在发育过程与成年脑组织中,局部氧水平较低,平均约1—5%,一些学者称之为“生理性低氧”。这种局部微环境低氧对NSCs增殖与分化的影响尚没有引起人们的注意。最近的研究发现低氧这一物理因素能够有效促进体外培养NSCs的增殖,并能调节NSCs的分化方向,低氧诱导因子-1 (hypoxia inducible factor-1,HIF-1)可能在这一过程中发挥着重要作用。但是关于低氧调控NSCs发育的具体机制仍有许多未明之处。miRNAs (microRNAs)是内源产生的一类～22 nt大小的非编码RNA,它可以通过翻译抑制或RNA剪切影响多种靶基因的表达,从而调控细胞的生长发育等。研究发现多种miRNAs在神经系统中时序性和组织特异性地表达,表明它们在神经系统的发育中可能具有重大的调控作用。低氧作为胚胎发育和成年脑组织的生理环境,很可能通过调节这些miRNAs的表达而影响神经干细胞的增殖和分化。本研究利用微阵列技术筛选了一批在NSCs中特异表达和表达水平受低氧调控的非编码RNA,并对其中表达水平变化明显的miRNAs进行验证。然后我们选取了低氧下表达变化最显着的miR-210,从HIF-1调控通路和DNA甲基化调控两个方面深入研究低氧诱导miR-210表达的机制,并对miR-210在NSCs中的功能进行了初步探索。一、NSCs的分离培养鉴定以及低氧时NSCs中HIF-1α稳定的机制我们从E13.5的SD大鼠中脑分离培养出生长状态良好的NSCs,将细胞用免疫荧光染色进行Nestin鉴定,结果表明几乎所有的细胞都表现为Nestin阳性。用血清诱导NSCs分化后,我们用神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的标志蛋白Tuj1 (β-tubulinⅢ). GFAP和CNPase来评估培养细胞的分化潜能,结果表明NSCs能成功地分化出叁种细胞型。这些实验表明我们成功地获取了具有自我更新和分化能力的NSCs,可用于后续的实验。前期的研究显示HIF-1在低氧促NSCs增殖中发挥着关键作用,我们又进一步补充了HIF-1a在低氧下稳定的机制。将NSCs分别置于20%02和3%02环境培养1、3、6、12、24、48、72 h, Western Blot检测表明低氧诱导了不同时间点HIF-1a的表达。而用HSP90的特异性抑制剂格尔德霉素(GA)处理NSCs能时间依赖性和剂量依赖性地下调HIF-1a的蛋白表达水平,并显着降低HIF-1的靶基因VEGF和EPO的表达。用CCK-8法检测发现与20%02相比,3%O2能显着提高NSCs的存活率,而GA处理后细胞存活率显着下降。另外,用流式细胞法检测NSCs的增殖指数(PI)和细胞周期发现低氧能显着促进NSCs的增殖,并增加了S期的细胞,GA处理后则能逆转这一效应。研究表明HSP90参与维持了HIF-1a的蛋白稳定,抑制HSP90活性能降低HIF-1α的蛋白水平并影响NSCs的增殖。二、低氧下NSCs中表达变化的miRNAs的芯片筛选及表达验证将生长状态良好的NSCs分别置于常氧(20%02)和低氧(3%02)环境培养叁天后,用非编码RNA (ncRNAs)芯片分析低氧对NSCs中ncRNA表达的影响。研究显示15种低氧后表达明显上调的ncRNAs和11种表达下调的ncRNAs。接着用Real-Time PCR的方法选取一批低氧表达上调的miRNAs进行表达验证,结果表明低氧能诱导miR-210、376a、221、497、338、301、148a、34a、146b、181d、350、29b和344等的表达增加,其中miR-210变化最为显着,NSCs在3%02环境培养3天后,miR-210表达水平上调了15倍,在0.3%02环境则上调了80倍之多。对这些miRNAs的调控序列进行生物信息学分析发现其中miR-210、miR-338、miR-497、miR-29b/29c和miR-148b这6种miRNA调控序列含有HIF-1的识别序列HRE元件,提示低氧时它们的表达可能与HIF-1途径相关。叁、低氧时NSCs中miR-210表达调控机制的研究为了研究HIF-1是否调控了miR-210等的表达,我们将miR-210、miR-338和miR-497叁种miRNA的调控序列构建到pGL3-Basic荧光素酶载体中,同时构建了pEGFP-HIF-1过表达载体。载体共转染HeLa细胞后,用双荧光检测法检测荧光素酶活性,发现低氧能显着上调pGL3-210荧光素酶活性,而过表达HIF-1在常氧时也能显着增加pGL3-210荧光素酶活性。结果表明HIF-1直接参与了miR-210的表达调控,而miR-338和miR-497的表达则不受影响。此外,我们用染色质免疫沉淀法(ChIP)分析,发现从HIF-1蛋白上洗脱的DNA模板中能扩增出miR-210调控序列片段,证明了HIF-1直接结合miR-210基因序列从而调控其表达。我们接着分析了DNA甲基化对miR-210的表达调控。软件分析发现miR-210的基因正处于一个密集的CpG岛内。用DNA甲基化抑制剂5-aza-2'-deoxycytidine(Aza)处理NSCs后,定量PCR检测发现常氧下miR-210表达剂量依赖性地上调,用2μM Aza处理细胞48 h可以使miR-210的表达量增加3.75倍,而作为对照,调控序列上没有CpG岛的miR-338则表达完全不受Aza的影响。用重亚硫酸盐测序法检测了20% O2、3% O2和0.3% O2叁种环境下培养3天的NSCs中miR-210调控序列的甲基化水平,结果发现在基因片段上的63个CG位点中有26个位点检测出了甲基化修饰状态的存在。miR-210基因的甲基化水平在3%02和0.3%O2时分别下降了22%和49%。其中第58位CG位点由常氧时的半甲基化状态在低氧后变成接近去甲基化状态。上述结果表明低氧能够通过降低miR-210调控序列的甲基化水平而上调其表达。我们进一步对NSCs中DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase, Dnmts)和组蛋白乙酶转移酶(histone acetyltransferase, HAT)的表达及活性进行了分析。结果显示0.3%02能显着下调Dnmt3b的表达水平。而Dnmts家族的活性在低氧后呈下降趋势,HAT活性则在低氧后呈上升趋势。结果表明低氧有可能通过降低NSCs中Dnmts活性并增强HATs活性,来降低DNA甲基化水平并促进组蛋白乙酰化使染色质空间结构打开,从而有利于转录因子和RNA聚合酶对基因的转录调控。四、miR-210在神经干细胞及组织发育中的功能研究在本部分研究中,我们用miR-210的慢病毒过表达载体转染NSCs, CCK-8检测发现过表达miR-210能显着增强NSCs在缺氧环境中的存活率。另外,我们检测了E13、E17和E21胎鼠脑组织中miR-210的表达,发现随着胎龄增长,miR-210表达量也显着增加。合成特异抑制miR-210功能的寡核苷酸后,用子宫胚胎电穿孔法将其转染到E16大鼠胚胎的侧脑室中,发现miR-210功能被抑制的胎鼠发育停滞并表现出致死效应,而对照组则正常存活。这些结果表明miR-210可能在神经系统的发育中具有重要的调控作用。综上所述,HIF-1在低氧促进体外培养NSCs的增殖中起着重要的作用。低氧上调了一系列miRNAs的表达,其中miR-210表达水平变化最为明显。低氧一方面维持了HIF-1α的稳定,另一方面降低了miR-210调控序列的甲基化水平并影响组蛋白乙酰化,使DNA空间结构打开,加强转录因子和RNA聚合酶的结合从而上调miR-210的表达。miR-210的表达受转录因子HIF-1和DNA甲基化的共同调控。而低氧环境下NSCs中miR-210的高表达对于细胞的存活和组织的正常发育是必需的。
郑晓斌[5]2009年在《艾灸对脑缺血后脑神经损伤修复的作用及相关机理研究》文中提出目的:探讨艾灸任脉经穴对脑缺血大鼠脑组织超微结构、ERK信号通路和神经干细胞增殖分化的影响。方法:将成年健康雄性SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、艾灸任脉组(MR)。正常组8只,其余各组分别随机分为7天、14天和28天叁个亚组,每亚组8只。采用线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞局灶性脑缺血再灌注模型;运用电镜观察比较7天假手术亚组大鼠、7天MCAO亚组大鼠及7天艾灸任脉经穴亚组MCAO大鼠纹状体和海马的超微结构变化,运用Western Blot测定MCAO大鼠缺血侧脑室下区、海马齿状回ERK的表达及其磷酸化水平;运用免疫荧光、激光共聚焦显微镜及荧光显微镜观察缺血侧脑室下区BrdU阳性细胞和BrdU/Nestin双标细胞的表达、缺血海马齿状回GFAP阳性细胞和GFAP/NSE双标细胞的表达。结果:1、与同期(脑缺血后七天)MCAO大鼠相比,艾灸任脉经穴治疗能改善局灶性脑缺血大鼠脑组织超微结构。2、与MCAO大鼠相比,艾灸任脉至少在MCAO的14天后可促进缺血侧脑室下、缺血海马齿状回ERK1/2的表达,并至少在MCAO后的第7天就可以显着提高缺血侧脑室下、缺血海马齿状回ERK1/2的磷酸化水平,提示应用艾灸任脉能激活局灶性脑缺血缺血侧脑室下、缺血海马齿状回的ERK通路,对细胞的生长分化产生影响。3、艾灸任脉可以使得缺血侧脑室下BrdU阳性细胞和BrdU/Nestin双标细胞明显增加。提示艾灸任脉治疗对缺血侧脑室下神经干细胞增殖的有促进作用。4、艾灸任脉经穴治疗可以下调脑缺血后海马齿状回的GFAP阳性细胞数,同时使GFAP/NSE双标细胞增多,提示艾灸任脉经穴治疗使缺血海马GFAP/NSE双标细胞增加的同时,可以调节脑缺血后缺血海马GFAP的表达,说明艾灸任脉经穴治疗可抑制脑缺血后海马星形胶质细胞的过度增殖并可促进细胞分化。结论:艾灸任脉经穴治疗能改善局灶性脑缺血大鼠脑组织超微结构,艾灸任脉经穴能激活MCAO大鼠ERK信号转导通路,并能促进MCAO大鼠神经干细胞增殖与分化。
侯双兴[6]2013年在《NDRG基因家族在人和小鼠脑发育过程中的表达特点与初步功能研究》文中提出NDRG（N-Myc downstream-regulated gene）是近年来发现的一个新的基因家族，该基因家族由NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4组成；此基因家族成员间有57-65%氨基酸同源性，经生物信息学分析表明，NDRG2编码的蛋白分子内含有一个可以携带酰基的酰基携带蛋白（ACP）结构域和多种核转录因子的结合位点，这是NDRG家族共同特有的结构域。此特殊结构或许决定了它们有着共同的表达及部分一致的功能，该基因家族参与了细胞的生长，但具体机制仍不清楚。既往文献报道NDRG家族在成年大鼠、小鼠及成人脑中都有不同程度表达；NDRG2在抑郁症、阿尔海默氏病、应激及缺氧时，表达异常，说明NDRG2与脑部疾病具有高度相关性；目前NDRG1、NDRG2都被称为脑分化相关基因；NDRG4在神经前体细胞也有较高表达，受视黄酸（RA）等因子调控；NDRG3在脑发育中表达无明确报道。因此，推测其家族在脑组织中的广泛表达可能与神经系统发育有关。目前研究已经证实，此基因家族与肿瘤细胞的异常增殖、分化密切相关，NDRG2已被明确列为抑癌候选基因。神经前体细胞（NPC）的正常增殖、分化、迁移对于脑的发育至关重要，但其机制还不清楚。我们在前期验证中发现，NDRG2在小鼠神经前体细胞发生区高表达，提示其可能是调控NPC增殖、分化和迁移的重要基因。但NDRG2在人脑发育中是否有相同的表达特点，还尚不清楚；此外，NDRG家族的4成员具有高度氨基酸同源性且在进化中高度保守性，为了探索它们在脑发育中的作用，需首先明确其在脑内的分布及细胞定位。目的通过研究NDRG2在在人胎脑及NDRG家族4个成员在小鼠生后各个脑区的表达特点及细胞定位，为探索NDRG家族在脑发育中的作用奠定基础。方法应用免疫组化、免疫荧光、RT-PCR、Western Blot、细胞培养及电镜等实验技术，研究NDRG基因家族在不同时间点人胎脑和小鼠生后各脑区的表达变化及细胞定位。（1）RT-PCR法检测NDRG2mRNA在16-28周人胎脑不同脑区中的表达；（2）Western blot技术检测NDRG2在28周各脑区的表达；（3）免疫组织化学法检测NDRG2在人胎脑各脑区中的表达；（4）NDRG2与GFAP或NeuN的荧光双标法研究其在胎脑中的细胞定位；（5）Western Blot、免疫荧光技术检测NDRG家族4成员在出生后小鼠各脑区的表达及细胞定位；并在培养神经前体细胞及其分化细胞中检测NDRG2表达情况；（6）电镜技术检测NDRG2的亚细胞定位。结果（1）通过RT-PCR、Western Blot分别在RNA和蛋白水平检测NDRG2在不同时间点的人胎脑脑区表达水平的变化。随着胎龄成熟，NDRG2表达升高，尤其在脑室下带、脑室管膜区域表达最为突出；（2）免疫组化从细胞水平进一步验证了NDRG2主要在人胎脑脑室下带、脑室管膜表达；免疫荧光双标还明确了NDRG2可表达于星形胶质细胞和相对成熟的神经元中，主要定位于细胞质中，极少数星型胶质细胞细胞核也有表达；（3）用Western Blot明确了NDRG1-4成员在出生后小鼠不同时间点、不同脑区表达特征：21天鼠脑海马区、脑室下带等神经发生区NDRG2有特异表达；在120天小鼠，表达明显减弱；NDRG1、3、4在脑室下带、海马亦有表达，但无明确规律；（4）免疫荧光显示NDRG1、3、4在出生后神经前体细胞发生区无表达，NDRG2在小鼠脑海马区以星形胶质细胞胞浆特异性表达为主。NDRG2在培养分化的星形胶质细胞胞浆表达；（5）在NDRG2在亚细胞定位研究中，发现NDRG2表达在神经前体细胞及分化的星形胶质细胞线粒体嵴和包膜上。结论（1）NDRG2在人胎脑脑功能区表达广泛；随着胎龄成熟，表达增强；在神经前体细胞发生区最强，说明NDRG2与细胞增殖、分化及成熟密切相关。（2）NDRG家族在出生后鼠脑区表达有明确区别，NDRG2主要表达于神经发生区，NDRG1、3、4在神经前体细胞发生区参与了分化，但与神经前体细胞发生无特异性关系。（3）NDRG2可能通过影响神经前体细胞的线粒体功能调控其增殖、分化过程。
程龙[7]2003年在《叁七总皂甙对去皮层血管成年大鼠前脑神经干细胞及神经营养因子作用的实验研究》文中研究表明近年来大量研究证实，成年哺乳动物脑内仍保留着具有自我更新和多向分化潜能的神经干细胞，它们位于侧脑室的室管膜下层(subependymal ventrical zone, SVZ)和海马齿状回的颗粒细胞下层(subgranular zone, SGZ)。神经营养因子如bFGF、BDNF能促进神经干细胞的增殖、迁移和分化，还具有神经保护与修复的作用,本研究拟探讨去大脑皮层血管对成年大鼠前脑神经干细胞及bFGF、BDNF表达的影响，并试图确定叁七总皂甙的治疗作用，拓宽中医祛瘀生新法在脑病治疗中的现代医学理论基础。1 去大脑皮层血管对成年大鼠侧脑室管膜下层神经干细胞影响及叁七总皂甙的作用本研究采用Wistar成年大鼠，去除大鼠左侧大脑皮层血管，腹腔注射BrdU标记增殖细胞，应用免疫组化方法观察去皮层血管对SVZ神经干细胞增殖、迁移、分化和bFGF表达的影响，以及叁七总皂甙的作用。通过连续切片的免疫组化结果显示去皮层血管后侧脑室从前至后包括前角、中央部和下角SVZ的BrdU、PCNA、Nestin、Tuj-1、Vimentin阳性细胞均明显增多，反应增强，表象改变显着，其中Tuj-1主要在侧脑室前角表达，而在下角主要是胶质细胞表达明显。bFGF在侧脑室各水平的SVZ表达皆增多、增强，提示去皮层血管引起内源性bFGF表达增高，bFGF可能通过自分泌或旁分泌作用于其受体，刺激相对静止的SVZ神经干细胞增殖、分化，给予叁七总皂甙后促进以上各种阳性细胞表达增多、增强，提示叁七总皂甙可能通过上调内源性bFGF的表达促进去皮层血管后成年大鼠SVZ神经干细胞增殖、分化。2成年大鼠去皮层血管引起室管膜下层细胞增殖形成迁移流至损伤部位本实验观察到：成年大鼠去皮层血管后不仅促进侧脑室前角SVZ细胞及RMS增殖，也引起下角SVZ增殖并形成两条迁移流经胼胝体到达皮质损伤区，其中H链起自下角上壁；L链起自下角外侧壁，来自RMS的细胞成分也参与了L链。此两条迁移流的细胞成分包括GFAP阳性的成熟星状胶质细胞、Vimentin阳性的不成熟星形胶质细胞、Tuj-1阳性的成神经细胞，到达损伤部位可能起再生及修复作用。H、L链还表达神经营养因子bFGF和BDNF。结果提示bFGF和BDNF可能通过自分泌或旁分泌作用于其受体，不仅促进SVZ增殖同时也促进H链和L链细胞的迁移和分化，到达损伤区进行修复。3去大脑皮层血管对成年大鼠海马齿状回神经干细胞的影响本实验观察了去皮层血管对成年大鼠海马SGZ神经干细胞及bFGF表达的影响，结果显示去大脑皮层血管后成年大鼠SGZ中BrdU、Tuj-1、PCNA阳性细胞的数目增多、齿状回bFGF表达上调，相反Vimentin阳性细胞减少，结果提示与SVZ神经干细胞相比成年大鼠海马SGZ神经干细胞具有有限的自我更新和多向分化能力。4叁七总皂甙对离体胚鼠皮层神经干细胞作用的实验研究选取E17胎鼠皮层细胞，通过原代细胞培养、传代、单细胞克隆和免疫细胞化学方法体外研究叁七总皂甙对胚鼠皮层神经干细胞增殖、分化、自我更新及BDNF、bFGF表达的作用。结果显示，给药组原代、P1、P2细胞都能够形成较多的神经球；给药组P1细胞的单细胞克隆能够形成神经球；与对照组比较，给药组原代细胞培养4天Nestin、PCNA、<WP=4>Tuj-1、NF、Vimentin、GFAP、bFGF、BDNF阳性细胞均明显增多，阳性细胞能够形成明显的团状。结果提示体外叁七总皂甙可能通过促进胚鼠皮层神经干细胞或前体细胞bFGF、BDNF自身合成增加（bFGF、BDNF通过自分泌或旁分泌）促进其存活、增殖、分化和自我更新。5叁七总皂甙对去大脑皮层血管成年大鼠前脑BDNF、bFGF、Calbindin-D28K、PCNA表达作用的实验研究本研究观察了去皮层血管后成年大鼠前脑bFGF、BDNF、PCNA和Calbindin-D28K的表达以及叁七总皂甙的作用，结果显示去皮层血管后bFGF、BDNF、Calbindin-D28K和PCNA在前脑包括皮层、海马、纹状体等脑区都有表达，损伤后期（15天和30天）bFGF主要表达在胶质细胞，BDNF和Calbindin-D28K表达在神经元。给予叁七总皂甙后皮层、海马、纹状体阳性细胞的数量和反应强度都明显高于对模型大鼠，说明叁七总皂甙促进去皮层血管后成年大鼠前脑神经元或胶质细胞表达bFGF和BDNF，bFGF和BDNF可能通过多种分泌方式及转运途径作用于受体促进损伤后神经元存活、损伤神经组织的修复，其机制包括上调Calbindin-D28K减轻神经元损伤、上调PCNA促进损伤DNA的修复。综上所述，本研究表明去皮层血管引起内源性bFGF、BDNF表达增多，bFGF、BDNF可能通过自分泌或旁分泌作用于受体，促进侧脑室SVZ、海马齿状回SGZ神经干细胞的增殖、分化，SVZ细胞还能形成迁移流到达皮层损伤部位，可能参与损伤的替代与修复。叁七总皂甙对以上有明显的促进作用。叁七总皂甙还能够促进去皮层血管后皮层、海马、纹状体中bFGF、BDNF在神经元和胶质细胞的表达，bFGF和BDNF可能通过多种分泌方式及转运途径作用于受体促进损伤后神经元存活、损伤神经组织的修复
祁文[8]2013年在《Ihh/Glil通路对大鼠急性脊髓损伤后内源性神经干细胞增殖分化的调控及川芎嗪干预作用研究》文中研究指明目的：观察大鼠急性脊髓损伤后IhhmRNA. GlilmRNA在受损脊髓的分布及不同时间点的表达变化,分析Ihh/Glil信号通路对脊髓内源性神经干细胞的调控作用,明确川芎嗪治疗脊髓损伤的分子机制。方法：将SD大鼠随机分为空白组(A组6只)、假手术组(B组36只)、模型组(C组36只),甲强龙对照组(D组36只),川芎嗪治疗组(E组36只)。用改良Allen's法建立大鼠急性脊髓损伤模型。E组在造模后每日腹腔注射盐酸川芎嗪注射液,400mg/kg/d,首次给药在造模后30min,共给药10天；D组造模后按照甲强龙大剂量冲击疗法于造模后30分钟腹腔注射甲强龙187.5mg/kg;伤后1小时即开始按33.75mg/kg计算23小时总量,23小时内分四次腹腔注射。A、B、C组在同一时间给予腹腔注射等量生理盐水,共10天,D组于造模后第二天给予腹腔注射等量生理盐水共9天。于造模后第8小时、1天、3天、7天、14天、28天进行斜板实验、BBB评分神经功能行为学评价。于造模后第8小时、1天、3天、7天、14天、28天每组分别处死6只大鼠,以损伤脊髓为中心上下各5mm取大鼠的脊髓进行检测,3只用于HE.尼氏染色、免疫组织化学及原位杂交检测,3只用于Real-time PCR检测。用HE、尼氏染色观察脊髓的病理形态学变化,用免疫组化法检测代表脊髓内源性神经干细胞的Brdu+细胞和Nestin+细胞的表达,用原位杂交和Real-time PCR检测IhhmRNA和GlilmRNA在大鼠脊髓中的分布和表达变化情况。对检测结果进行统计分析,并对Brdu+和Nestin+细胞、IhhmRNA和GlilmRNA在脊髓中的表达进行相关性分析。结果：1、大鼠造模损伤脊髓后,C组、D组、E组大鼠的后肢运动功能显着降低,脊髓功能严重损伤,大鼠在斜板上维持的最大角度与BBB评分均明显降低,与A组比较有显着性差异(P<0.01)；E组大鼠治疗后在斜板上维持的最大角度呈明显上升趋势,在14天,28天与模型对照组对比有显着差异(P<0.05)；D组优于E组,在治疗后第3天至28天时两组比较有显着差异(P<0.01)。E组大鼠在治疗后BBB评分逐渐增加,在3天、14天、28天与C组比较有显着差异(P<0.05或P<0.01),但BBB评分不及D组(P<0.05或P<0.01)；2、通过大鼠脊髓组织切片进行HE,尼氏染色观察各组大鼠脊髓组织病理学变化。脊髓损伤后可见脊髓水肿,局灶性出血,神经元胞体皱缩、核固缩,尼氏小体开始减少和消失,神经元变性,3天后出现脊髓水肿加重,局灶性出血范围增大,炎性细胞浸润明显,灰质部分组织溶解形成空泡；至7天、14天坏死范围进一步扩大,炎症水肿逐渐减轻,至28天,坏死区周围瘢痕增生,向坏死区填充。川芎嗪能明显减轻脊髓损伤后水肿、炎性细胞浸润及出血程度,保护神经细胞,促进脊髓组织修复；3、脊髓损伤后,Brdu+细胞被激活,在脊髓中的表达明显增多,在脊髓白质、灰质及中央管室管膜区均有表达。在第7天达到峰值,随后逐渐减少。川芎嗪能明显促进Brdu+细胞增殖,在损伤后7天、14天、28天,与C组比较有显着差异(P<0.05或P<0.01),而甲强龙则抑制Brdu+细胞增殖,与C组比较有显着性差异(P<0.05或P<0.01)。川芎嗪能显着促进Nestin+细胞表达,在第7天达到峰值,在损伤后7天、14天、28天与C、D组比较有显着性差异(P<0.05或P<0.01),而甲强龙则抑制Nestin+细胞表达;4、在正常成年大鼠脊髓中IhhmRNA主要分布在白质区,在室管膜细胞也有少量表达；而GlilmRNA主要表达在胶质细胞的胞质和灰质区神经元除核仁以外的细胞核。脊髓损伤后IhhmRNA与GlilmRNA表达减少,C组与A组在各时间点比较有显着性差异(P<0.05或P<0.01),第3至7天将至最低点,后又逐渐增多,但仍低于正常值。C组、D组和E组在各时间点比较无明显差异(P<0.05)。5、经对IhhmRNA、GlilmRNA、Nestin+细胞和Brdu+细胞在脊髓中的表达量进行相关性分析,IhhmRNA与GlilmRNA表达呈正相关,IhhmRNA与Nestin+细胞表达呈负相关。结论：1、Ihh在正常成年大鼠的脊髓中有分布,并且主要分布在脊髓的白质区,中央管仅有微量表达；Glil主要表达在神经元核仁以外的细胞核和胶质细胞的胞质中,中央管周围未见表达。2、Ihh/glil信号转导通路对脊髓内源性干细胞的增殖分化起负性调控作用；3、川芎嗪能够对脊髓损伤后内源性神经干细胞增殖分化有促进作用；4、川芎嗪通对脊髓损伤后脊髓内源性神经干细胞增殖分化的影响可能不是通过对Ihh/Glil信号通路的干预达到的。
佚名[9]2007年在《西南叁省一市解剖学会第六届学术会议论文摘要》文中指出VEGF-C和VEGF-R3在腮腺癌中的表达及与淋巴结转移的研究先德海1钟建桥2张西北1常能彬1(1.泸州医学院解剖教研室2.泸州医学院附属医院皮肤科泸州646000)目的研究血管内皮生长因子-C及受体3(VEGF-C、VEGF-R3)在腮腺癌中的表达及
蒋海山[10]2008年在《缺血再灌注器官型脑片神经再生的作用及机理研究》文中研究表明脑血管病是严重危害人类健康的一类常见病。在我国,脑血管病的危害尤为严重。在一项有12个国家20多个中心参加、总监测人年数(35～64岁)超过1500万的“多国心血管病趋势和决定因素监测”(MONICA)研究中,17个中心监测结果显示:脑卒中总死亡率前苏联最高;男性死亡率,我国排第5:女性死亡率,我国的北京位居第2。据卫生部统计中心来自全国各省市数千万人的疾病监测资料显示:我国1988～2001年脑血管病死亡率在105/10万～135/10万之间。脑血管病以高发病率、高患病率、高死亡率以及高致残率的特点受到广泛关注,我国也十分重视脑血管病的防治工作,在“六五”至“九五”计划期间,脑血管病的防治都被列为重点研究项目。在本研究中,着重于通过动物实验、细胞培养及器官型脑片培养技术,探讨缺血再灌注损伤对鼠脑神经再生的作用及机理,为缺血再灌注损伤的干细胞治疗寻求解决途径。所谓缺血再灌注脑损伤是指脑缺血一定时间后再恢复血液灌注,组织损伤反而进行性加重,它是缺血和再灌注两种损伤共同作用的结果。导致脑缺血和缺血再灌注损伤神经元坏死的机制包括:(1)兴奋性氨基酸毒性;(2)线粒体损伤;(3)细胞凋亡;(4)炎症;(5)细胞内钙超载。大多数缺血性脑血管病有明确的病因和促发因素,除了发病初期以救命、挽救缺血半暗带治疗为主外,治疗原则上应根据不同病因与发病机制,采用针对性治疗。目前用以治疗脑缺血的药物和方法多种多样,主要包括:(1)抗凝治疗:(2)溶栓治疗:(3)扩容治疗;(4)扩血管治疗;(5)钙离子拮抗治疗;(6)抗血小板治疗;(7)中药治疗。此外还有防治脑水肿、神经营养、内科基础疾病治疗、外科手术治疗、康复理疗等。因为具有自我更新、多分化潜能、低免疫原性、易与宿主细胞建立正常的细胞联系等特点,神经干细胞(NSCs)成为新兴的、前景光明的治疗方法。探讨如何使用NSCs治疗神经系统的损伤和变性疾病,以及当前的治疗对NSCs如何产生影响成了当前神经科学的研究热点。NSCs主要存在于胚胎神经系统内,在成年脑内的NSCs主要局限于2个神经生发区,室下区(SVZ)和海马齿状回(HDG)。虽然NSCs理论上可以无限增殖并分化为神经系统内所有类型的神经细胞,但是如何利用NSCs修复受损的神经功能仍未达到临床实用阶段。各国学者在这方面进行了大量的研究。目前可将研究大体分为两种策略:(1)外源性NSCs治疗策略。又可细分为:①先移植后分化,即直接将培养、扩增并达到一定密度的NSCs移植入受损脑区或其他部位(如其他脑区、脑室、蛛网膜下腔等),通过内在的信号引导使NSCs分化为所需的神经细胞以达到治疗目的。②先分化后移植,即通过分化调控将在体外培养的NSCs分化为所需的神经细胞再移植入受损脑区或其他部位,以修复神经系统损伤或退行性疾病。③作为载体,即利用NSCs作为基因治疗的载体,通过转基因技术将编码神经营养因子的基因片段导入待移植的NSCs中,筛选后移植入受损脑区或其他部位,改善局部微环境以利细胞生存、增殖、分化。(2)内源性NSCs治疗策略。通过激活大脑处于G0期的内源性NSCs,使其重新进入细胞循环,增殖、分化,产生各种神经细胞以替代因损伤、变性丧失的细胞,并重新建立神经网络,恢复神经系统功能。因为NSCs移植治疗最终发挥作用的不是NSCs本身,而是由NSCs分化出的各种功能性神经细胞,所以如何调控NSCs增殖、分化是当前神经科学研究热点中的热点。众多研究表明,NSCs的调控是一个复杂的过程,但主要是由外源性因素(细胞因子)和内源性因素(基因)协同作用完成。(1)外源性因素。即调控NSCs增殖、分化的细胞因子。①表皮生长因子(EGF)。EGF是一种诱导NSCs增殖的常用的有丝分裂原,它的作用可能是使那些处于相对静息的干细胞产生对称性分裂,从而增加干细胞数。EGF主要作用于发育较晚期,促进NSCs、神经前体细胞增殖和分化,并且需要胰岛素样生长因子-1(IGF-1)共同参与。②碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。bFGF具有很强的促进NSCs增殖的作用,可激活CNS多个区域的神经前体细胞的潜在再生能力。效应呈浓度依赖性,低浓度(0.1μg/L)时,促进NSCs分裂、增殖,形成神经元克隆;高浓度(1～10μg/L)时,NSCs倾向于生成神经胶质细胞克隆。③促红细胞生成素(EPO)。EPO具有促神经生长、神经营养和神经保护作用。④血管内皮细胞生长因子(VEGF)。VEGF既能刺激神经再生又能刺激血管发生。但在缺血再灌注早期,VEGF更有利于神经再生而不是血管新生。⑤胰岛素样生长因子-1(IGF-1)。IGF-1对神经系统的作用复杂多样,对神经细胞分裂,发育,成熟均有明显的作用。⑥神经细胞黏附分子(NCAM)。NCAM参与了细胞黏附、神经纤维束形成、促进突触的可塑性以及神经元的出芽生长等过程,是神经发育中不可缺少的分子,是NSCs可塑性的重要调节因子。(2)内源性因素。即调控NSCs增殖、分化的基因。①bHLH转录调控因子家族;②BMP家族;③Notch信号系统;④Wnt家族、Pax家族;⑤PTEN基因;⑥REST/NRSF基因;⑦Insc基因。研究表明,中药对NSCs增殖分化也具有促进作用,这可能是中药促进缺血再灌注脑损伤后脑功能重建和再生的机制之一。通心络是基于中医“络病”理论研制的一类新药,近年来应用于缺血性脑血管病的治疗,取得了肯定的疗效,且在前期实验中证实对NSCs增殖分化具有促进作用。本实验利用通心络含药血清作为阳性对照研究缺血再灌注损伤对神经再生的作用及机理。器官型脑片培养技术是近年来发展起来的一种神经组织培养方法。通过将切成一定厚度的脑组织片放置于微孔膜上,再将微孔膜置于培养液上,达到使脑组织片处于气液交界面上,充分得到氧气和营养成分的目的。这个技术的优势在于:较细胞培养来说能更好的模拟体内状态,而较动物实验来说则更有利于控制实验条件、实现实时观察。本实验的主要研究目的是探讨缺血再灌注损伤对神经再生的作用及机理,将采用的主要方法有动物模型制作、NSCs培养和器官型脑片培养,从不同的角度探讨缺血再灌注损伤对神经再生、NSCs增殖、NSCs分化调控等的作用及机制。基于以上考虑及对文献的复习,拟设定本研究的目的如下:(1)进行胚胎鼠脑神经生发区的可视化定位,依据这一研究定向分离培养胚胎NSCs;(2)改良线栓法缺血再灌注损伤大鼠模型,为研究缺血再灌注损伤对神经再生的作用和机理提供可靠的动物模型;(3)观察及探讨缺血再灌注损伤对缺血再灌注损伤动物模型神经再生的作用及相关细胞因子的影响;(4)建立器官型脑片培养技术及缺血再灌注器官型脑片造模方法;(5)观察缺血再灌注损伤对器官型脑片神经再生的作用及相关细胞因子的影响;(6)探讨缺血再灌注损伤对器官型脑片神经再生的影响并比较与胚胎鼠脑神经生发区的异同,以明确在缺血再灌注损伤后NSCs的激活、增殖、迁移、分化等过程。取17d胚胎大鼠脑矢状位切片,每隔30μm取1片切片进行抗Nestin免疫组化染色,在4×目镜下成像,导入电脑进行平面图像重建,获得抗Nestin(+)细胞空间定位。根据NSCs空间定位,从14-17d SD胎鼠颅内取出脑组织,剪碎吹打分离,过滤离心重悬,调整细胞密度为3×10~5/ml,接种培养瓶后置于CO_2培养箱中培养、鉴定、传代。通过改良线栓法制作缺血再灌注损伤动物模型,在术后2h进行评分,将造模成功(评分≥2分)大鼠用于后续实验。分别在超早期(2h)、急性期(3d)和慢性期(7d)取相应模型大鼠和假手术组大鼠脑切片,行抗Nestin免疫组化染色,观察不同时间点NSCs的变化。将大鼠随机分为3d、5d、7d组,制作缺血再灌注损伤动物模型。在相应时间点,取出造模成功大鼠的脑组织,通过RT-PCR法分别检测缺血再灌注损伤侧脑组织和对侧脑组织4种细胞因子(EPO、VEGF、EGF和IGF-1)的mRNA量,观察缺血再灌注损伤对NSCs增殖分化相关细胞因子的影响。取生后3天SD大鼠脑,将包含海马的脑组织冠状位横断,用振动切片机切成厚约300μm脑片,置于Millicell-CM插件微孔膜上,再将插件置于预留1ml脑片培养液的6孔培养板中。置于CO_2培养箱中培养。取生长状态良好的脑片制作缺血再灌注脑片。以生理盐水替代脑片培养液,置于充满N_2的环境下37℃孵育1h,再以脑片培养液替换生理盐水,放回常规条件下CO_2培养箱中培养,模拟缺血再灌注损伤。设立缺血再灌注组、缺血再灌注治疗组、阳性对照组和阴性对照组。置于CO_2培养箱中培养。每天观察器官型脑片的变化,有新生细胞时,在SVZ区随机选取5个等大区域,计数各组新生细胞数。在指定时间取出相应脑片按常规方法进行叁重免疫荧光染色。染色前添加BrdU共孵育24h。用SPSS 10.0软件进行相关统计学分析。在指定时间收集标本进行相关细胞因子检测。分别于不同分组、不同干预、不同时间下,通过酶联免疫吸附试验检测EPO、VEGF的变化,定量PCR法检测EGF、bFGF、IGF-1和NCAM的变化。用SPSS 10.0软件进行相关统计学分析。结果表明:抗Nestin(+)细胞广泛分布于胚胎神经系统,以嗅球,吻向迁移流(RMS),室下区,海马,桥脑,小脑,脊髓,部分神经核团等部位最多。可以分离培养出胚胎NSCs。原代NSCs培养通过分裂增殖和相互聚合的方式形成神经球,其中相互聚合是培养初期形成神经球的主要方式。线栓法缺血再灌注动物模型造模成功。病理学表现,缺血再灌注损伤超早期仅见血管红细胞淤滞,急性期可见软化灶形成,慢性期软化灶内细胞溶解、气球样变。超早期无抗Nestin(+)细胞,急性期出现抗Nestin(+)细胞,主要分布于软化灶周边,慢性期未发现抗Nestin(+)细胞。假手术组各期组织结构完整,未发现抗Nestin(+)细胞。EPO、VEGF、EGF和IGF-1在缺血再灌注损伤3d时即已出现增高,前3种细胞因子在第5d时表达量最高,随后逐步下降,而IGF-1表达量逐步增高。器官型脑片培养大体观察,空气面湿润有光泽,周边与微孔膜接合紧密,色泽均一,随着培养时间的延长厚度逐渐变薄,最终维持于相对恒定的厚度继续生长。镜下观察,组织透光均匀,能明显区分出海马、齿状回、脑室等结构。培养3天开始在HDG、SVZ等区域出现新生细胞。细胞多呈相对均一的圆形或椭圆形。经缺血再灌注处理的器官型脑片损伤后即见脑片上新生细胞增多,主要集中在SVZ、HDG等区域。此新生细胞与阳性对照组出现的新生细胞相比形态不规则,个体大小不均一,分布不均匀。缺血再灌注损伤和通心络含药血清均可促进新生细胞数量显着增多,主要分布在SVZ、HDZ区,呈DAPI(+)BrdU(+)Nestin(+)。随着培养时间延长,新生细胞向皮层迁移。在SVZ区随机选取5个等大区域,计数各组新生细胞数,各组间单位区域新生细胞数均存在显着性差异。阳性对照组和缺血再灌注治疗组与缺血再灌注组相比,SVZ、HDG等部位单位区域新生细胞数更多,有显着性差异。在存活脑片培养的全过程中均可观察到似毛细血管血流一样的“微血流”现象。缺血再灌注损伤第1d、3d时EPO OD值各组之间差异具有显着性意义。第1d时按阳性对照组、缺血再灌注治疗组、缺血再灌注组、阴性对照组顺序递减。第3d时按阴性对照组、阳性对照组、缺血再灌注组、缺血再灌注治疗组顺序递减。第7d时各组之间差异没有显着性意义,OD值递减顺序同第3d。各处理因素交互效应显着。缺血再灌注损伤后各时间点VEGF OD值各组之间差异具有显着性意义。缺血再灌注组和缺血再灌注治疗组VEGF表达逐步升高,阴性对照组迅速下降,而阳性对照组在第3d时表达达最高值。缺血再灌注损伤后EGF的表达,缺血再灌注组、阳性对照组、阴性对照组均在第1d时达峰,后逐步下降,而缺血再灌注治疗组逐步增高。缺血再灌注组、缺血再灌注治疗组和阳性对照组初期bFGF表达量均较高,7d时缺血再灌注治疗组和阳性对照组表达量均下降,阴性对照组初期bFGF表达量不高,但随着培养时间的延长,bFGF的表达量逐步增高。缺血再灌注损伤抑制了IGF-1的表达,从第3d开始IGF-1表达量出现增高,而缺血再灌注治疗组IGF-1表达量维持稳定。缺血再灌注组、阳性对照组NCAM的表达均增高。缺血再灌注治疗组初期NCAM表达量不高,但随着培养时间延长表达量继续增高。全文小结:(1)进行了胚胎鼠脑神经生发区可视化定位研究,发现胚胎鼠脑内神经生发区分布广泛,推测成年鼠脑的神经生发区不应只有HDG、SVZ等区域,其他多个脑区也应具有神经生发潜能。为神经系统损伤的功能修复研究奠定基础。(2)发现胚胎鼠脑NSCs的时空表达特性:分布广泛、表达充分、都不在G0期。(3)发现胚胎鼠桥脑NSCs分布新区。(4)用数量分析法发现胚胎NSCs培养初期形成神经球的主要方式是细胞之间、细胞团之间以及细胞和细胞团之间的相互聚合。(5)通过胚胎NSCs分离培养证实胚胎鼠脑内存在大量NSCs。(6)发现鼠脑缺血耐受时间长于人类,功能代偿时间早于人类、代偿效果优于人类。(7)证实缺血再灌注损伤后内源性NSCs出现具有时间窗,提出内源性NSCs治疗应在“治疗时窗”内进行。(8)发现内源性NSCs在缺血再灌注损伤中的作用趋势是形成囊状结构包绕坏死区使其局限化。(9)发现缺血再灌注损伤中,内源性NSCs均是原位激活,激活的NSCs主要位于脑损伤周边区域。(10)证实缺血再灌注损伤是促进内源性NSCs发生和增殖的重要因素。(11)证实缺血再灌注损伤促进NSCs增殖分化相关细胞因子EPO、VEGF、EGF以及IGF-1参与神经功能的修复重建及神经生发区的激活。(12)发现缺血再灌注损伤促使器官型脑片神经再生的作用短暂,损伤了后续神经再生的能力。(13)发现器官型脑片SVZ、HDG出现的新生细胞具有放射状向外迁移的趋势。(14)描绘了缺血再灌注器官型脑片神经生发区的新生细胞迁移趋势二维模拟图。(15)发现用器官型脑片能观察在体实验难以观察到的神经生发区NSCs激活、迁移,是研究神经再生的优良体外模型。(16)发现缺血再灌注损伤促进EPO表达,影响EPO表达水平,与对NSCs的影响一致。(17)发现缺血再灌注损伤延迟VEGF表达,与神经系统损伤后慢性期神经系统功能修复有关。(18)发现缺血再灌注损伤与多种因素共同作用促使EGF维持表达。(19)发现缺血再灌注损伤通过持续促进bFGF的表达激活神经再生。(20)发现缺血再灌注损伤抑制了IGF-1表达,从第3d开始IGF-1表达会出现一过性撤退性反应性增高。(21)发现缺血再灌注损伤促进NCAM表达。
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