湖南省妇幼保健院医学遗传科 湖南长沙 410008
摘要：目的：本文主要探讨KLF1基因对α-地中海贫血的遗传修饰作用。方法：通过筛查大样本的α-地中海贫血人群的KLF1基因突变，通过比较携带具有功能影响的KLF1突变个体与KLF1野生型个体之间血液学指标和临床表型差异，观察KLF1基因是否对α-地中海贫血具有遗传修饰作用。结果：HBA基因型、HBB基因型以及性别和HbH病严重程度有显著性关联，其中，HBA基因型对HbH病严重程度作用最强，其次是HBB基因型，第三是性别。而KLF1基因和HbH病严重程度没有显著关联。结论：KLF1基因突变和α-地中海贫血有着非常密切的联系，有助于辅助α-地中海贫血进行临床诊断，同时也阐明了α-地中海贫血携带者表型多样性和缺失型α-地中海贫血特殊的血液学表型出现的原因。
关键词：KLF1基因；α-地中海贫血；突变；遗传修饰作用
α-地中海贫血是一种隐性遗传性溶血性血红蛋白疾病，在我国南方地区具有很高的人群携带率，致病机理是由于阿尔法珠蛋白基因缺陷，导致相应的珠蛋白肽链合成不足，破坏了α和β珠蛋白链平衡，从而引发溶血性贫血[1]。本次研究目的在于探讨KLF1基因对α-地中海贫血的遗传修饰作用，结果较为满意，现报告如下。
1.资料与方法
1.1临床资料
本次研究对来自中国南方的1579例无血缘关系的α-地中海贫血个体进行回顾性分析，其中，包括826个随机连续的HbH病患者和753个成年的β-珠蛋白基因正常的α-地中海贫血携带者。753例α-地中海贫血携带者中，442例伴随HbF水平升高，将其作为A组；其余311例HbF水平正常，将其作为B组。826个随机连续的HbH病患者作为C组，根据临床常用分类指标，可以分为相对较轻的表型354例和相对较重的表型472例。轻型HbH患者是指血红蛋白含量保持在每升90克以上，并且不需要接受定期输血的患者。重型HbH患者是指血红蛋白含量每升低于90克且需要接受定期输血的患者。HbH病患者所有的血液学指标都要在输血前收集。本次研究的所有研究对象都签署了知情同意书[2]。
1.2基因型和血液学参数的测定
所有的血液学参数都用指定型号的自动细胞计数仪和高效液相色谱法进行测定，运用酚氯仿法抽取参与者外周静脉血来提取基因组DNA。根据科室早前流行病学调查研究中所用的筛查地中海贫血的方法来验证HBA和HBB基因上的缺失型和点突变[3]。使用高分辨率熔解分析检测所有参加者的KLF1基因型，使用的引物和实验条件均根据早前本实验室的研究。对于所有怀疑携带有变异的样本进行桑格测序，确定变异所在位置。应用SIFT和PolyPhen-2软件来预测所发现的KLF1变异是否影响其蛋白质结构和功能，同时结合流式细胞分析突变携带者的红细胞表面抗原CD44表达是否下降。若两者都为真，就认为该变异为具有功能影响的KLF1突变[4]。
1.3统计学分析
所有的统计分析均使用SPSS 13.0统计软件，P值<0.05视为具有显著的统计学差异。独立样本t检验和卡方检验分别用于评估血液学参数和定性资料是否存在显著性差异。逻辑回归分析用于评估4个潜在修饰因素，包括HBA基因型，HBB基因，KLF1基因型和性别，与HbH病患者表型轻重的关系[5]。
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2.结果
2.1KLF1突变的鉴定
此次研究从中国南方1579名α-地中海贫血个体中，共发现72名受试者携带杂合的具有功能影响的KLF1突变，包括A组中的76名a-地中海贫血携带者和C组中的8名HbH病患者。使用HRM分析对KLF1基因进行筛选，总共发现18种变异，包括5种具有功能影响的突变，4种常见的多态位点和9种中性变异。上述5种具有功能影响的突变包括4种错义突变和一种移码突变。这些错义突变都位于KLF1的锌指结构并在不同的哺乳动物物种中的高度保守，而移码突变则破坏了 KLF1的锌指结构。另外，我们发现了 2个新的变异，包括在 5'UTR 上的c.-23_-21delC 和在 3’UTR 上的 c.*119C>T。
2.2α-地中海贫血携带者血液学参数的变化
由于在8名a+-地中海贫血纯合子中，只发现一例携带KLF1突变，在9名基因为αQSα/αα的α-地中海贫血携带者中并无发现一例携带KLF1突变，因此，在A组的442名携带者中，这16个个体会被排除作进一步的分析。426例参与者按照HBA基因型的分类分别对携带野生型KLF1和携带KLF1突变的个体进行比较血液学参数。通过比较发现KLFI突变阳性的α-地中海贫血携带者具有显著降低的平均红细胞体积、平均血红蛋白含量和增高的HbA2的水平。此外，我们发现除了那些基因型为-α3.7 /αα的a-地中海贫血携带者外，其余KLF1突变阳性的个体的HbF含量均明显增加。Hb水平并没有明显变化，除了基因型为-α3.7 /αα的女性携带者外（P<0.05）。
2.3和HbH病严重程度有关的修饰因素
二元逻辑回归结果表明：HBA基因型、HBB基因型以及性别和HbH病严重程度有显著性关联，其中，HBA基因型对HbH病严重程度作用最强，其次是HBB基因型，第三是性别。而KLF1基因和HbH病严重程度没有显著关联。
3.讨论
在本研究中，发现最常见的KLF1突变是p.Glyl76AlafsX179移码突变，这种突变出现在66个个体中（约占91.67%）。另外，9种中性变异是否对KLF1有功能影响和对a-地中海贫血的表型有修饰，需要做进一步的后续研究。最近的研究报告发现，在观察正常个体和散发的-α3.7 /αα携带者中，KLFI突变会引起Hb A2和Hb F水平升高。根据结果，该结论可以扩展到α-和α+-地中海贫血携带者。A组的KLFJ突变发生率显著高于B组（15.05% vs 0%），这进一步说明了杂合的KLFI突变与Hb F的水平之间存在必然的联系[6]。尽管目前已经一些关于已知遗传修饰因素对β-地中海贫血的严重程度预测的报道，据我们所知，本研究是首次针对HbH病的严重程度进行多因素分析。根据三个阳性因素：HBA基因型、HBB基因型和性别，大约有73.6%的Hb H病患者的临床表型严重程度可以得到解释。其余26.4%的病例可能是由于遗传背景的多样性和环境差异而导致的。
参考文献：
[1]肖维威，徐湘民，徐钤.中国人缺失型α-地中海贫血的分子基础及产前基因诊断[J].第一军医大学学报，1998，01：68-72.
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[3]张翠梅，王莹，高建慧，廖加洛，冯华俊，万波，万志丹，黄国智.中山市户籍人群中α-地中海贫血的分子流行病学调查[J].中国儿童保健杂志，2010，05：361-364.
[4]田文芳，唐喜军，易素芬.广东省珠海地区α-和β-地中海贫血基因突变类型研究[J].检验医学与临床，2011，12：1487-1488.
[5]陈延娥，郭广洲，张宇英，张仁利，朱高云.α-地中海贫血产前筛查及基因型分析[J].中国热带医学，2007，04：504-505.
[6]刘彦慧，吴亚敏，石少权，娄季武，马秋林，何怡，徐婉芳，林洋洋，周万军.基于父源差异SNP位点的等位基因特异性实时荧光PCR方法建立及其在α~0-地中海贫血无创产前诊断中的应用[J].第三军医大学学报，2012，20：2082-2085.
论文作者:余梓禋
论文发表刊物:《健康世界》2015年19期供稿
论文发表时间:2016/2/16
标签：地中海论文; 突变论文; 携带者论文; 表型论文; 基因论文; 基因型论文; 血液学论文; 《健康世界》2015年19期供稿论文;