张小卿[1]2013年在《针刺对皮肤光老化大鼠p38MAPK和NF-κB信号传导通路影响的实验研究》文中进行了进一步梳理目的：本项研究通过体内实验，旨在探讨模拟日光中UV照射所致皮肤光老化大鼠细胞凋亡和凋亡相关调控基因的表达情况，以及p38MAPK和核转录因子kappaB（NF-κB）信号传导通路在光老化发生机制中的作用；并研究针刺疗法在皮肤光老化的干预过程中的作用机制，以期发掘出对光老化有明确防治作用的针刺疗法。材料与方法：本研究采用UVA+UVB光源（40W紫外线灯管：UVB灯管5根，UVA灯管2根）照射大鼠背部皮肤制备大鼠皮肤光老化模型。每只大鼠均用电推剪剪除大鼠背部5.0cm×5.0cm区域内毛发，放置于自制紫外线灯箱中。适应环境饲养一周后，第2周开始每天照射2h，第3-7周每天照射4h，第8-13周每天照射6h，照射以5天为一个周期，间隔2天，再开始下一个周期，直至造模成功。采用针刺为实验因素，维生素E为阳性对照药，以皮肤组织中氧自由基含量、抗氧化酶类活力、细胞凋亡情况、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）表达及p38MAPK、NF-κB信号传导通路中相关基因和蛋白表达为效应指标进行体内实验。实验大鼠随机分为正常组、模型空白组、针刺组、维生素E组（简称VE组），各组于造模前分别进行针刺和外涂相应药物后进行紫外线照射；13周后处死动物，取背部皮肤组织检测以下指标：比色法检测丙二醛（MDA）、过氧化氢（H_2O_2）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力；免疫组化法检测Bcl-2和Bax蛋白表达及凋亡阳性细胞数目；RT-PCR法检测c-Jun、c-Fos、p38MAPK、NF-κB、MMP-1mRNA表达；Western Blot法检测蛋白c-Jun、c-Fos、p38MAPK、NF-κB、MMP-1蛋白表达。结果：1.大鼠体征表现：正常组大鼠实验全程皮肤无明显改变，皮毛有光泽，活泼喜动，食欲佳，食量正常。模型空白组大鼠13周实验结束时皮毛光泽度下降，皮肤增厚，弹性丧失，出现宽而深的皱纹。针刺组和VE组上述表现均有不同程度的改善，其中针刺组效果更好。2.各组大鼠体重变化：实验第1周各组大鼠体重比较，无明显差异（P＞0.05）。在实验进行至第13周末时，各组大鼠体重比较具有明显差异。与正常组比较，各组大鼠体重均明显下降，其中以模型空白组下降最为明显（P＜0.01）；与模型空白组比较，各治疗组体重均明显升高，具有显着差异（P＜0.01）。3.大鼠皮肤组织SOD活性：与正常组比较，模型空白组大鼠SOD活性明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)；与模型空白组比较，针刺组和VE组SOD活性均升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。4.大鼠皮肤组织MDA含量：与正常组比较，模型空白组大鼠MDA含量明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)，而针刺组无显着性差异（P＞0.05）；与模型空白组比较，针刺组和VE组MDA含量均降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。5.大鼠皮肤组织H_2O_2含量：与正常组比较，模型空白组大鼠H_2O_2含量显着升高，差异有统计学意义(P＜0.01)；与模型空白组比较，针刺组H_2O_2含量降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，而VE组无显着性差异（P＞0.05）。6.大鼠皮肤组织CAT活性：与正常组比较，模型空白组大鼠CAT活性明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，而针刺组无显着性差异（P＞0.05）；与模型空白组比较，针刺组CAT活性升高，差异有统计学意义(P＜0.01)，而VE组无显着性差异（P＞0.05）。7.大鼠皮肤组织GSH-Px活性：与正常组比较，模型空白组大鼠GSH-Px活性明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)；与模型空白组比较，针刺组和VE组GSH-Px活性均升高，差异有显着意义(P＜0.01)。8.大鼠皮肤组织免疫组化染色结果：（1）大鼠皮肤组织Bcl-2和Bax蛋白平均灰度值：与正常组比较，模型空白组大鼠Bcl-2蛋白表达的平均灰度值增加，表明蛋白含量减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型空白组比较，针刺组和VE组蛋白表达的平均灰度值减弱，表明蛋白含量增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；Bax蛋白表达呈相反趋势。（2）大鼠皮肤组织凋亡阳性细胞数：正常组皮肤组织凋亡细胞存在散在阳性表达，模型空白组呈弥散阳性表达，凋亡阳性细胞数与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；针刺组和VE组均呈散在阳性表达，凋亡阳性细胞数与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。9.RT-PCR结果：正常大鼠皮肤组织可检测到c-Jun、c-Fos mRNA、p38MAPK、NF-κB、MMP-1表达。（1）c-Jun mRNA表达：与正常组比较，模型空白组表达明显升高（P＜0.01）；与模型空白组比较，针刺组和VE组表达显着下调（P＜0.01）；针刺组和VE组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）c-Fos mRNA表达：与正常组比较，模型空白组表达明显升高（P＜0.01）；与模型空白组比较，针刺组和VE组表达显着下调（P＜0.01）；针刺组和VE组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。（3）p38MAPK、NF-κB、MMP-1mRNA表达：与正常组比较，模型空白组表达明显升高，（P＜0.01）；与模型空白组比较，针刺组和VE组表达均显着下调，差异有统计学意义（P＜0.01）。10.Western blot结果：正常大鼠皮肤组织可检测到c-Jun、c-Fos、p38MAPK、NF-κB和MMP-1蛋白表达。（1）c-Jun蛋白表达：与正常组比较，模型空白组表达明显升高（P＜0.01）；与模型空白组比较，针刺组和VE组表达显着下调，差异有统计学意义（P＜0.01）。（2）c-Fos蛋白表达：与正常组比较，模型空白组表达明显升高（P＜0.01）；与模型空白组比较，针刺组和VE组表达显着下调（P＜0.01）差异有统计学意义（P＜0.01）。（3）p38MAPK、NF-κB、MMP-1蛋白表达：与正常组比较，模型空白组表达明显升高（P＜0.01）；与模型空白组比较，针刺组和VE组表达显着下调（P＜0.01）；针刺组和VE组比较，针刺组NF-κB和MMP-1蛋白下调更为显着，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：1.针刺可用于防治大鼠皮肤光老化，能降低光老化大鼠皮肤组织氧自由基含量，提高抗氧化酶类活性。2.针刺可下调大鼠光老化皮肤组织促凋亡基因Bax蛋白表达、上调凋亡抑制基因Bcl-2蛋白的表达，从而减少皮肤细胞凋亡数目，这是实现针刺抗皮肤光老化的主要机制之一。3.UV照射活化了皮肤组织p38MAPK，激活了MAPK信号传导通路，进而导致MMP-1升高；同时，UV辐射形成的ROS，激活了下游NF-κB信号传导通路，也能上调靶基因MMP-1的表达，使细胞外基质成分降解，形成皮肤光老化。4.针刺对抗皮肤光老化途径之一是抑制皮肤组织p38MAPK和NF-κB表达，进而降低MMP-1生成，阻止其降解细胞外基质成分，起到抗皮肤光老化的作用。
王诗晗[2]2004年在《黄芪抗皮肤光老化的研究》文中认为目的：本项实验旨在研究黄芪提取液对紫外线照射引起的无毛小鼠皮肤光老化模型皮肤组织羟脯氨酸(HYP)含量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力，以及无毛小鼠真皮结构变化的影响。材料与方法：将昆明种无毛小鼠随机分成5组：正常对照组(A)、模型组(B)、模型+黄芪低剂量组(C)、模型+黄芪中剂量组(D)、模型+黄芪高剂量组(E)。模拟UV长期照射，造成皮肤光老化模型。给药组照射同时灌胃黄芪提取液。采用病理组织切片制片技术，HE染色，以40倍光镜观察真皮结构改变，并以生化分析方法测定SOD活性，HYP及MDA含量。结果：模型组无毛小鼠皮肤组织SOD活性明显降低，羟脯氨酸含量显着减少，MDA含量明显增加，(P＜0.05)病理切片呈现光老化状态。模型+黄芪高剂量组的皮肤羟脯氨酸及MDA含量与正常组无显着性差异。与模型组比较，模型+黄芪高剂量组对SOD活性有提高作用(P＜0.05)，模型+黄芪中剂量、模型+黄芪高剂量组可提高羟脯氨酸含量，降低MDA含量，并呈剂量依赖(分别是P＜0.05，P<0.01)。结论：黄芪提取液对紫外线照射引起的无毛小鼠皮肤光老化具有保护作用。其机制可能是一方面黄芪本身具有清除自由基的作用；另一方面黄芪可以通过提高SOD活力来达到抗氧化的目的，从而达到抗皮肤光老化的目的。
吴景东[3]2006年在《绞股蓝抗皮肤光老化的实验研究》文中认为目的：本项研究依据中医药基础理论，运用生化分析法及分子生物学方法，观察紫外线照射引起的无毛小鼠皮肤光老化模型皮肤组织中线粒体DNA片段缺失、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)的活性，丙二醛(MDA)、过氧化氢(H_2O_2)含量及其皮肤组织结构及羟脯氨酸(HYP)含量的变化以及中药绞股蓝的干预作用及作用机制。 材料与方法：将昆明种无毛小鼠随机分成8组：正常对照组(A)、模型对照组(B)、外用绞股蓝低剂量组(C)、外用绞股蓝中剂量组(D)、外用绞股蓝高剂量组(E)、灌胃绞股蓝低剂量组(F)、灌胃绞股蓝中剂量组(G)、灌胃绞股蓝高剂量组(H)。模拟日光中UV长期照射，造成皮肤光老化模型。照射同时，给药组外用或灌胃绞股蓝。HE染色，40倍光镜下观察皮肤组织结构改变，并以生化分析方法测定SOD、CAT、GSH-PX活性，MDA、H_2O_2、HYP含量；运用PCR法测定皮肤组织中mtDNA(3867bp)片段缺失情况。结果：模型组无毛小鼠皮肤组织SOD、GSH-PX、CAT活性明显降低，MDA、H_2O_2含量显着增加(P＜0.05)；HYP含量明显减少；组织病理切片呈现光老化状态。与模型组比较，外用及灌胃绞股蓝中剂量组CAT活性明显改善(P＜0.05)；灌胃绞股蓝低剂量组、外用绞股蓝中剂量以及二者的高剂量组均可提高GSH-PX活性，降低H_2O_2含量；所有给药组皮肤组织中MDA含量均有不同程度的下降，且均具有显着性差异；外用及灌胃绞股蓝低、中剂量组的皮肤组织中SOD活力增高且具有显着差异(分别是P＜0.01、P＜0.05)；外用绞股蓝低剂量组、外用及灌胃绞股蓝中、高剂量组的皮肤组织中HYP含量均有明显增高。PCR法检测结果显示，所有模型组小鼠皮肤组织中均存在mtDNA(3867bp)大片段缺失，而正常对照组以及给药组中中、高剂量组小鼠皮肤组织中mtDNA(3867bp)大片段缺失的发生率和缺失占总mtDNA的百分比均显着低于模型组。结论：利用紫外线照射成功模拟了皮肤光老化动物模型。紫外线造成的无毛小鼠光老化皮肤组织具有明显的氧化损伤，皮肤组织中mtDNA发生大片段缺失，中药绞股蓝可通过清除自由基，提高机体抗氧化能力，减轻无毛小鼠皮肤组织氧化损伤，减少其组织中mtDNA片段缺失的形成，维护mtDNA活性，防止其代谢能力下降，从而延缓或防治无毛小鼠皮肤光老化的作用。另外绞股蓝还可能是通过提高皮肤中羟脯氨酸的含量来延缓皮肤光老化动物模型皮肤衰老。
陈刚, 陈斌, 吕中明, 施伟庆, 冀琛[4]2010年在《黄芪甲苷乳膏对光老化小鼠皮肤组织MDA含量及SOD、GSH-px活力的影响》文中认为目的研究皮肤外用黄芪甲苷对紫外线照射引起的小鼠光老化皮肤的影响。方法BACB/C小鼠随机分成6组:正常对照组(A)、模型组(B)、模型+基质组(C)、模型+黄芪甲苷低剂量组(D)、模型+黄芪甲苷中剂量组(E)、模型+黄芪甲苷高剂量组(F)。模拟UV长期照射,造成皮肤光老化小鼠模型。给药组照射同时外用黄芪甲苷乳膏。用组织切片HE染色观察皮肤结构改变;以生化分析方法测定MDA含量及SOD、GSH-px活性;测定UVB最小红斑量,计算日光防护系数(SPF)值。结果模型组小鼠皮肤组织MDA含量明显增加,SOD、GSH-px活性明显降低(P<0.01),病理切片呈现光老化状态;与模型组比较,黄芪甲苷高剂量组可显着降低MDA含量,提高SOD、GSH-px活性,(P<0.01);随着外用黄芪甲苷乳膏时间延长,最小红斑量不断增高,90d时SPF=25。结论黄芪甲苷乳膏对紫外线照射引起的小鼠皮肤光老化具有保护作用。其机制可能一方面是黄芪甲苷本身具有清除自由基的作用;另一方面黄芪甲苷可以通过提高SOD、GSH-px活力来达到抗氧化的目的。
侯慧茹, 赵丽, 于凌[5]2004年在《皮肤光老化的机制及延缓皮肤衰老方法的研究》文中研究指明日光中的紫外线对皮肤的致老化作用是累积性的,如何减少紫外线照射,预防皮肤老化极为重要。近年来,在皮肤老化的治疗方面取得的进展包括外涂药维A酸、泛醌、α-羟基酸等。外科手术治疗直接切除老化的部位,软组织填充等。中医中药在清除自由基,修复胶原纤维以及调节机体免疫功能,改善微循环等方面做了很多尝试,并取得了一些成就,为延缓衰老的研究工作,打下了坚实的基础。
钱雯[6]2014年在《紫外线对人皮肤成纤维细胞E3连接酶Hrd1表达的影响及黄芪甲苷的干预作用》文中提出研究背景:皮肤是人体最大的器官,也是机体的一道天然保护屏障。皮肤长期暴露于外界环境,是紫外线照射后最易受损的器官。日光中的中波紫外线(UVB)和长波紫外线(UVA)辐射可引起皮肤的急性损伤(如日晒伤)和慢性累积性损伤(如皮肤光老化、皮肤癌),对人类健康构成潜在危害。UVB部分可达真皮浅层,UVA主要作用于真皮,其深度可达真皮中部,成纤维细胞是其作用的主要靶位。紫外线引起的皮肤过早衰老严重影响人类皮肤健康,探索如何延缓皮肤衰老也一直是国内外学者研究的热点。皮肤老化是一个复杂的生物学现象,包括两方面因素:一是内源性自然老化(主要为遗传因素引起);另一个是受环境因素影响(紫外线、烟尘、气候等)的外源性老化,其中紫外线(UV)的影响尤为主要,被更普遍地定义为光老化。光老化(photoaging)指皮肤衰老过程中紫外线损害的积累,是自然老化和紫外线辐射共同作用的结果。皮肤光老化在组织学上主要表现为胶原成分减少和弹性纤维变性沉积等皮肤基质构成的改变,从而产生皱纹和皮肤弹性减小的临床表现。内质网(endoplasmic reticulum,ER)是真核细胞中蛋白质翻译合成的场所,细胞在一些理化刺激或炎性状态下出现新生蛋白质未折迭或错误折迭现象,这些无功能蛋白质堆积,使内质网内环境失调,导致内质网功能紊乱,造成细胞凋亡,称之为内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降解蛋白1(HmgCoAreductase degradation 1,Hrd1)是内质网应激过程中E3连接酶的重要一员,它能通过内质网相关降解(ER Associated Degradation,ERAD)途径分解内质网内聚积的错误折迭或未折迭蛋白,保护细胞免于内质网应激,从而减少细胞凋亡,Hrd1作为ERAD途径中重要的连接酶E3的核心部分,它的表达变化将影响E3连接酶对错误蛋白的识别和逆转运能力。而紫外线辐射对皮肤细胞Hrd1表达的影响目前尚无文献报道。探索一种高效且安全性好,能够保护人体皮肤拮抗紫外线损伤的天然产品对人类皮肤健康具有重要意义。传统中药对皮肤的光保护作用已逐渐为人所知。黄芪甲苷(又名黄芪甲甙,Astragaloside,AST)为黄芪皂甙类单体成分,是从黄芪中分离而得到的一种皂甙类植物单体成分,是黄芪的主要有效成分,具有抗氧化损伤、清除自由基、抗炎、抗病毒、抗衰老、调节免疫功能等多方面的作用。数十年来,对黄芪甲苷的药代动力学、药理作用和机制的研究取得了很大进展,已被有效应用于心、脑、肝、血管疾病等许多疾病的治疗。大量研究表明,AST具有清除体内活性氧簇(ROS)和抗氧化应激的作用。近年来,一些研究还发现AST具有抗皮肤老化和抗紫外线的作用。但黄芪甲苷对皮肤成纤维细胞中E3连接酶Hrd1的影响亦尚无报道。因此,本实验以原代培养的人皮肤成纤维细胞为模型,在细胞水平探讨紫外线对人皮肤成纤维细胞E3连接酶Hrd1表达的影响及黄芪甲苷的干预作用。目的:通过UVA、UVB辐射联合黄芪甲苷处理人皮肤成纤维细胞,观察紫外线对人皮肤成纤维细胞中E3连接酶Hrd1表达的影响以及黄芪甲苷干预后Hrd1的表达变化。探讨E3连接酶Hrd1是否在紫外线所致皮肤光老化中起作用,以及黄芪甲苷是否通过调节Hrd1的表达起到抗光老化作用。方法:1.细胞培养:分离青年包皮环切术后皮肤成纤维细胞(FB),由江苏省人民医院泌尿外科提供。在37℃、5%CO2条件下培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基,根据实验目的分别接种在24孔、96孔板及直径10cm的培养皿中。选用4～8代处于对数生长期的细胞进行实验。2.紫外线照射:根据实验设计定时定量进行紫外线照射,选择总剂量为10 J/cm2 UVA或30mJ/cm2 UVB照射处理后,选择合适浓度的黄芪甲苷加入培养基至相应时间点。3.实验分组:A组(正常对照组);B组(单纯低剂量AST干预组);C组(单纯高剂量AST干预组);D组(UVA照射组);E组(UVA照射+低剂量AST组);F组(UVA照射+高剂量AST组);G组(UVB照射组);H组(UVB照射+低剂量AST组);Ⅰ组(UVB照射+高剂量AST组)。4.倒置显微镜:观察成纤维细胞形态的变化。5.MTT法:检测AST对人皮肤成纤维细胞增殖活性的影响,选取无药物毒性的AST溶液最佳低、高浓度。6.RealTime-PCR法:检测各组别成纤维细胞中Hrd1的mRNA表达。7.细胞免疫组化法:检测各组别成纤维细胞中Hrd1的蛋白表达。观察染色结果,并对图像进行半定量分析,比较每组图片平均光密度值。结果:1.不同浓度AST对FB增殖活性的影响在适宜浓度下,黄芪甲苷对体外培养的成纤维细胞有显着的促增殖作用,并呈剂量依赖性,药物浓度为10,20,30mg/L时促增殖作用明显(P<0.001),故确定10、30mg/L为最终实验所需低、高药物浓度。2.紫外线对FB Hrd1 mRNA表达的影响与正常对照组相比,UVA、UVB照射组成纤维细胞的Hrd1 mRNA表达量明显增高,提示紫外线照射(UVA或UVB)可上调人皮肤成纤维细胞中Hrd1mRNA 的表达(P<0.001)。3.AST干预对FB Hrd1mRNA表达的影响与正常对照组相比,单纯高剂量AST干预组中成纤维细胞Hrd1mRNA的表达明显下降(P<0.05),而单纯低剂量AST干预组中成纤维细胞Hrd1mRNA的差异则没有统计学意义(P>0.05);与单纯UVA或UVB照射组相比,紫外线照射后(UVA或UVB)AST干预组(低剂量或高剂量组)成纤维细胞的Hrd1mRNA表达量明显下降,提示黄芪甲苷可显着抑制UV辐射后成纤维细胞中Hrd1 mRNA的表达(P<0.001)。4.紫外线对FB Hrd1蛋白表达的影响Hrd1定位于胞浆,所有组别中的成纤维细胞均有不同强度的Hrd1表达。与正常对照组相比,UVA或UVB照射组中,成纤维细胞形态肥大且不规则,胞浆丰富,Hrd1染色变深,阳性表达率明显,呈强阳性。提示紫外线照射(UVA或UVB)可增加Hrd1的蛋白表达(P<0.05)。5.AST干预对FB Hrd1蛋白表达的影响与正常对照组相比,单纯AST干预组(低剂量或高剂量组)成纤维细胞中Hrd1蛋白表达的差异没有统计学意义(P>0.05);与单纯UVA或UVB照射组相比,紫外线照射后(UVA或UVB)AST干预组(低剂量或高剂量)成纤维细胞的Hrd1蛋白表达量明显下降,提示黄芪甲苷可显着抑制紫外线照射后成纤维细胞中Hrd1的蛋白表达(P<0.05)。结论:紫外线辐射可以上调人皮肤成纤维细胞中E3连接酶Hrd1的表达,而黄芪甲苷对这一现象具有逆转作用。
陈高敏, 王顺春, 王璐, 杜沛, 沈红艺[7]2016年在《中药植物多糖抗皮肤光老化的研究进展》文中指出紫外线引起的皮肤光老化不仅影响皮肤美观,而且与多种皮肤病息息相关。国内外研究肯定了中药多糖对皮肤光老化的防治作用。本文综述了皮肤光老化发生机制和中药植物多糖对皮肤光老化的防治研究进展。
陶冶[8]2013年在《绞股蓝总皂苷含药血清对光老化人皮肤角质细胞p38MAPK信号通路的影响》文中进行了进一步梳理皮肤老化主要包括时间性老化和光老化。时间性老化的皮肤随着时间的增长逐渐发生生理性改变，导致皮肤细微皱纹和皮肤易损。光老化是指由于日光紫外线辐射损害皮肤，导致皮肤提前发生老化改变。光老化皮肤的特征表现为深的皱纹形成、皮肤松弛、无光泽、粗糙和不规则黑色素沉着等。近些年来，人们对光老化造成的皮肤损伤及其防护措施日益关注，光老化形成机制成为研究热点。中医学理论认为，皮肤光老化发生的病因病机主要是由于机体禀赋不耐、肤腠不固、饮食不节，复感光毒侵袭，导致气血亏虚、痰瘀阻滞，日久“正虚邪实”，皮肤失养而表现出一派衰老枯萎之象。近年来，中药绞股蓝被诸多研究者所重视，列入了抗光老化药物的研究队伍。绞股蓝为葫芦科植物绞股蓝的根茎或全草,其性甘、微苦、寒，归脾、肺、心、肾经，具有益气健脾、清肺化痰和清热解毒的功效。我们在前期体内实验研究中已经证明绞股蓝具有抗皮肤光老化的作用。现代药理研究证明绞股蓝含有绞股蓝皂苷、绞股蓝糖苷（多糖）、水溶性氨基酸、黄酮类、多种维生素、微量元素、矿物质等，主要活性成分为绞股蓝总皂苷，具有降血压、降血脂、降血糖、抗衰老、抗疲劳、抗缺氧、抗高温、抗低温、延长生命、升高SOD活性和提高免疫等功效。紫外线中，长波紫外线UVA(320～400nm)和中波紫外线UVB(290～320nm)均可引起皮肤的光老化损伤，其中，皮肤角质细胞吸收大部分UVB辐射。目前，皮肤光老化的分子机制尚未被完全阐明，但已有研究表明，紫外线辐射皮肤角质细胞，通过促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，激活核因子κB (NF-κB)，同时诱导c-Jun表达上调，c-Jun与构成型表达的c-Fos结合成转录因子激活蛋白1（AP-1）。AP-1和NF-κB，均可激活基质金属蛋白酶（MMP）和细胞因子的表达，从而损害真皮细胞外基质（胶原组成部分）引发皮肤光老化损伤。此外，被激活后的转录因子NF-κB能够进一步刺激前炎症细胞因子等的表达，反过来这些细胞因子通过细胞表面因子受体活化AP-1和NF-κB，形成一个恶性循环，放大紫外线辐射效应。紫外线辐射诱导MAPK信号通路的激活在皮肤光老化病变过程中起重要作用，其中，p38MAPK信号通路与紫外线辐射诱导的细胞应激反应关系密切。目的：模拟日光与人体皮肤环境，以光老化人皮肤角质细胞p38MAPK信号通路改变为研究核心，利用免疫学与分子生物学技术，从体外阐明绞股蓝总皂苷抗皮肤光老化的作用机制，为后续研究绞股蓝总皂苷含药血清对光老化人皮肤成纤维细胞的影响及中医药防治皮肤光老化提供新的思路方法与科学理论依据。材料与方法：第一部分：常规饲养人永生化角质形成细胞株（HaCaT），绘制生长曲线；倒置显微镜下观察HaCaT细胞形态，采用免疫细胞化学法检测HaCaT细胞中角蛋白的表达，鉴定人皮肤角质细胞；采用绞股蓝总皂苷给予大鼠经口灌胃，制备不同浓度的绞股蓝总皂苷含药血清，MTT法检测绞股蓝总皂苷含药血清对HaCaT细胞的毒性作用；采用UVB303nm照射HaCaT细胞，MTT法检测照射后的细胞增殖活性，确定光老化人皮肤角质细胞模型的UVB照射剂量。第二部分：实验分组及干预方法如下：正常对照组（Ⅰ组），未经干预正常饲养的HaCaT细胞；UV模型组（Ⅱ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以新鲜培养液培养；空白血清组（Ⅲ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以空白大鼠血清干预；低剂量含药血清组（Ⅳ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以含低剂量绞股蓝总皂苷大鼠血清干预；中剂量含药血清组（Ⅴ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以含中剂量绞股蓝总皂苷大鼠血清干预；高剂量含药血清组（Ⅵ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以含高剂量绞股蓝总皂苷大鼠血清干预；p38MAPK抑制剂组（Ⅶ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以p38MAPK抑制剂SB203580（浓度为5μmol/L）干预。采用RT-PCR方法对各组细胞p38MAPK、MMP-1、c-Jun和c-Fos mRNA表达水平进行检测；采用Western blot方法对各组细胞p38MAPK、MMP-1、c-Jun和c-Fos蛋白表达水平进行检测。第叁部分：实验分组及干预方法如下：正常对照组（Ⅰ组），未经干预正常饲养的HaCaT细胞；UV模型组（Ⅱ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以新鲜培养液培养；空白血清组（Ⅲ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以空白大鼠血清干预；低剂量含药血清组（Ⅳ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以含低剂量绞股蓝总皂苷大鼠血清干预；中剂量含药血清组（Ⅴ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以含中剂量绞股蓝总皂苷大鼠血清干预；高剂量含药血清组（Ⅵ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以含高剂量绞股蓝总皂苷大鼠血清干预；p38MAPK抑制剂组（Ⅶ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以p38MAPK抑制剂SB203580（浓度为5μmol/L）干预。采用ELISA方法对各组细胞培养上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量进行检测；采用RT-PCR方法对各组细胞NF-κB mRNA表达水平进行检测；采用Western blot方法对各组细胞NF-κB蛋白表达水平进行检测。结果：第一部分：1. HaCaT细胞生长曲线显示：生长期为第14天，从第4天开始进入平台期。2.倒置显微镜下，HaCaT细胞贴壁生长，形态呈圆形、椭圆形，细胞间排列紧密，呈典型的铺路石样排列。3.细胞角蛋白在HaCaT细胞内稳定表达，HaCaT细胞抗角蛋白5染色阳性，胞浆内见棕褐色阳性颗粒；阴性对照未见阳性表达。4.绞股蓝总皂苷含药血清干预后HaCaT细胞增殖活性变化显示：随着绞股蓝总皂苷含药血清浓度的增高，各组细胞增殖活性无显着性差异（P＞0.05），绞股蓝总皂苷含药血清对HaCaT细胞无明显抑制或促进生长作用。5.随着UVB照射时间的加长即照射剂量的不断加大，倒置显微镜下，HaCaT细胞逐渐回缩、变圆、细胞间隙明显加大、细胞紊乱和漂浮细胞增多；UVB照射后HaCaT细胞增殖活性变化显示：随着UVB照射时间的加长即照射剂量的不断加大，各照射组细胞活性明显减弱（P＜0.05），在UVB照射第1分钟内变化最为明显，之后也有变化，但显着性下降，且逐渐趋于平缓。第二部分：1.各组细胞p38MAPK、c-Jun mRNA和蛋白表达水平检测结果显示：正常对照组细胞p38MAPK、c-Jun mRNA和蛋白表达水平较低，UV模型组二者的表达水平显着增高，与正常对照组比较有统计学意义（P＜0.01）；与UV模型组比较，p38MAPK抑制剂组、低、中、高剂量含药血清组细胞p38MAPK、c-Jun mRNA和蛋白表达水平显着下调，有统计学意义（P＜0.01）；与高剂量含药血清组比较，中、低剂量含药血清组细胞p38MAPK、c-Jun mRNA和蛋白表达处于相对高水平，有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。2.各组细胞MMP-1、c-Fos mRNA和蛋白表达水平检测结果显示：各组细胞MMP-1mRNA和蛋白表达水平极低，各组间无显着性差异（P＞0.05）；各组细胞c-Fos mRNA和蛋白表达水平均一，组间比较无显着性差异（P＞0.05）。第叁部分：1.各组细胞培养上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量检测结果显示：正常对照组细胞培养上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量较低，与正常对照组比较，UV模型组细胞培养上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著升高，有统计学意义（P＜0.01）；与UV模型组相比，p38MAPK抑制剂组、低、中、高剂量含药血清组细胞培养上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著下降，有统计学意义（P＜0.01）；与高剂量含药血清组比较，中、低剂量含药血清组细胞培养上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量处于相对高水平，有统计学意义（P＜0.01）。2.各组细胞NF-κB mRNA和蛋白表达水平检测结果显示：正常对照组细胞NF-κB mRNA和蛋白表达处于低水平，UV模型组细胞NF-κB mRNA和蛋白表达水平显着上调，与正常对照组比较有统计学意义（P＜0.01）；与UV模型组比较，p38MAPK抑制剂组、低、中、高剂量含药血清组细胞NF-κB mRNA和蛋白表达水平显着下调，有统计学意义（P＜0.01）。结论：1.绞股蓝总皂苷含药血清对HaCaT细胞无明毒性作用。2.采用UVB照射HaCaT细胞建立光老化人皮肤角质细胞模型，UVB照射剂量以35mJ/cm2较为合适。3. UVB照射可能是通过激活p38MAPK信号通路从而引发人皮肤角质细胞光老化损伤。4.绞股蓝总皂苷可用于防治皮肤光老化，其作用机制可能是绞股蓝总皂苷含药血清抑制p38MAPK信号通路对UVB照射引发的人皮肤角质细胞光老化损伤起到良好的光保护作用。
李春雨[9]2009年在《玉屏风散对老化皮肤免疫功能影响的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:通过探讨玉屏风散对老化皮肤免疫功能的影响及机理,为玉屏风散延缓皮肤老化和益气固表法的推广应用提供理论依据;为皮肤老化提供新的防治途径;为今后抗皮肤老化中药的开发提供理论依据。方法:建立大鼠光老化模型,用药组以不同剂量(黄芪、白术和防风比例分别为3/1/1、2/2/1和1/1/2)灌胃给予玉屏风散煎剂。测定皮肤HYP含量,分析玉屏风散对衰老大鼠胶原蛋白含量的影响;测定大鼠胸腺指数,分析对衰老大鼠免疫器官的影响;进行皮肤的HE染色,观察皮肤组织结构的变化;进行表皮LC及Ia抗原表达的免疫组织化学染色,观察表皮LC的变化。结果:玉屏风散的叁个剂量组均能不同程度增加光老化模型大鼠HYP含量,减少炎性细胞浸润、减轻血管扩张、抑制皮脂腺增生,使真皮乳头增高,胶原纤维呈恢复状态;能够不同程度提高大鼠胸腺指数;增加表皮LC数量和Ia抗原的表达,与模型组相比,玉屏风散各组表皮中LC数量均较多,排列较规则,树突状外观仍然存在。结论:组成比例不同的玉屏风散均能改善衰老大鼠的免疫功能,增强衰老大鼠对UV辐射的抵抗能力,从而发挥其延缓皮肤老化的作用。综合来看,黄芪、白术和防风比例为1/1/2组作用较弱,比例为3/1/1组和2/2/1组作用显着。
陈刚, 陈斌, 吕中明, 施伟庆, 冀琛[10]2010年在《黄芪甲苷乳膏对小鼠光老化皮肤的保护作用》文中研究表明目的探讨皮肤外用黄芪甲苷对紫外线(UV)照射引起的小鼠光老化皮肤的影响。方法 BALB/c小鼠84只,随机分成6组:模型组(A组)、模型+基质组(B组)、模型+黄芪甲苷低剂量组(C组)、模型+黄芪甲苷中剂量组(D组)、模型+黄芪甲苷高剂量组(E组)、正常对照组(F组),每组14只。模拟日光紫外线长期照射,形成皮肤光老化小鼠模型。C组、D组、E组照射同时外用黄芪甲苷乳膏。用组织切片HE染色、间苯二酚-碱性品红(Weigert)染色观察皮肤结构改变;以生化分析方法测定羟脯氨酸(HYP)含量。结果与F组比较,A组小鼠皮肤组织HYP含量明显降低(P<0.01),HE染色、Weigert染色病理切片呈现光老化状态;与A组比较,E组小鼠皮肤组织HYP含量升高明显(P<0.01),HE染色、Weigert染色病理切片显示抗光老化改变。结论黄芪甲苷乳膏对紫外线照射引起的小鼠皮肤光老化具有保护作用。
参考文献：
[1]. 针刺对皮肤光老化大鼠p38MAPK和NF-κB信号传导通路影响的实验研究[D]. 张小卿. 辽宁中医药大学. 2013
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[4]. 黄芪甲苷乳膏对光老化小鼠皮肤组织MDA含量及SOD、GSH-px活力的影响[J]. 陈刚, 陈斌, 吕中明, 施伟庆, 冀琛. 中国中西医结合皮肤性病学杂志. 2010
[5]. 皮肤光老化的机制及延缓皮肤衰老方法的研究[J]. 侯慧茹, 赵丽, 于凌. 中国临床康复. 2004
[6]. 紫外线对人皮肤成纤维细胞E3连接酶Hrd1表达的影响及黄芪甲苷的干预作用[D]. 钱雯. 南京医科大学. 2014
[7]. 中药植物多糖抗皮肤光老化的研究进展[J]. 陈高敏, 王顺春, 王璐, 杜沛, 沈红艺. 南京中医药大学学报. 2016
[8]. 绞股蓝总皂苷含药血清对光老化人皮肤角质细胞p38MAPK信号通路的影响[D]. 陶冶. 辽宁中医药大学. 2013
[9]. 玉屏风散对老化皮肤免疫功能影响的实验研究[D]. 李春雨. 黑龙江中医药大学. 2009
[10]. 黄芪甲苷乳膏对小鼠光老化皮肤的保护作用[J]. 陈刚, 陈斌, 吕中明, 施伟庆, 冀琛. 江苏医药. 2010
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