张宏[1]2002年在《子宫内膜异位症细胞模型建立及侵袭粘附性研究》文中指出目的：分离培养人在位及异位子宫内膜间质与腺上皮细胞，初步探讨子宫内膜上皮细胞系建立方法，为进一步研究子宫内膜异位症异位侵袭机理提供良好的实验模型。免疫组化法研究CD54在EM中的表达情况。 方法及结果： 1、在位及异位子宫内膜间质及上皮细胞的分离培养：所采用的在位及异位内膜培养方法有离心分离法、筛网分离法及混合培养法。结果：离心分离法培养的在位和异位内膜细胞的成活率分别为92.59％和68.18％；筛网分离法培养的以上细胞成活率分别为84.21％和61.54％；混合培养的成活率分别为100％和71.43％。免疫组化显示所得间质及上皮细胞纯度均＞90％。 2、子宫内膜细胞侵袭力研究：分离培养的在位及异位子宫内膜间质和上皮细胞接种于Transwell—Insert培养板，22h后显微镜下观察计数。 结果：正常子宫内膜上皮及间质细胞侵袭数为58.14+21.52、92.93±11.84；EM在位内膜上皮及间质侵袭细胞数为90.36±11.78、112.64±16.49；EM异位内膜上皮及间质细胞侵袭数为111.86±15.70、142.93±32.63。 3、子宫内膜细胞系建立初探：将正常在位子宫内膜上皮细胞通过脂质体转染PSV3—neo质粒，使细胞获得永生化特性，G418筛选相关耐药克隆。结果：转染后7周出现3个耐药克隆，此克隆存活7个月。 4、CD54在EM中的表达：采用SP免疫组化染色法观察CD54在EM在位内膜、EM异位内膜及正常对照内膜中的表达。结果：CD54在EM异位内膜中的表达明显高于正常对照内膜。 结论： 1、成功地分离培养了在位及异位子宫内膜间质和上皮细胞，为进一步研究异位内膜与在位内膜，间质细胞与上皮细胞的差异，揭示EM的发 车厂进修学院帧十 研究生论义 病机制提供良好的细胞体外模型；异位内膜细胞的成活率低于在位内 膜（P、0刀引；分离方法、在位内膜的周期及EM分期对细胞成活无影 响 o＜O．0引。 2。异位内膜细胞的侵袭力高于在位内膜（卜0刀引：无论是异位还是在位 内膜，间质细胞的侵袭力高于卜皮细胞o＜0刀5）。证实了异位内膜的 侵袭性以及间质与上皮细胞侵袭性的差异。 3、国内首次进行建立子宫内膜上皮细胞系工作，因克隆生长缓慢，未作 鉴定工作，需进一步探索于宫内膜建系方法，成功建立无限细胞系。 4、CD54分子表达在 EM异位子宫内膜和 EM患者在位子宫内膜及正常 对照内膜存在明显差异（P＜0．05），表明粘附分子可能与＊M发生密 切相关。
阮菲[2]2012年在《PRL-3介导的RhoA/ROCK信号转导通路对异位子宫内膜细胞迁徙的调控作用研究》文中提出子宫内膜异位症(Endometriosis, EMs)是具有生长功能的子宫内膜组织出现在子宫腔被覆内膜及宫体肌层以外的其他部位。它一种常见良性妇科疾患,却有增生、浸润、转移、复发等恶性行为,严重影响妇女的身心健康、生活质量和生育能力。关于其发病机制众说纷纭,目前仍以种植学说为主导理论,但子宫内膜细胞如何脱离起源位置并完成宫腔外异位粘附-侵袭-血管形成等复杂过程,特别是细胞如何接收内外信号引起细胞迁移这一关键性步骤及其调控因子尚未阐明。而这一关键性步骤直接导致了子宫内膜细胞的迁徙及EMs复发,所以有必要对子宫内膜细胞迁徙及调控机制进行深入研究探讨。肝再生磷酸酶-3(Phosphatase of Regenerating Liver-3,PRL-3)是肝再生磷酸酶家族中的一员,因近年发现与肿瘤转移有非常密切的关系而备受关注。自2001年Saha等发现PRL-3与结肠癌转移有密切关系以来,越来越多的研究表明：PRL-3的高表达似乎是多种肿瘤发生发展过程(特别是转移过程)中的一个共性事件,它能激活细胞内一系列信号转导通路,诱导细胞增殖和分化、提高其浸润转移能力、诱导血管新生,从而促进肿瘤的形成及肿瘤细胞向其他组织器官的转移等。最近研究显示：在促进肿瘤发生发展方面,PRL-3作为一个上游信号与特定的蛋白结合,开启下游Rho/ROCK信号转导通路,最终导致细胞增殖、迁移等能力的改变。已有研究表明RhoA和ROCK在异位子宫内膜间质细胞高表达,而有关PRL-3与子宫内膜异位症的关系国内外尚无研究报道。基于上述的研究背景,我们设计了本课题,首先从临床组织水平利用免疫组化、蛋白印迹(Western Blot)技术,比较PRL-3在EMs患者异位、在位子宫内膜及非EMs患者子宫内膜的表达,探讨PRL-3异常表达与子宫内膜异位症的相关性；然后从细胞分子水平原代培养子宫内膜间质细胞,建立离体细胞迁徙模型,运用划痕实验、transwell细胞迁徙浸润实验比较异位、在位、非EMs子宫内膜间质细胞的迁徙能力,并用实时定量逆转录-聚合酶链反应(real-time RT-PCR)、 Western Blot方法比较叁种细胞中PRL-3、总-RhoA(T-RhoA)、磷酸化-RhoA(P-RhoA)及ROCK基因的表达差异；最后用小干扰RNA(siRNA)技术干扰沉默PRL-3基因,并用real-time RT-PCR、 Western Blot方法比较转染前后PRL-3、T-RhoA、 P-RhoA及ROCK基因表达变化,再利用激光扫描共聚焦显微镜、划痕实验、transwell细胞迁徙实验等技术,了解转染后异位子宫内膜间质细胞的细胞骨架及迁徙能力的改变,深入研究PRL-3介导的RhoA/ROCK信号转导通路对异位内膜细胞迁徙的调控作用及其分子机制,从而进一步揭示EMs发生发展机制,为该病的防治提供一种新的思路。第一部分PRL-3异常表达与子宫内膜异位症的相关性研究目的：探讨PRL-3异常表达与子宫内膜异位症的相关性。方法：选取70例异位、在位子宫内膜组织及30例非EMs患者子宫内膜组织用于免疫组化研究,并随访3年；选取35例异位和在位子宫内膜组织及20例非EMs患者子宫内膜组织用于蛋白印迹检测,比较PRL-3蛋白在异位、在位及非EMs患者子宫内膜组织中的表达差异。结果：免疫组化染色显示：PRL-3蛋白表达主要定位于异位子宫内膜腺上皮细胞以及成纤维细胞、血管内皮细胞等间质细胞的胞膜、胞浆,70例异位子宫内膜标本中有51例PRL-3蛋白阳性表达,阳性率为72.9%,而在位、非EMs患者子宫内膜PRL-3蛋白阴性表达,PRL-3在异位子宫内膜组织的表达明显高于在位、非EMs患者子宫内膜,差异有显着性(P<0.001)；早期Ⅰ/Ⅱ患者PRL-3蛋白阳性率53.3%(16/30),而晚期Ⅲ/Ⅳ患者PRL-3蛋白阳性率87.5%(35/40),两者间有显着性差异(P<0.01)；复发组PRL-3蛋白阳性率90.0%(18/20)较未复发组PRL-3蛋白阳性率66.0%(33/50)高,差异有显着性(P<0.05)。经Western Blot方法检测发现：35例异位子宫内膜组织中有29例PRL-3蛋白阳性表达,阳性率为82.9%,而在位、非EMs患者子宫内膜组织中未检测出PRL-3蛋白表达,异位子宫内膜组织PRL-3蛋白表达明显高于在位、非EMs患者子宫内膜,有显着性差异(P<0.001)。结论：PRL-3蛋白在异位子宫内膜的表达明显高于在位及非EMs患者子宫内膜,并且与EMs的分期及复发密切相关。第二部分比较叁种子宫内膜间质细胞迁徙能力及PRL-3/RhoA/ROCK信号转导通路表达目的：体外原代培养异位、在位、非EMs患者子宫内膜间质细胞,比较叁种子宫内膜间质细胞迁徙能力及PRL-3/RhoA/ROCK信号转导通路表达差异。方法：体外原代培养异位、在位、非EMs患者子宫内膜间质细胞,建立离体细胞迁徙模型并鉴定间质细胞,运用划痕实验、transwell细胞迁徙浸润实验比较叁种细胞的迁徙能力；采用real-time RT-PCR、Western Blot方法比较叁种细胞中PRL-3、T-RhoA、 P-RhoA及ROCK基因的表达差异。结果：transwell实验显示,相同时间内穿越Matrigel基质胶迁移浸润的异位、在位及非EMs子宫内膜间质细胞数分别为：4.13±0.81、2.65±1.07、1.45±0.39,经方差分析叁组间差异均有统计学意义(F=107.93,P<0.05),经SNK法分析异位组与在位组相比较差异有统计学意义(P<0.05),在位组与非EMs组之间比较也有显着性差异(P<0.05)；细胞划痕实验同样显示相同时间内异位子宫内膜细胞迁徙能力强于在位子宫内膜细胞,而在位子宫内膜细胞又强于非EMs,患者子宫内膜细胞。经Western Blot检测分析发现,异位子宫内膜细胞PRL-3蛋白相对表达量为0.245±0.132,而在位及非EMs子宫内膜组未检测出PRL-3蛋白表达,经方差分析叁组细胞PRL-3蛋白相对表达量有显着性差异(F=362.84,P<0.01)。经Western Blot检测发现T-RhoA、P-RhoA、Rock蛋白在异位子宫内膜细胞的表达最强,在位子宫内膜细胞中表达次之,而在非EMs,患者子宫内膜细胞表达最弱(P<0.05)。而real-time RT-PCR检测(?)PRL-3、RhoA. Rock的nRNA表达,同样发现在异位子宫内膜细胞的表达最强,在位子宫内膜细胞中表达次之,而在非EMs患者子宫内膜细胞表达最弱(P<0.05)。结论：1.子宫内膜间质细胞的迁徙能力：异位>在位>非EMs患者子宫内膜；2. PRL-3/RhoA/ROCK信号通路的表达：异位>在位>非EMs患者子宫内膜。第叁部分PRL-3介导的RhoA/ROCK信号转导通路对异位子宫内膜细胞迁徙的调控作用研究目的：通过siRNA技术干扰沉默PRL-3基因,深入研究PRL-3介导的RhoA/ROCK信号转导通路对异位内膜细胞迁徙的调控作用及其分子机制。方法：体外原代培养异位子宫内膜间质细胞建立离体迁徙模型,用PRL-3siRNA转染异位子宫内膜间质细胞,采用real-time RT-PCR、Western Blot方法检测PRL-3、T-RhoA、 P-RhoA及ROCK基因在转染前后的表达变化；运用划痕实验、transwell实验等观察转染前后细胞迁徙能力的变化；并通过激光扫描共聚焦显微镜观察转染前后细胞骨架构型的改变。结果：转染后72h实验组、阴性对照组及空白对照组PRL-3的蛋白相对表达量为0.049±0.052、0.364±0.128、0.418±0.090,经方差分析叁组间PRL-3蛋白相对表达量差异有统计学意义(F=343.47,P<0.05),经SNK法检验实验组与两对照组相比较差异有统计学意义(P<0.05),而两对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)；PRL-3siRNA转染0～72h后PRL-3、T-RhoA、P-RhoA、Rock基因的蛋白表达呈下降趋势,尤以PRL-3下降最为明显,并且在转染最初的24～48h这种抑制作用最为迅速、明显,72h抑制率可达到81.4%,而且P-RhoA的变化趋势与PRL-3较为一致,经检验转染组与两对照组相比各基因蛋白表达的差异有统计学意义(P<0.05),而两对照组之间无明显差异(P>0.05)；转染0～72h后PRL-3、RhoA、 Rock基因mRNA的表达亦呈下降趋势,在转染最初的24～48h下降最为迅速,经检验转染组与两对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),而两对照组之间无明显差异(P>0.05)。当对照组的培养基作用于血清饥饿的异位子宫内膜间质细胞后,细胞形成明显的板状伪足,而实验组经PRL-3siRNA干扰后细胞中未能见到典型的板状伪足。transwell实验显示,相同时间内穿越Matrigel迁移浸润的实验组、阴性对照组和空白对照组细胞数分别为：0.87±0.21、1.63±0.39、1.75±0.28,经方差分析叁组间差异均有统计学意义(F=103.69,P<0.05),经SNK法分析实验组与两对照组相比较差异有统计学意义(P<0.05),而两对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。经激光扫描共聚焦显微镜发现,转染后实验组异位子宫内膜间质细胞中应力纤维数目明显增多、变粗而清晰,而细胞的丝状、板状伪足却明显减少。结论：1.PRL-3siRNA能有效沉默PRL-3基因,下调RhoA/ROCK信号转导通路；2.转染PRL-3siRNA后异位子宫内膜间质细胞的迁徙能力明显下降；3.PRL-3介导EhoA/ROCK信号通路对异位子宫内膜细胞迁徙发挥调控作用。
郑彦[3]2012年在《基于“3A程序”探讨丹赤饮对子宫内膜异位症保守术后患者的影响》文中提出目的：以西药GnRH-a或孕叁烯酮作为阳性对照,观察在中药丹赤饮的干预下,气滞血瘀型子宫内膜异位症保守术后患者术后6个月的复发情况,并检测患者的在位内膜中ICAM-1、MMP-9、VEGF的蛋白表达,以及血清中ICAM-1、MMP-9、 VEGF及CA125的含量,评估以上因子的表达改变及其在内异症复发中的可能作用,从“3A程序”的角度探讨丹赤饮对内异症保守术后患者的影响,阐明丹赤饮抑制内异症患者保守术后复发的可能作用机理。方法：本研究隶属于国家自然科学基金面上项目“基于在位内膜及免疫平衡探讨丹赤饮抑制子宫内膜异位症复发的机理”(课题任务书编号：30973769)的部分内容,为探索性临床基础研究。选取自2011年1月至2011年12月于广安门医院和北京友谊医院接受腹腔镜保守性手术并确诊为卵巢子宫内膜异位囊肿、中医辨证分型属于气滞血瘀型的内异症患者20例,随机分为中药组和西药组。另取10例正常对照组为同期手术排除内异症、子宫内膜病理检查未见异常的卵巢单纯性囊肿患者。中药组和西药组均于术后首次月经来潮第1-5天入组并开始给药,连续用药3个月,随访至停药3个月。中药组给予中药丹赤饮汤剂,每日1剂,水煎服,经期不停药；西药组给予GnRH-a注射剂(诺雷德,3.6mg/支,皮下注射,每次1支,首次给药后每隔28天给药1次)或孕叁烯酮胶囊(2.5mg/粒,口服,每次1粒,每周2次)治疗；正常对照组不予药物干预,作为空白对照。采用免疫组化法检测各组患者术前、停药3个月时(正常对照组仅术前,每组各取其中5例)的在位内膜中ICAM-1、MMP-9、VEGF的蛋白表达,采用ELISA法检测各组患者术前、用药3个月、停药3个月时(正常对照组仅术前)的血清中ICAM-1、 MMP-9、VEGF及CA125的含量。应用SPSS16.0统计分析软件对实验数据进行统计学处理,所有计量数据均以均数±标准差(x±s)表示,以P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.停药3个月时,总体观察时间为术后6.5-7个月,平均观察时间为术后(6.66±0.55)个月,中药组和西药组各复发1例,复发时间分别为术后7.5个月和术后6个月,复发率分别为10%(1/10)和20%(2/10),复发患者均为盆腔B超见到巧囊征象伴痛经症状复现。停药3个月时,复发患者的在位内膜中ICAM-1、MMP-9. VEGF的蛋白表达较术前均略有降低,但降幅明显低于未复发者,且仍明显高于正常对照组平均水平；复发患者的血清中ICAM-1、M MP-9、VEGF及CA125的含量较用药3个月时均不同程度地升高(未复发者多表现为不同程度地降低),且仍明显高于正常对照组平均水平,但低于术前水平。2.术前,中药组和西药组的在位内膜中ICAM-1、MMP-9、VEGF的蛋白表达均明显高于正常对照组(P<0.05),中药组与西药组比较,差异无统计学意义(P>0.05)；停药3个月时,中药组和西药组的在位内膜中ICAM-1、MMP-9、 VEGF的蛋白表达较术前均明显降低(P<0.05),中药组与正常对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),而西药组的在位内膜中ICAM-1、MMP-9、 VEGF的蛋白表达仍明显高于正常对照组(P<0.05),亦明显高于中药组(P<0.05)；比较中药组和西药组在术前与停药3个月时的在位内膜中ICAM-1、VEGF的蛋白表达的差值,中药组均明显高于西药组(P<0.05)。3.术前,中药组和西药组的血清中ICAM-1、MMP-9、VEGF的含量均明显高于正常对照组(P<0.05),中药组与西药组比较,差异无统计学意义(P>0.05)；用药3个月和停药3个月时,中药组和西药组的血清中ICAM-1、 MMP-9、VEGF的含量较术前均明显降低(P<0.05)；停药3个月时,中药组的血清MMP-9含量较用药3个月时亦明显降低(P<0.05)；用药3个月时,中药组和西药组的血清中ICAM-1、MMP-9、VEGF的含量仍明显高于正常对照组(P<0.05)；停药3个月时,中药组的血清ICAM-1含量与正常对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),而中药组的血清中MMP-9、VEGF的含量及西药组的血清中ICAM-1、MMP-9、VEGF的含量仍明显高于正常对照组(P<0.05)；比较中药组和西药组在术前与用药3个月时的血清MMP-9含量的差值,中药组明显低于西药组(P<0.05)；比较术前、用药3个月、停药3个月叁个时间点药物对血清中ICAM-1、MMP-9、VEGF的含量的降调作用,差异有统计学意义(P<0.05)；比较中药和西药治疗对血清中ICAM-1、MMP-9、VEGF的含量的降调作用,差异均无统计学意义(P>0.05)。4.术前,中药组和西药组的血清CA125含量均明显高于正常对照组(P<0.05),中药组与西药组比较,差异无统计学意义(P>0.05)；用药3个月和停药3个月时,中药组和西药组的血清CA125含量较术前均明显降低(P<0.05)；用药3个月时,中药组的血清CA125含量仍明显高于正常对照组(P<0.05),而西药组与正常对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),且西药组的血清CA125含量明显低于中药组(P<0.05)；停药3个月时,西药组的血清CA125含量较用药3个月时明显回升(P<0.05),中药组、西药组与正常对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)；比较术前、用药3个月、停药3个月叁个时间点药物对血清CA125含量的降调作用,差异有统计学意义(P<0.05)；比较中药和西药治疗对血清CA125含量的降调作用,差异无统计学意义(P>0.05)。结论：1.“3A程序”核心因子ICAM-1、MMP-9、VEGF于在位内膜和血清中的异常高表达在内异症患者保守术后的复发中可能发挥一定作用,血清CA125含量作为术后疗效监测的辅助指标,对判定复发具有一定价值。2.中药丹赤饮可不同程度地降调内异症患者的在位内膜中ICAM-1、MMP-9、 VEGF的蛋白表达,并下调内异症患者的血清中ICAM-1、MMP-9、VEGF及CA125的含量,从而在一定程度上抑制气滞血瘀型内异症患者保守术后的复发,与目前公认的西医一线阳性药物GnRH-a或孕叁烯酮比较,丹赤饮可能存在一定优势,表现为作用更加稳定持久,并具有累积效应。3.中药丹赤饮抑制内异症患者保守术后复发的作用机理可能为：调节在位内膜的异常蛋白表达,降低内膜细胞的粘附性、侵袭力及促新生血管形成能力,从而阻断“粘附-侵袭-血管生成”的“3A程序”并抑制异位病灶活性。4.本研究从中医学“治未病”的角度探讨了丹赤饮通过干预在位内膜和阻断“3A程序”抑制内异症患者保守术后复发的作用机理,为今后进一步的机理研究和临床开发新药奠定了一定基础。
哈春芳[4]2011年在《OPN/MMP9在子宫内膜异位症大鼠子宫内膜中的表达和意义》文中认为研究背景：子宫内膜异位症(Endometriosis, EMS)是育龄期妇女的多发病,是引起80%患者慢性盆腔疼痛,30%妇科手术的和20%不孕患者的主要原因。尽管基础和临床研究显示EMS属于一种始于细胞水平,止于盆腔疼痛、不孕和盆腔包块为特点的激素依赖性的连续性病变,但目前发病机制不清,治疗对策有限,仍然是临床上亟待解决的难点问题之一。手术治疗是内异症首选的治疗方法,但手术常难以彻底清除所有病灶,术后复发率高,手术结合术后用药可抑制残余病灶、推迟内异症复发的时间,因此药物治疗仍居重要地位,抗粘附、抗侵袭、抗血管生成药物将是下一步治疗内异症的靶点。因此进一步探索内异症细胞异位粘附、侵袭的机制、通路上有效的通路信息分子,将有助于研究有效的药物治疗靶点,为从机制上进行有效的药物干预、指导临床治疗和随访提供依据。骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是一种重要的磷酸化基质蛋白,与其受体整合素和CD44结合通过多种信号途径介导细胞侵袭过程、细胞外基(Extracellular Matrix, ECM)的降解和重塑、细胞迁移、宿主免疫细胞的逃逸和新生血管的形成；朱耀奎、马彩虹等均研究表明OPN蛋白出现在人EMS患者在位和异位内膜中而且表达明显升高；金属基质蛋白酶9(MatrixmetalloProteinase-9, MMP9)是金属基质蛋白酶(MatrixmetalloProteinase, MMPS)家族中分子量最大的明胶酶,来源于结缔组织细胞、巨噬细胞、中性白细胞等,在子宫内膜细胞的异位黏附、种植和生长的过程中发挥重要作用。肿瘤学研究已经证实OPN通过诱导细胞内MMP-9的和其他细胞因子的表达发挥异位黏附、侵蚀和转移作用。内异症虽为良性疾病,但具有明显的侵袭、转移及复发等恶性生物学行为,根据在位内膜决定学说即在位内膜本身的基因与蛋白表达紊乱是决定脱落内膜是否能异地粘附、种植的根本原因,OPN/MMP9作为肿瘤细胞粘附和侵蚀不可缺少的因子,在脱落的内膜细胞种植中是否发挥同等重要的作用。关于此方面的研究国内外从未有相关报道。实验证实,OPN基因5’上游侧区有孕激素调控元件,孕激素及其受体水平可调节OPN的水平；而MMP9上游区的雌激素结合区域,可通过雌激素或旁通路因子调节MMP9的水平。我们既往的研究也显示OPN和MMP9在正常和内异症患者在位、异位内膜中均有表达,而且异位内膜中的表达明显高于正常对照组,提示二者在内异症的发生发展中发挥重要作用,而且受卵巢雌孕激素的调节。由此我们推断雌孕激素是否是通过调节OPN和MMP9表达发挥细胞粘附作用?丙氨瑞林(GnRH-A)、高效孕激素制剂孕叁烯酮及其受体拮抗剂米非司酮是目前临床治疗子宫内膜异位症的一线药物,研究显示上述药物通过调节和抑制下丘脑-垂体-卵巢轴的功能、竞争性抑制局部受体的结合、降低病变局部的雌激素浓度导致异位病症的萎缩；同时也可以通过直接作用于病灶局部,改变病变局部的分子生物学环境,抑制细胞的凋亡和提高细胞的凋亡能力,但是确切机制不清。本课题拟选取丙氨瑞林、孕叁烯酮等激素相关类药物治疗EMS时异位/在位内膜中OPN/MMP9表达的变化为研究目的,通过建立和评估大鼠内异症模型,借助RT-PCR等分子生物学实验方法,探讨药物干预前后组织中OPN/MMP9蛋白和mRNA的变化,进一步揭示内异症中OPN与子宫内膜异位症发生发展的关系、药物作用的可能机制,为临床合理选择药物治疗提供可靠的依据和更多的预后判定指标。第一部分大鼠子宫内膜异位症模型的建立与评估[研究目的]应用传统法和开放法两种方法建立大鼠子宫内膜异位症模型,探讨两种方法建立大鼠子宫内膜异位症模型的特征、判定指标及建模成功率,为进一步研究药物治疗EMS的作用机制奠定基础。[研究方法]开腹取同一只大鼠的子宫,左侧宫腔采用开放法将子宫内膜与骶韧带或大网膜贴近建模,右侧采用移植法将1.0cm的子宫内膜移植于侧腹膜上建模,4周后二次开腹判定成模的特征、成模率,免疫组化测定骨桥蛋白(OPN)及金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达。[研究结果]1.雌激素在建模中的作用及两种方法成模率比较：给药组子宫直径明显较未给药组径线大(P左-左=0.007,P右-右=0.006),二次手术发现给药组与未给药组成模率相比无明显差异(X2开放=0.01,P>0.05；x2移植=0.193 P>0.05))；开放法与移植法成模率比较两组无差异(x2=0.031,P>0.05)。2.两种方法主要大体观及并发症比较：移植法以透亮囊肿为主,占64.80%,其次为紫蓝色结节(10.81%),开放法主要以紫蓝色结节为主,占35.13%,其次为透亮囊肿(24.3%)；术后盆腹腔粘连开放法器官粘连率为64.86%,明显高于移植法的18.9%(P<0.01)；肠梗阻及感染等并发症发生率两组无明显差异(P>0.05)；3.病灶大体观与镜下观分析：大体观见到的各个病灶中,72.70%(24/33)透亮囊肿中镜下可以见到典型的腺上皮、腺体等,不典型腺体或间质细胞仅占21.2%(7/33)；紫蓝色结节中29.41%(5/17)结节中可见到腺体或腺上皮细胞,而火焰状病灶中68.42%(13/22)的标本中可见到镜下典型的腺体或腺上皮细胞；干酪样表现的脓肿镜下未见腺体细胞,仅为大量的淋巴细胞及毛细血管的增生。[结论]1.开放法和移植法均有较高的成模率；2.观察开放法成模的大体观更类似于人类的子宫内膜异位症改变,且具有成模面积大、简单、易行等特点；3.开放法建模病灶弥散,镜下腺体少见,不利于实验性药物干预。第二部分OPN与MMP9在大鼠子宫内膜异位症中的表达及意义[研究目的]检测OPN与MMP9在内异症大鼠在位、异位病灶中蛋白、基因表达的差异,探讨OPN与MMP9在子宫内膜中表达的特点、内异症中OPN与MMP9表达相关关系。[研究方法]建模成功的37只大鼠,建模28天后二次手术开腹,大体观合并组织病理学检查确定建模成功后,取大鼠的在位(在位组)、异位内膜组织(异位组)和未建模的正常大鼠子宫内膜组织(对照组),通过RT-PCR、免疫组化法测定内膜中OPN与MMP9 mRNA、蛋白表达。[研究结果]1. OPN、MMP9在大鼠子宫内膜异位症内膜中的表达：OPN主要高表达与腺上皮细胞的细胞膜上,间质内少量表达,而MMP9主要表达于腺上皮细胞的胞浆内,核内无表达；2. OPN、MMP9蛋白在内异症在位、异位内膜中表达的差异：免疫组化显示异位内膜中OPN表达的IOD值为53735.4±4896,明显高于在位内膜组的33733.8±5322和对照组的37291.2±4588(t在位-异位=17.010；P=0.000；t对照-异位=9.122；P=0.000),对照组和在位组的IOD值无明显差异(t=1.973,P=,0.52)；MMP9表达在异位内膜组为32645±9967,高于在位内膜组和对照组((t在位-异位=8.559；P=0.000；t对照-异位=5.386；P=0.000),而在位组和对照组比较无明显差异(t=0.198,P=,0.844)。3. OPN、MMP9 mRNA在内异症在位、异位内膜中的表达：异位组内膜中OPN、MMP9 mRNA表达明显高于对照组和在位组,而对照组和在位内膜组OPN、MMP9 mRNA表达无明显差异。4.在位、异位内膜组织中OPN、MMP9 mRNA表达的相关性分析：OPN、MMP9 mRNA的表达呈现明显的正相关关系(r在位=0.511,P=0.036；r异位=0.600,P=0.015)。[结论]1.内异症大鼠异位内膜中高表达的OPN与MMP9蛋白和mRNA与内异症细胞的异位粘附、侵袭密切相关。2.大鼠内异症子宫内膜中OPN表达与MMP9表达存在正相关关系,二者通过相应的信息通路途径,共同促进异位细胞的异位粘附和侵袭。第叁部分药物干预对内异症大鼠内膜中OPN/MMP9表达的影[研究目的]检测雌孕激素相关药物干预前后内异症大鼠内膜中OPN/MMP9表达的变化,探讨药物与OPN/MMP9表达的关系以及临床药物治疗病灶局部的可能机制,为临床药物个体化治疗提供依据。[研究方法]1.分组并药物干预：取建模成功的大鼠26只随机分为四组：第一组丙氨瑞林组(GnRH组)6只：丙氨瑞林7.5ug/250g皮下注射每天一次连用一月；第二组：米非司酮组7只：0.62mg/250g每天一次连用一月；第叁组：孕叁烯酮组7只：0.062mg/次,一周两次连用一月；第四组对照组6只：酵母片半片/天连用一月；2.实验方法：药物干预后一月处死大鼠,取在位、异位内膜,RT-PCR法和免疫组化法测定OPN与MMP9蛋白、基因表达。[研究结果]1.药物干预前、后异位病灶囊肿大小的变化：药物干预后各组异位囊肿的直径均比干预前缩小,但统计学处理无差异；干预前各组囊肿大小组间比较无差异；药物干预后各组囊肿大小组间比较无差异。2.药物干预前后在位、异位内膜中OPN表达2.1干预前后在位、异位内膜中OPN蛋白表达：干预前各组在位内膜OPN表达均低于异位内膜组(P<0.05),药物干预后,米非司酮组、孕叁烯酮组及GnRH组中在位内膜和异位内膜中OPN表达无明显差异(P>0.05),没有药物干预的对照组在位内膜中OPN的表达低于异位内膜组织表达(P<0.05)；干预后无论是在位内膜还是异位内膜,OPN表达均较干预前明显降低(P<0.01)；而没有药物干预的对照组中在位、异位内膜中OPN干预后亦低于干预前(P<0.05)。2.2药物干预前后各组间OPN蛋白表达变化：干预前在位、异位内膜中各组间两两比较无明显差异(P>0.05)；干预后,在位内膜对照组高于米非司酮组及GnRH组,而与孕叁烯酮组无差异；异位内膜中对照组高于其他叁组,而米非司酮组与孕叁烯酮组及GnRH组比较无明显差异(P>0.05)；孕叁烯酮组与GnRH组比较有显着性差异(P<0.05)3.药物干预前后在位、异位内膜中MMP9蛋白表达3.1干预前后各组在位内膜、异位内膜中MMP9表达：药物干预前各组在位内膜中MMP9表达明显低于异位内膜(P=0.000)；药物干预后干预组在位与异位内膜MMP9表达无差异(P>O.05),对照组本身异位内膜中MMP9表达仍高于在位内膜的表达(P<0.05)；3.2药物干预前后在位、异位内膜中MMP9蛋白表达差异：干预前各组间两两比较MMP9表达在位、异位内膜中均无差异(F在位=2.827,P=0.062；F异位=2.790 P=0.064)；干预后米非司酮组、孕叁烯酮组及GnRH组在位、异位内膜中MMP9表达均较对照组明显降低；米非司酮组在位、异位内膜中MMP9表达均低于孕叁烯酮组、高于GnRH组在位内膜但低于异位内膜(P<0.001)；在位内膜中孕叁烯酮组与GnRH组比较无差异；异位内膜中GnRH组明显低于孕叁烯酮组和米非司酮组(P<0.001)。4.药物干预前后在位、异位内膜中OPNmRNA、MMP9mRNA表达4.1药物干预前后在位、异位内膜OPN mRNA表达：干预前在位内膜中OPN mRNA表达低于异位内膜(P<0.001),但各组间两两比较在位、异位内膜中OPNmRNA表达无差异(F在位=0.970,P=0.428；F异位=1.947,P=0.156)；干预后对照组在位、异位中OPN mRNA表达高于其他叁组在位与异位内膜中表达(F在位=9.365, P=0.001; F异位=25.249, P=0.000)米非司酮组、孕叁烯酮组及GnRH组两两比较均无差异；4.2药物干预前后在位、异位内膜MMP9 mRNA表达：干预前在位内膜中MMP9mRNA表达低于异位内膜(P<0.001),但各组间两两比较在位、异位内膜中MMP9mRNA表达无差异；干预后MMP9 mRNA在位、异位内膜中表达对照组明显高于各干预组(p<0.001)；组间两两比较在位无差异而异位中孕叁烯酮组低于米非司酮组和GnRH组(P<0.001)。[结论]1.药物干预治疗改变了病变局部的分子生物学环境,但对异位囊肿的大小影响不大。2.药物干预治疗通过改变病灶局部OPN和MMP9表达水平,调节异位细胞的粘附和侵袭而发挥疗效。3.药物抑制病灶局部OPN/MMP9表达上,GnRH-a组优于米非司酮组和孕叁烯酮组,异位内膜中的效果优于在位内膜中。
张英[5]2014年在《可视化裸鼠子宫内膜异位症模型的建立及评价》文中进行了进一步梳理目的：本研究根据子宫内膜异位症特性,对卵巢巧克力囊肿患者的在位及异位子宫内膜组织中的内膜细胞进行离体培养,并将培养成功的细胞悬液注射至裸鼠腹部皮下,建立可视化裸鼠子宫内膜内异症模型,并评价该方法的成模情况,为进一步研究子宫内膜异位症的发病机理等提供可靠模型。方法：选取卵巢巧克力囊肿患者的在位及异位子宫内膜组织,分离出内膜细胞进行离体培养,并将细胞分为分离组(腺上皮细胞、间质细胞)和混合组,然后观察各组细胞的生长特性,应用吉姆萨染色进行细胞形态鉴定,同时应用免疫荧光染色进行细胞特异性鉴定(波形蛋白及角蛋白的表达),最后将200u1不同数量(1.0×106、2.5×106、5.0×106、1.0×107)的各组细胞悬液注射至雌性裸鼠(5-6周龄)的腹部皮下,随后分期观察裸鼠皮下注射部位的变化,同时剥离种植的异位病灶制作标本,进行HE染色,光镜下观察各期病理组织学形态,遂对有腺体生长的异位病灶进行免疫组化检测,进一步明确组织细胞的类型,最终比较分析各方法所得模型的成模率及成模时间。结果：分离培养的腺上皮细胞在体外不能传代,分离培养的间质细胞及混合培养的各组细胞均可传代,混合培养的内膜细胞的增殖能力较分离培养的间质细胞强,差异有统计学意义(P<0.05),混合培养的异位内膜细胞的增殖能力较在位内膜细胞强,差异有统计学意义(P<0.05)。实验中观察到生长良好的异位病灶呈隆起的囊泡样结构,表面有血管生成,病理学证实其内有子宫内膜腺体形成,免疫组化结果确定异位病灶细胞与人类内膜细胞同源；各组在第10天、第15天形成的异位病灶体积与5天时异位病灶体积比较,差异有统计学意义(P<0.05),在第10天与第15天时形成的异位病灶体积比较,差异无统计学意义(P>0.05)。不同数量的在位细胞组模型在第5天、第10天和第15天时各组间成模率比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中细胞数量为5.0×106和1.0×107时的成模率比较,差异无统计学意义(P>0.05)；不同数量的异位细胞组模型在第5天、第10天和第15天时的成模率比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中细胞数量为5.0×106和1.0×107时的成模率比较,差异无统计学意义(P>0.05)；细胞数量为5.0×106/200u1时,异位细胞组的成模率高于在位细胞,比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：腺上皮细胞必须与间质细胞共培养才能传代,间质细胞能够传代但增殖能力较混合的内膜细胞弱,混合培养的异位内膜细胞较在位内膜细胞增殖能力强；应用混合培养的第5-6代异位内膜细胞,以5.0×106/200u1的浓度注射到雌性裸鼠腹部皮下,能够成功构建出子宫内膜异位症模型,该方法成模时间短,成模率高,实现了异位病灶的可视化。
李望舒[6]2017年在《子宫内膜异位症腺上皮细胞中NF-кBp65干预OPN调节MMP9表达及侵袭性研究》文中认为目的1.明确子宫内膜异位症在位内膜腺上皮细胞中NF-кBp65、OPN及MMP9表达情况及其相关性。2.分析子宫内膜异位症在位内膜腺上皮细胞中核因子NF-кBp65在OPN调节MMP9表达中的作用。3.探讨子宫内膜异位症在位内膜腺上皮细胞中NF-κBp65干预前后细胞侵袭性的变化。方法1.收集分泌期EMs患者在位内膜12例,将EMs腺上皮细胞进行原代分离、培养、纯化,通过免疫细胞化学法测定OPN、NF-кBp65及MMP9在腺上皮细胞中的表达情况;分别通过基因沉默及质粒导入的方法,对内异症患者分泌期在位内膜腺上皮细胞中NF-кBp65进行干预,Real Time-PCR及western-blot检测NF-кBp65、OPN、MMP9 mRNA及蛋白表达的变化。2.通过侵袭小室实验测定干预NF-кBp65基因前后细胞侵袭性的变化。结果1.免疫细胞化学结果显示:NF-кBp65、OPN及MMP9主要定位于EMs腺上皮细胞的胞浆中。2.NF-кBp65 siRNA基因沉默后腺上皮细胞中NF-кBp65、MMP9 mRNA及蛋白的表达较干预前明显下降,其差异具有统计学意义(P<0.05),NF-кBp65质粒导入后NF-кBp65及MMP9 mRNA及蛋白表达均明显增高,其差异具有统计学意义(P<0.05),NF-кBp65 siRNA基因沉默及质粒导入后OPN表达均无明显改变,差异无统计学意义(P >0.05)。3.内异症患者在位内膜腺上皮细胞中,NF-кBp65 siRNA干预后其细胞侵袭性较干预前明显降低,NF-кBp65质粒干预后其细胞侵袭性明显增加,其差异具有统计学意义(P均<0.05)结论1.NF-кBp65 siRNA沉默EMs患者在位内膜腺上皮细胞后,NF-кBp65及MMP9的表达明显下降;NF-кBp65质粒上调EMs患者在位内膜腺上皮细胞后,NF-кBp65及MMP9的表达明显增高,揭示了NF-кB是干预OPN调节MMP9在内异症患者内膜中异常表达的关键。2.NF-кBp65 siRNA基因沉默EMs患者在位内膜腺上皮细胞后,腺上皮细胞的侵袭性明显降低;NF-кBp65质粒上调EMs患者在位内膜腺上皮细胞后,腺上皮细胞的侵袭性明显增加,提示内异症中NF-кBp65通过调节OPN/MMP9表达改变细胞侵袭性。
周美浓[7]2013年在《HMGB1在卵巢子宫内膜异位中的表达及意义》文中进行了进一步梳理目的：研究HMGB1在卵巢子宫内膜异位症中的表达及临床意义。方法：采用RT-PCR和western-blotting检测HMGB1mRNA和HMGB1蛋白在29例卵巢子宫内膜异位症患者异位子宫内膜和在位内膜及29例非子宫内膜异位症患者的在位内膜中(对照组)的表达情况。结果：HMGB1mRNA在卵巢异位子宫内膜、在位内膜和非异位症的在位内膜均有表达,其表达灰度值为：卵巢异位内膜组：0.5438±0.0565,在位内膜组：0.3016±0.0614,对照组：0.1536±0.0444(p<0.05)叁组之间有明显差异;ANOVA分析F=185.625,(p<0.0001);2) HMGB1蛋白：卵巢异位内膜组：0.8399±0.0287；在位内膜组：0.4010±0.0643；对照组：0.1999±0.0716(p<0.05)叁组之间有明显差异,且两两之间差异有显着性,F=377.923,(p<0.0001)。HMGB1在卵巢子宫内膜异位症中异位内膜中的表达与分期有关,与病程、肿瘤大小、患者年龄无明显相关。结论：1.HMGB1在卵巢子宫内膜异位中的高表达,说明可能在卵巢子宫内膜异位症的发生、发展中起重要作用。2.HMGB1随着临床分期的增加而表达明显,说明与病变程度生物学行为有密切关切,有可能成为监测子宫内膜异位症病情严重程度的标记物。
黄飞翔[8]2013年在《Paxillin在子宫内膜异位症在位子宫内膜的表达及黄芩素对其表达的影响》文中研究表明研究背景：子宫内膜异位症(endometriosis,简称内异症)是育龄妇女的常见病、多发病,该病虽为良性疾病,但具有类似恶性肿瘤浸润、生长的恶性生物学行为,且有0.7%-1.0%恶变率和较高的复发率。其病变广泛、形态多样。该病可引起痛经、慢性性盆腔痛、月经不调、性交痛、不孕等,严重影响女性的健康和生活。迄今为止内异症的发病机理尚未十分明了,关于内异症的发病机制,纵说纷纭,其中较为盛行的是Sampson的“经血逆流学说”,但经血逆流的现象较常见,发生率约为80%-90%,远高于内异症患病率(10%15%),“经血逆流学说”不能很好地解释这种现象。郎景和在“经血逆流学说”的基础上提出“在位内膜决定论”,指出在位内膜的异常生物学行为主导内异症的发生,经血逆流只是导致内异症发生的一个桥梁。该学说为内异症病机的的深入研究提供了新思想、新方向。内异症虽然是良性疾病,但具有与恶性肿瘤相似的侵袭性。桩蛋白(Paxillin)是研究较多的与肿瘤侵袭性相关的信号衔接蛋白,广泛地存在于各物种的细胞浆内,主要定位于黏着斑,能够和一系列的信号蛋白和结构蛋白结合,将细胞外信号传递到细胞内,在细胞信号的传导中发挥重要作用。Paxillin通过传导细胞信号,在器官发育、损伤修复、细胞运动、细胞粘附等多项细胞活动中发挥重要作用。目前未曾有对Paxillin与内异症细胞侵袭性进行相关性研究。因Paxillin广泛存在于人体组织中,且其表达异常和细胞的运动有一定的相关性,因此我们推测其可能与内异症细胞的侵袭性有一定的相关性黄芩素(baicalein)是从黄芩中提取的黄酮类化合物,是黄芩的主要有效成分,也是其发挥药理作用的物质基础。研究表明黄芩索具有抗凝、抗血栓、抗肿瘤、抗氧化、清除自由基、抗炎、抗病毒等作用。黄芩索具有抑制大多数肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用,还可以通过改变细胞形态,抑制肿瘤细胞的运动和迁移能力,从而控制肿瘤发展。目前尚未有关于黄芩素和内异症在位内膜细胞侵袭性之间的研究。由于黄芩索对肿瘤细胞侵袭力的抑制性,我们推测其对内异症在位内膜细’胞的侵袭力亦有一定的抑制作用。由于伦理学因素的限制,很多研究无法在人身上进行,因此,建立良好的实验模型对内异症的研究具有重要意义。内异症实验模型经历了从动物模型到细胞模型的转变,随着细胞培养技术的兴起,内异症细胞体外模型的建立,为观察细胞生长形态、生物学活性及药物干预提供了极大的便利,为内异症病因病机的研究及治疗措施的探索做出了巨大的贡献。研究目的：1.分别建立内异症在位子宫内膜及正常子宫内膜腺上皮细胞、基质细胞体外共培养模型。2.观测内异症在位子宫内膜细胞及正常子宫内膜细胞的生长情况及生物学活性,并对其进行免疫鉴定。3.观察内异症在位内膜细胞与正常内膜细胞中Paxillin mRNA及蛋白达水平的差异。4.黄芩素干预后,检测内异症在位内膜细胞中Paxillin mRNA及蛋白达水平，并探讨其与细胞侵袭力之间的相关性。方法：1.取25例子宫内膜异位症患者分泌期在位子宫内膜(内异症组)和20例非子宫内膜异位症患者分泌期子宫内膜(对照组)组织,消化、离心洗涤、去除杂质后,混合培养子宫内膜腺上皮细胞与基质细胞。2.HE染色观察内异症组与对照组细胞形态学特征3.SP免疫细胞化学鉴定法鉴定细胞。4.RT-PCR法检测Paxillin mRNA在两组细胞中的表达差异5.Western blot法检测Paxillin蛋白在两组细胞中的表达差异6.以不同浓度黄芩素作用于内异症组细胞,用MTT法测算细胞抑制率7.应用transwell小室观测黄芩素干预后内异症组细胞侵袭力的改变。8.RT-PCR法检测黄芩素干预后内异症组细胞Paxillin mRNA表达水平的变化情况。9.Western blot法检测黄芩素干预后内异症组细胞Paxillin蛋白表达水平的变化。10.观测Paxillin mRNA及蛋白表达水平和侵袭性的相关性结果：1.内异症组成功22例,对照组成功18例。成功建立子宫内膜腺上皮和间质细胞体外共培养模型,经HE染色及免疫组化鉴定培养的细胞的确为子宫内膜细胞。2.内异症组与对照组腺细胞形态学特征相似,但内异症组细胞生长速度较对照组快。3.RT-PCR结果显示,内异症在位内膜细胞Paxillin mRNA的相对表达水平(0.608±0.021)明显高于对照组内膜细胞Paxillin mRNA的相对表达水平(0.291±0.023),两组比较有统计学意义(P<0.05)。4.Western blot结果显示,内异症组在位内膜细胞Paxillin蛋白的相对表达水平(0.523±0.025)明显高于对照组内膜细胞Paxillin蛋白表达水平(0.226±0.022),两者差异有统计学意义(P<0.05)。5.MTT法显示黄芩素可以抑制内异症在位内膜细胞的生长,并随着黄芩素浓度的升高、作用时间的延长,其抑制率增加,呈时间-剂量依赖型。6.将0umol/L.20umol/L.40umol/L.80umol/L的黄芩素溶液分别加入内异症在位内膜细胞中,干预48h后,经RT-PCR检测显示,黄芩素能够降低内异症患者在位内膜细胞Paxillin mRNA的表达水平,各组Paxillin mRNA的相对表达量分别为0.606±0.019、0.528±0.018、0.41910.021、0.336±0.014,呈剂量依赖性,组间比较有统计学意义(P<0.05)。7.将0umol/L、20umol/L、40umol/L、80umol/I的黄芩素溶液分别加入内异症在位内膜细胞中,干预48h后,经western-blot检测显示,黄芩素能够降低内异症患者在位内膜细胞Paxillin蛋白的表达水平,各组Paxillin蛋白的相对表达量分别为0.520±0.014、0.438±0.026、0，376±0.021、0.298±0.015,呈剂量依赖性,组间比较有统计学意义(P<0.05)。8.取0umol/L、20umol/L、40umol/L.80umol/L黄芩素干预48h后的内异症在位内膜细胞进行侵袭性检测,内异症未加药组、低浓度组、中浓度组、高浓度组及正常组侵袭细胞个数分别8.80±0.548、6.40±1.140、3.80±0.837、2.20±0.836、0.20±0.447,各组间差异有统计学意义(P<0.05)。内异症组细胞侵袭力均明显高于正常子宫内膜细胞,随着黄芩素浓度的升高,内异证组细胞侵袭力均降低,呈剂量依赖性结论：1、本实验成功建立了子宫内膜异位症在位子宫内膜细胞体外共培养模型,在细胞水平观测了内异症在位子宫内膜细胞和正常子宫内膜细胞形态及生物活性上的异同点。2、内异症组位内膜细胞中Paxillin mRNA、蛋白的表达水平均高于于正常内膜细胞。3、内异症组细胞侵袭力高于对照组细胞。4、黄芩素可以降低内异症组细胞Paxillin mRNA及蛋白表达水平,并抑制内异症组细胞侵袭力,呈剂量依赖性。Paxillin基因及蛋白的高表达可能是引起内异症在位子宫内膜侵袭性增高的一个原因。5、黄芩素能够抑制内异症在位子宫内膜细胞侵袭力,为中药治疗子宫内膜异位症提供了新的思路和方法。
汤倩倩[9]2013年在《子宫腺肌病临床相关因素及FOXC2表达的研究》文中研究说明子宫腺肌病（AM）为育龄女性常见而难治的一种良性疾病，其病理形态学表现为良性，却具有类似恶性肿瘤的生物学行为，正是这种恶性行为，导致病情迁延不愈并进行性加重，药物治疗效果差，全子宫切除成为最终治疗手段，严重威胁妇女身心健康，目前其发病机制、临床特点及诊断治疗方面仍面临巨大挑战。FOXC2是一个胚胎性转录因子，在胚胎心血管、淋巴管、软骨组织、骨骼、眼睛间质、肾脏等多个中胚层衍生组织发生过程中起关键作用。近年来许多研究发现，FOXC2在乳腺癌、淋巴瘤及妇科恶性肿瘤的形成、浸润及转移等方面发挥着重要作用。本实验通过免疫组化检测AM中FOXC2的表达及其意义。目的：探讨FOXC2在AM的发生及演进过程中的作用，进一步探究AM的分子生物学机制，寻找相关分子标志物。方法：应用免疫组化方法检测正常子宫及AM组织中FOXC2的表达情况。结果：FOXC2表达于AM组织异位内膜腺上皮细胞，且异位子宫内膜腺体上皮细胞中FOXC2表达强度高于正常内膜腺体上皮细胞；FOXC2阳性表达于AM内膜间质细胞胞核中，胞浆不表达，FOXC2在正常子宫内膜间质细胞核和胞浆中均有FOXC2表达，且AM内膜间质细胞FOXC2表达强度高于正常内膜内膜间质细胞。结论：FOXC2在AM的发生、发展过程中起关键作用，可能为其分子标志物之一。AM多发生于40岁以上经产妇，主要临床表现是经量增多、经期延长及逐渐加剧的进行性痛经，近年来文献报道CA125对AM的诊断和鉴别诊断中具有非常重要的临床应用价值。本临床研究通过对分析140例AM住院患者的临床资料分析AM的相关临床因素。目的：分析AM主要症状及影响因素，研究血清CA125与子宫大小及痛经程度的相关性探讨其在诊断及病情监测中的应用价值。方法：通过分析140例AM住院患者的临床资料，获得AM发病情况、症状特点、孕产次、彩超特征及CA125水平。结果：AM患者主要症状为月经异常及痛经，但两者之间无互相影响关系，痛经程度受首发年龄、病程长短及孕产次的影响，而孕产次数对月经异常无明显影响；术前CA125联合妇科彩超可明显提高AM的确诊率，且均方便、快捷、便宜、无创伤。AM患者血清CA125水平与子宫体积、痛经程度均成正相关，且子宫体增大越明显，痛经程度越严重，血清CA125增高越明显。结论：CA125对AM的诊断及病情监测中具有非常重要的临床应用价值。
许艳丽[10]2010年在《Cofilin-1基因在子宫内膜异位症发病机制中的作用研究》文中认为目的子宫内膜异位症(内异症,Endometriosis, EMs)是育龄期妇女常见病、多发病,具有浸润、转移等恶性肿瘤的特征。迄今为止其发病机制仍未阐明。关于其发病机制,经血逆流学说是目前最被广为接受的理论。但不能解释经血逆流的发生率有80%-90%,而EMs的发生率只有10%-15%。大量研究结果显示,EMs在位内膜基因表达的异常改变可能是内异症发生的基础,这些改变可能直接影响子宫内膜异位症的发病过程。Cofilin-1(CFL1)基因是前期工作中通过cDNA-RDA(cDNA代表性差异分析)技术筛查出的EMs在位内膜与正常子宫内膜差异表达基因,提示其可能与内异症的发生相关,但其在内异症发生中的作用及机制无相关报道。Cofilin-1基因定位在11q13。CFL1蛋白是一种细胞骨架蛋白,分子量19KD,属于肌动蛋白解聚因子家族。CFL1在促进actin解聚/聚合的转换中占据中枢位置。CFL1通过调节actin细胞骨架的重组参与细胞周期调控、细胞分裂、细胞动力、细胞粘附及肿瘤进展等多种生理及病理过程。癌症细胞中CFL1表达抑制降低了细胞动力。CFL1表达的下调降低侵袭伪足的装配和稳定性,显示了CFL1在细胞侵袭中的重要角色。CFL1与血管发生关系密切,它已经确定为某些血管形成抑制剂的作用靶点。根据经血逆流学说,粘附、侵袭、血管形成是内异症发病的基本过程。那么与细胞粘附、侵袭、血管形成等均密切相关的CFL1是否参与内异症的发生呢?CFL1在内异症的发生发展过程中具有什么样的作用呢?本研究在国内外首次探讨CFL1在内异症发病机制中的作用。方法一、CFL1在子宫内膜异位症在位内膜、异位病灶及正常子宫内膜中的表达(一)、利用实时荧光定量PCR方法检测CFL1mRNA在子宫内膜异位症在位内膜、异位病灶及正常子宫内膜中的表达。(二)、利用蛋白免疫印迹技术检测CFL1蛋白在子宫内膜异位症在位内膜、异位病灶及正常子宫内膜中的表达。二、体外实验研究CFL1对子宫内膜异位症在位内膜间质细胞(ESC)及正常内膜间质细胞(NSC)生物学活性的影响(一)、原代培养ESC及NSC。(二)、免疫细胞化学染色鉴定细胞。(叁)、靶向ESC中CFL1基因的RNA干扰：构建3个CFL1shRNA表达载体pRT-CFL-s1、pRT-CFL-s2和pRT-CFL-s3。(四)、构建pEGFP-N1-CFL重组质粒转染NSC。(五)、实时荧光定量PCR检测ESC中CFL1基因RNA干扰效果及NSC在转染pEGFP-N1-CFL重组质粒后CFL1mRNA表达水平。(六)、蛋白免疫印迹检测ESC中CFL1基因RNA干扰效果及NSC在转染pEGFP-N1-CFL重组质粒后CFL1蛋白表达水平。(七)、CCK-8细胞增殖实验检测CFL表达改变前后细胞增殖的变化。(八)、应用Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒检测CFL表达改变前后细胞凋亡的改变。(九)、细胞粘附实验检测检测CFL表达改变前后细胞粘附能力的改变。Transwell细胞侵袭实验检测CFL表达改变前后细胞侵袭能力的改变。(十一)、酶联免疫吸附试验检测CFL表达改变前后ICAM-1、VEGF、MMP-9在细胞培养上清中的含量变化。(十二)、透射电镜(TEM)观察CFL表达改变前后细胞超微结构的改变。叁、体内实验研究CFL1对ESC及NSC体内种植能力的影响(一)、原代培养ESC及NSC。(二)、免疫细胞化学染色鉴定细胞。(叁)、靶向ESC中CFL1基因的RNA干扰。(四)、构建pEGFP-N1-CFL重组质粒转染NSC。(五)、腹腔注射细胞悬液构建子宫内膜异位症裸鼠模型,拍摄照片,游离病灶,计算病灶体积结果一、CFL1在子宫内膜异位症在位内膜、异位病灶及正常子宫内膜中的表达(一)、实时荧光定量PCR结果显示以20例正常内膜CFL1 mRNA相对表达水平的平均值为1,CFL1在内异症在位内膜中相对表达水平是正常内膜的(4.56±1.90)倍,CFL1在异位病灶中的相对表达水平是正常内膜的(4.81±1.44)倍,在位内膜及异位病灶分别与正常内膜表达量比较差异有统计学意义(P<0.05),在位内膜与异位病灶之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。(二)、蛋白免疫印迹显示以正常内膜CFL1蛋白相对表达水平的平均值为1,CFL1蛋白表达水平在内异症组在位内膜的相对表达水平为正常内膜的(3.37±0.30)倍,异位病灶为正常内膜的(3.35±0.35)倍,在位内膜及异位病灶分别与正常内膜表达量比较差异有统计学意义(P<0.05),在位内膜与异位病灶之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。二、CFL1对子宫内膜异位症在位内膜间质细胞及正常内膜间质细胞生物学活性的影响(一)、体外成功分离和培养了子宫内膜异位症在位内膜间质细胞(ESC)及正常内膜间质细胞(NSC)(二)、免疫细胞化学染色鉴定结果表明细胞波形蛋白染色阳性,CD10染色阳性,角蛋白、Ⅷ因子及白细胞共同抗原染色均阴性,证实为子宫内膜间质细胞。(叁)、构建了叁个靶向CFL1基因的CFL1shRNA表达载体pRT-CFL-s1、pRT-CFL-s2和pRT-CFL-s3及pEGFP-Nl-CFL重组质粒。(四)、实时荧光定量PCR结果显示：以NSC的CFL1 mRNA相对表达水平的平均值为1,ESC的CFL1mRNA水平为NSC的(4.56±1.90)倍,转染pRT-CFL-s1、pRT-CFL-s2和pRT-CFL-s3叁个表达载体后,ESC中CFL1 mRNA水平分别为NSC的(1.88±0.60)、(0.31±0.23)、(0.88±0.39)倍,分别与转染前相比,差异具有统计学意义(P<0.05),其中pRT-CFL-s2表达载体对ESC中CFL1mRNA的抑制效果最显着,转染CFL1shRNA阴性对照质粒(pRT-sNC)及空质粒(pRT-V)的ESC中CFL1mRNA表达无明显变化；在转染pEGFP-N1-CFL质粒后CFL1 mRNA相对表达水平为转染前NSC的(3.16±0.99)倍,显着上调(P<0.05),转染pEGFP-N1空质粒(pEGFP-N1-V)的NSC的CFL1 mRNA水平无明显变化。(五)、蛋白免疫印迹结果显示：以的CFL1蛋白相对表达水平的平均值为1,ESC中CFL1蛋白相对表达水平为NSC的(3.37±0.30)倍,转染pRT-CFL-s1、pRT-CFL-s2和pRT-CFL-s3叁个表达载体后,ESC中CFL1蛋白水平分别降低为NSC的(1.544±0.36)、(0.33±0.28)、(0.98±0.47)倍,分别与转染前相比,差异具有统计学意义(P<0.05),其中pRT-CFL-s2表达载体对ESC中CFL1蛋白的抑制效果最显着,转染pRT-sNC及pRT-V的ESC中CFL1蛋白表达无明显变化；在转染pEGFP-N1-CFL质粒后CFLl蛋白相对表达水平为转染前NSC的(2.444±0.43)倍,差异具有统计学意义(P<0.05),转染pEGFP-N1-V的NSC的CFL1蛋白水平无明显变化。与实时荧光定量PCR结果一致。因pRT-CFL-s2对CFL1mRNA和蛋白的干扰效果最强,后续功能试验均选用pRT-CFL-s2。(六)、CCK-8细胞增殖实验绘制细胞生长曲线显示：从转染pRT-CFL-s2表达载体48h开始,ESC增殖率明显受抑,转染pRT-sNC及pRT-V两个对照质粒后ESC增殖率无明显变化；而NSC在转染pEGFP-N1-CFL质粒48h开始,增殖率显着上调；转染pEGFP-N1-V质粒后NSC增殖率无明显变化。(七)、Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒检测结果显示自然状态下,ESC凋亡率显着低于NSC;转染pRT-CFL-s2表达载体后ESC凋亡率显着上升,转染pRT-sNC及pRT-V两个对照质粒的ESC凋亡率无显着变化;NSC在转染pEGFP-N1-CFL质粒凋亡率显着下降,转染pEGFP-N1-V质粒后NSC凋亡率无明显变化。(八)、细胞粘附实验结果显示自然状态下,ESC粘附力显着高于NSC;转染pRT-CFL-s2表达载体后ESC粘附力显着下降,转染pRT-sNC及pRT-V两个对照质粒的ESC粘附力无显着变化；NSC在转染pEGFP-N1-CFL质粒粘附力显着提高,转染pEGFP-N1-V质粒后NSC粘附力无明显变化。(九)、细胞侵袭实验结果显示自然状态下,ESC侵袭力显着高于NSC;转染pRT-CFL-s2表达载体后ESC侵袭力显着下降,转染pRT-sNC及pRT-V两个对照质粒的ESC侵袭力无显着变化;NSC在转染pEGFP-Nl-CFL质粒侵袭力显着提高,转染pEGFP-N1-V质粒后NSC侵袭力无明显变化。(十)、酶联免疫吸附试验结果表明自然状态下,ESC较NSC分泌更多的ICAM-1、VEGF及MMP-9；转染pRT-CFL-s2表达载体后ESC分泌ICAM-1、VEGF及MMP-9较转染前显着减少,转染pRT-sNC及pRT-V两个对照质粒的ESC对叁者的分泌量无显着变化；NSC在转染pEGFP-N1-CFL质粒后分泌ICAM-1、VEGF及MMP-9显着增多,转染pEGFP-N1-V质粒后对叁者的分泌量无显着变化。(十一)、透射电镜结果显示在基础状态ESC细胞表面多突起,细胞核形状不规则,多切迹,无染色质边集现象；沉默CFLl表达后,ESC细胞表面突起减少,异染色质呈团块状,多有边集；NSC细胞表面突起较少,异染色质边集现象明显；上调CFL1表达后,NSC细胞表面突起较多,无异染色质边集发生。叁、体内实验研究CFL1对子宫内膜异位症在位内膜间质细胞及正常内膜间质体内种植能力的影响ESC所构建内异症裸鼠模型的相对异位病灶体积(6.40±1.03)mm3大于NSC的(1.00±0.17)mm3,差异具有统计学意义；转染pRT-CFL-s2表达载体后ESC所构建内异症裸鼠模型的相对异位病灶体积(2.28±2.25)mm3较转染前(6.40±1.03)mm3显着减小,转染pRT-sNC及pRT-V两个对照质粒的ESC所构建内异症裸鼠模型的相对异位病灶体积分别为(5.92±0.45)mm3、(5.81±0.42)mm3,与转染前相比,差异无统计学意义；NSC在转染pEGFP-N1-CFL质粒后构建内异症裸鼠模型的相对异位病灶体积为(3.00±0.54)mm3,较转染前显着增大,转染pEGFP-N1-V质粒后构建内异症裸鼠模型的异位病灶体积(0.73±0.29)mm3,与转染前相比,差异无统计学意义。结论1、CFL1基因在子宫内膜异位症在位内膜及异位病灶中表达高于正常内膜。2、CFL1的过度表达与ESC具有更强的增殖活性,更低的凋亡率,更强的粘附力及侵袭力,能够更多的分泌ICAM-1、VEGF及MMP-9有关,CFL1可能参与内异症的发生发展。CFL1在ESC与NSC之间的差异表达可能是ESC与NSC存在诸多生物学差异的重要因素。3、ESC比NSC具有更强体内种植能力；CFL1的过度表达与ESC强烈的体内种植能力有关。ESC与NSC之间的CFL1差异表达可能是ESC与NSC体内种植能力差异的重要因素。
参考文献：
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