摘要：目的：建立检查盐酸赖氨酸中细菌内毒素的方法，确保盐酸赖氨酸细菌内毒素分析方法的专属性、灵敏度在本实验室条件下的适用性。方法：按《中国药典》2015年版通则1143的规定，用2个不同厂家的鲎试剂对盐酸赖氨酸分别进行检查。结果：盐酸赖氨酸在浓度为0.025g/ml时对细菌内毒素试验不干扰，其细菌内毒素限值为10EU/g。结论：盐酸赖氨酸可用细菌内毒素检查法进行细菌内毒素的检查，该方法简便快速，检查结果准确可靠。
关键词：盐酸赖氨酸、细菌内毒素、鲎试剂、干扰试验
盐酸赖氨酸是我公司专利产品盐酸赖氨酸注射液的原料药。根据《中国药典》规定，作为注射液用的原料药需要进行内毒素含量的控制。本文按照《中国药典》2015年版四部通则1143细菌内毒素检查法的要求，研究探讨盐酸赖氨酸细菌内毒素检查法的适用性，建立细菌内毒素检查法，进行日常检测，确保药品的质量及临床用药安全性。
1、仪器：恒温电热鼓风干燥箱、电热恒温水箱、旋涡混合器、电子天平
2、试剂与样品
2.1 试剂：
（1）生产厂家湛江安度斯生物有限公司
鲎试剂：批号为1611281灵敏度为0.25EU/ml；细菌内毒素工作标准品：批号为1609090效价为10EU/支；细菌内毒素检查用水批号为1609260规格为5ml/支。
（2）生产厂家湛江博康海洋生物有限公司
鲎试剂：批号为1607280灵敏度为0.25EU/ml；细菌内毒素工作标准品：批号为1607302效价为10EU/支；细菌内毒素检查用水批号为1612290规格为5ml/支。
2.2 样品
盐酸赖氨酸批号为17010102、17010201、17010301生产厂家广西南宁邕江药业有限公司
3、实验准备
将玻璃试验用品放入铬酸洗液充分浸泡后，放置入烤箱。将烤箱调至250℃，待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至少1小时除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素。
4、方法与结果
4.1 鲎试剂灵敏度复核
（1）细菌内毒素标准溶液的制备:取细菌内毒素工作标准品一支（10EU/ml），加入细菌内毒素检查用水1.0ml，置旋涡混合器上混合5分钟，得到浓度为10EU/ml的内毒素溶液。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液（2λ、λ、0.5λ、0.25λ。λ为所复核的鲎试对的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。
（2）加样：取鲎试剂18支，开启后插入试管浮板的圆孔内，每支加入0.1ml细菌内素检查用水溶解，其中16支分别加入0.1ml4个浓度（2λ、λ、0.5λ、0.25λ）内毒素标准溶液；每一个浓度平行做4支；另2支加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，垂直放入37℃±1℃恒温水浴箱中，保温60±2分钟。取出观察并记录结果。
（3）结果判断:将插有鲎试剂的浮板，取出，缓缓倒转1800管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记为（－）
（4）实验数据处理：按照标准规定，内毒素最大浓度2λ，4管应均为阳性，最小浓度0.25λ，4管应均为阴性，试验有效，可按下列公式计算鲎试剂灵敏度的复核值；λc=lg-1(∑X/4)
（a）待复核鲎试剂批号为1611281灵敏度为0.25EU/ml
终点浓度（EU/ml）0.125、0.25、0.25、0.25
λc=lg-1(∑X/4)=0.177（EU/ml）
（b）待复核鲎试剂批号为1607280灵敏度为0.25EU/ml
终点浓度（EU/ml）0.25、0.25、0.25、0.125
λc=lg-1(∑X/4)=0.210（EU/ml）
结论：2批不同厂家的鲎试剂的λc值均在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）内，说明这两批鲎试剂复核结果符合规定。可用于试验，按标示值λ=0.25EU/ml使用。
4.2 干扰实验
4.2.1 预试验：初步确定供试品的最大不干扰浓度，为正式干扰实验提供依据。将盐酸赖氨酸制成一系列浓度，用来自2个厂家的鲎试剂对每一浓度进行检验，每一浓度下做2支供试品管和2支供试品阳性对照。根据药典规定，供试品MVD=λ/L，其中λ为鲎试剂标示灵敏度，L为细菌内毒素限值（盐酸赖氨酸，L为10EU/g），按市面所售鲎试剂的灵敏度有0.25、0.125、0.06、0.03EU•ml-1，确定样品浓度为0.025g/ml、0.0125g/ml、0.006g/ml、0.003g/ml，取一批盐酸赖氨酸，批号：17010102，进行预试验。
（1）将供试品用细菌内毒素检查用水制成系列浓度（g/ml）0.025、0.0125、0.006、0.003。制备E（内毒素标准）系列，方法与鲎试剂灵敏度复核相同，得到一个系列的2λ、λ、0.5λ、0.25λ浓度溶液。
（2）加样：取鲎试剂20支，样品每个浓度做4支鲎试剂，其中2支分别加01ml细菌内毒素检查用水和0.1ml各浓度的供试品，计为NPC管；另外2支分别加0.1ml各浓度的供试品和0.1ml内毒素标准溶液2.0λ（E0.5），计为PPC管；另取4支鲎试剂，其中2支加0.2ml细菌内毒素检查用水，记为NC管；另外2支分别加0.1ml细菌内毒素检查用水和0.1ml内毒素标准溶液2.0λ（E0.5），计为PC管。
（3）试验结果：NPC管均为阴性（-）、PC管均为阳性（+）、NC管均为阴性（-），实验有效；浓度0.025g/ml、0.0125g/ml、0.006g/ml、0.003g/ml管均为阴性（—），根据实验数据，初步确定本样品最大不干扰浓度为0.025g/ml。
4.2.2干扰试验：目的是检验在已确定的最大不干扰浓度下，盐酸赖氨酸对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用，是否合适做细菌内毒素检查。取三批盐酸赖氨酸，批号分别为17010102、17010201、17010301，用两个不同厂家的鲎试剂、标准品进行实验。
（1）称取盐酸赖氨酸0.1g，加细菌内毒素检查用水4ml,制成浓度为0.025g/ml的溶液。制备E系列（内毒素标准溶液），方法同鲎试剂灵敏度复核。用三批浓度为0.025g/ml的供试液，将同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度(2λ、λ、0.5λ、0.25λ)的含内毒素的供试品溶液（Eλ）。
（d）加样：取鲎试剂18支,同鲎试剂灵敏度复核操作。再另取18支鲎试剂插入浮板中，其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的含2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的供试品溶液，另一列2支加入0.1ml供试品溶液作为样品阴性对照。加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，垂直放入37±1℃恒温水浴箱中，保温60±2分钟后取出观察并记录结果。
（c）结果判断：最大浓度2λ4管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照4管均为阴性，实验有效，按下列公式计算分别计算内毒素标准溶液的反应终点浓度几何平均值（Es）和含供试品的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）Es=log-1(∑Xs/4)；Et=olg-1(∑Xt/4)
鲎试剂批号：1611281
（1）标准对照反应终点浓度（EU/ml）为0.25、0.25、0.25、0.25
Es=log-1(∑Xs/4)=0.25EU/ml
（2）含供试品的内毒素溶液反应终点浓度（EU/ml）
批号170102浓度（EU/ml）为0.125、0.125、0.25、0.25
Et1=olg-1(∑Xt/4)=0.177EU/ml
批号170201浓度（EU/ml）为0.25、0.25、0.25、0.25
Et2=olg-1(∑Xt/4)=0.25EU/ml
批号170301浓度（EU/ml）为0.125、0.25、0.25、0.25
Et3=olg-1(∑Xt/4)=0.210EU/ml
2、鲎试剂批号1607280
（1）标准对照反应终点浓度（EU/ml）为0.25、0.25、0.25、0.25
Es=log-1(∑Xs/4)=0.25EU/ml
（2）含供试品的内毒素溶液反应终点浓度（EU/ml）
批号170102浓度（EU/ml）为0.25、0.125、0.25、0.25
Et1=olg-1(∑Xt/4)=0.210EU/ml
批号170201浓度（EU/ml）为0.25、0.25、0.25、0.25
Et2=olg-1(∑Xt/4)=0.25EU/ml
批号170301浓度（EU/ml）为0.25、0.25、0.25、0.125
Et3=olg-1(∑Xt/4)=0.210EU/ml
结论：根据上述实验数据，用两个厂家的鲎试剂进行实验，Es均在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）范围内，三个批次供试品的Et也均在0.5Es～2.0Es（包括0.5Es和2.0Es）范围内，说明该供试品在此浓度下（0.025g/ml）对不同厂家的鲎试剂与内毒素的反应均无干扰作用，在低于或等于此浓度下（0.025g/ml）可使用细菌内毒素检查法，符合《中国药典》2015年版通则1143的规定。
5、供试品细菌内毒素检查
用2个不同厂家灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂对3批产品进行细菌内毒素检查
（1）试剂（a）生产厂家湛江安度斯生物有限公司
鲎试剂：批号为1610171灵敏度为0.25EU/ml；细菌内毒素工作标准品：批号为1609090效价为10EU/支；细菌内毒素检查用水：批号为1609260规格为5ml/支
（b）生产厂家湛江博康海洋生物有限公司
鲎试剂：批号为1607280灵敏度为0.25EU/ml；细菌内毒素工作标准品：批号为1607302效价为10EU/支；细菌内毒素检查用水：批号为1612290规格为5ml/支
(2)实验操作
将供试品制成0.025g/ml的溶液。NPC管：取2支鲎试剂各加0.1ml细菌内毒素检查用水和0.1ml供试品溶液，PC管：取2支鲎试剂各加0.1ml细菌内毒素检查用水和0.1ml工作标准品溶液，PPC管：取2支鲎试剂各加0.1ml供试品溶液和0.1ml工作标准溶液，NC管：取2支鲎试剂各加0.2ml细菌内毒素检查用水。
加样结束后，轻轻混匀，用封口膜封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温水浴箱中，保温60±2分钟。避免受到振动造成假阴性结果。
判断标准：当PC管为阳性（+），PPC管为阳性（+），NC管为阴性（-）时，若供试品管PPC管为阴性（-）表明供试品中的内毒素含量小于规定的限值，判为符合规定；若供试品管为阳性（+）表明供试品中的内毒素含量大于规定的限值，判为不符合规定。结果见下表
盐酸赖氨酸细菌内毒素检查结果
采用上述验证实验所确定的方法对三批产品进行细菌内毒素检查，结果细菌内毒素含量均小于10EU/g，符合规定。
6、结论
6.1细菌内毒素检查法是利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法，作为替代热原检查法的一种检测方法用于药品质量的控制。盐酸赖氨酸作为公司注射液产品的原料药，根据《中国药典》2015年版的规定，其质量标准需要进行细菌内毒素含量的控制。
6.2根据干扰预实验确定的浓度，进行干扰试验，实验数据表明，在此浓度下（0.025g/ml）已消除干扰，使用细菌内毒素检查法可行，结果稳定可靠，从而建立盐酸赖氨酸的细菌内毒素检查法，进行日常的质量监控检测。
参考文献：
[1]国家药典委员会，《中国药典》2015年版，2015年.
[2]中国药品生物鉴定所，《中国药品检验标准操作规范》（2010年版）北京：中国医药科技出版社，2010.
[3]中国药典委员会，《中国药典分析检测技术指南》北京：中国医药科技出版社，2017.6.
论文作者:宁航忠
论文发表刊物:《基层建设》2018年第22期
论文发表时间:2018/9/12
标签：内毒素论文; 细菌论文; 浓度论文; 试剂论文; 批号论文; 赖氨酸论文; 溶液论文; 《基层建设》2018年第22期论文;