（中药现代制剂技术教育部工程研究中心，上海中医药大学 上海 201203）
【摘要】目的：观察牛蒡子总木脂素(TLFA)对体外培养的视网膜微血管内皮细胞(RMECs)迁移及血管内皮生长因子（VEGF)蛋白表达的影响。方法：采用细胞划痕实验测定TLFA对SD大鼠RMECs迁移的影响，qRT-PCR检测TLFA刺激后RMECs的VEGF表达水平变化。结果：TLFA对SD大鼠RMECs迁移具有显著的抑制作用,且抑制作用的强弱呈剂量依赖性。TLFA对RMECs中VEGF mRNA表达的抑制作用呈浓度—时间依赖性。结论：TLFA抑制大鼠RMECs迁移的作用机制可能与其抑制VEGF mRNA的表达有关，它可能通过抑制VEGF的表达而抑制视网膜新生血管的形成。
【关键词】牛蒡子总木脂素；视网膜微血管内皮细胞；血管内皮生长因子
【中图分类号】R285 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2018）11-0339-03
糖尿病性视网膜病变（Diabetic Retinopathy，DR）是糖尿病的常见并发症之一，当前已成为成年人致盲的主要原因,其严重性日益引起关注[1]。DR是一种多因素疾病，其发病机制极其复杂。最初，DR被认为是内皮功能障碍的微血管并发症，然而目前公认的是DR影响几乎所有类型的视网膜细胞[2]。TLFA是一类从中药材牛蒡子中分离得到的木脂素类化合物[3]，在前期研究中，我们发现TLFA具有显著的醛糖还原酶抑制活性[4]，本研究旨在此基础上，通过测定TLFA对SD大鼠RMECs迁移和VEGF蛋白表达的影响进一步探讨TLFA治疗DR的理论依据。
1.资料与方法
1.1 一般资料
仪器1-15K型多功能酶标仪（美国Sigma公司）；Stratagene MX3005p型荧光定量PCR仪（美国Agilent公司）；CX23型倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）。
药物与试剂牛蒡子总木脂素（自制，制备方法见参考文献[5]）；培养试剂：RPMI-1640，胎牛血清,PBS购自美国Lifetechnologies公司。RNA提取试剂盒购自Ambion公司;逆转录试剂盒和qPCR试剂盒购自Invitrogen公司。
动物SD大鼠5只，雄性，体重250～300g，清洁级，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
1.2 方法
1.2.1细胞迁移划痕修复实验 参考文献方法[6]，无菌取下大鼠视网膜神经层，收集RMECs细胞，于37℃、5%CO2培养箱中培养。实验分为空白对照组(T0)和高(T20)、中(T10)、低(T5)三个剂量组(各组培养基中TLFA的浓度分别为20，10和5mg/L)。每组重复3个，将大鼠RMECs细胞以3×105/孔的密度接种于培养板，以RPMI 1640培养液（含10%胎牛血清）培养。待细胞达到90%生长密度后，改用RPMI 1640（无血清）培养液饥饿培养，24小时后用200μL无菌Tip头在细胞培养孔中对细胞作一个长条形约0.8mm宽度的划痕,划除的细胞用无血清培养液冲洗干净。按实验分组加入相应的试剂后，置于5%CO2、37℃的恒温箱中继续培养。0,24,48小时后于倒置显微镜下拍摄10×10倍的照片记录。
1.2.2 RT-PCR检测VEGF表达 在对数生长期取大鼠RMECs细胞，用1640培养基（含10%胎牛血清）制备2×104/mL的细胞悬液，以1mL/孔的量接种于6孔培养板，于恒温培养箱（37℃、5%CO2）中培养24小时后换液，每组设6个平行孔，按前述分组分别培养24、48、72小时后取样检测VEGF表达量。参照试剂盒说明书提取RMECs总RNA,按照cDNA逆转录试剂盒的说明书，进行逆转录反应。终止反应后，在PCR反应板中加入qPCR Super Mix Universal 10μL，c-DNA模板0.5μL，ddH2O 11μL，VEGF(上游5'－TCG GGC CTC CGA AAC CAT GA－3'，下游5'－CCT GGT GAG AGA TCT GGT TC－3')和GAPDH(上游5'－GGA AAG CTG TGG CGT GAT GG－3'，下游5'－TAT CCT TGC TGG GCT GGG TG－3')引物各0.5μL，PCR的反应体系为25μL。PCR反应条件:50℃，2分钟，95℃，10分钟，40cycles；95℃，15sec，60℃，60sec。按照仪器使用说明进行qRT-PCR实验，收集数据，分析结果。
统计学方法数据用x-±s表示,t检验进行两组间数据比较。
2.结果
2.1 细胞迁移划痕修复实验
如图所示。当TLFA的浓度为5mg/L时，对RMECs的迁移抑制作用不明显；当TLFA的浓度分别为10，20mg/L时，在24和48小时两个时间点均观察到它们对RMECs的迁移具有显著的抑制作用，且20mg/L组的抑制作用强于10mg/L组。
2.2 对RMECs VEGF mRNA表达的影响实验结果见表，经培养24,48,72小时后，（1）T0和T5组内皮细胞VEGF mRNA的表达平缓上升，各时间点两组数据之间无显著性差异；（2）T10组内皮细胞VEGF mRNA的表达虽渐次略有上升，但其表达量均明显比T0组的低，且2组数据之间具有显著性差异；（3）T20组内皮细胞VEGF mRNA的表达未现增长趋势，在72小时时还略有下降。其表达量均明显比T0组各时间点的低，且2组数据之间的差异更加显著。表明TLFA对微血管内皮细胞的抑制作用呈浓度依赖性，该结果也与细胞划痕修复实验结果相符。
3.讨论
前期研究发现糖尿病视网膜病变与新生血管形成过程和生长因子过度表达密切相关，视网膜新生血管形成和血-视网膜屏障的破坏在DR的发生发展中起着关键作用，而VEGF已经被认为是引起血-视网膜屏障破坏的主要原因[7],其它一些血管渗透性因子通过VEGF间接起作用。因此阻断VEGF及其受体从而达到治疗目的，已成为治疗DR的主要思路之一。
本研究细胞划痕修复实验结果表明：各浓度TLFA对RMECs的迁移具有不同程度的抑制作用，且抑制作用的强弱呈剂量依赖性。为了进一步探讨TLFA对RMECs迁移抑制作用的机制，本研究对不同浓度TLFA作用下的RMECs采用荧光定量RT－PCR方法检测了VEGF mRNA的表达。结果发现TLFA能够下调VEGF mRNA的表达，且随着TLFA浓度的增加和作用时间的延长，其抑制作用也相应增强。说明TLFA对RMECs中VEGF mRNA表达的抑制作用呈浓度－时间依赖性，抑制VEGF mRNA表达可能是其抑制RMECs迁移的一个重要机制，它可能通过抑制VEGF的表达而抑制视网膜新生血管的形成,从而对DR产生治疗作用。
本研究结果表明，除了醛糖还原酶抑制活性之外，TLFA还可以抑制视网膜RMECs中VEGF mRNA表达，从而抑制视网膜新生血管的形成。上述两种作用机制为其对DR的治疗前景提供了理论依据。
【参考文献】
[1]Shin ES,Sorenson CM,Sheibani N.Diabetes and retinal vascular dysfunction[J].J Ophthalmic Vis Res,2014,9(3):362-373.
[2]Cai X,McGinnis JF.Diabetic Retinopathy:Animal Models,Therapies,and Perspectives[J].J Diabetes Res,2016:ID 3789217,9 pages.
[3]徐朝晖，赵爱华，高先富，等.牛蒡子降血糖化学成分的研究[J].中国天然药物，2006，4(6):444.
[4]Zhaohui Xu,Xiaoyan Wang,Mingmei Zhou,et al.The anti-diabetic activity of total lignan from Fructus Arctii against alloxan-induced diabetes in mice and rats[J],Phytotherapy Research,2008,22,97-101.
[5]Zhaohui Xu,Jiaxing Ju,Kai Wang,et al.Evaluation of hypoglycemic activity of total lignans from Fructus Arctii in the spontaneously diabetic Goto-Kakizaki rats[J],Journal of Ethnopharmacology,2014,(151):548-555.
[6]蒋瑶祁,彭辉灿,肖启国,等.苦参碱对大鼠RMECs的增生及VEGF表达的影响[J].眼科研究,2008,26(1):48-52.
论文作者:张华婷,高莹莹,徐朝晖
论文发表刊物:《医药前沿》2018年4月第11期
论文发表时间:2018/4/11
标签：抑制论文; 视网膜论文; 细胞论文; 内皮论文; 作用论文; 浓度论文; 牛蒡论文; 《医药前沿》2018年4月第11期论文;