【摘 要】目的: 采用大鼠盲肠结扎穿孔 (CLP) 复制脓毒症模型造成急性肝损伤，探讨检测肝细胞凋亡在脓毒症肝损伤发病机制中的作用及丹参的干预影响。方法:将Wistar大鼠随机分为对照组(Control)、假手术组(Sham)、模型组(CLP)及丹参干预组(Salvia)，每组30只，每组又分6h、12h、24h和48h四个时间点。动态观察血清丙氨酸转氨酶(ALT)及肝肝细胞凋亡的变化。结果: 从血清ALT含量变化和肝脏细胞形态学检测确认CLP脓毒症模型造成了肝损伤。CLP组于6h肝细胞TUNEL阳性率增加，24h达到高峰，而Salvia组高峰滞后于CLP组，在48h达到高峰，并在24h低于CLP组(p < 0.01)。 结论: 脓毒症肝细胞凋亡与肝细胞坏死共存，但凋亡的发生早于坏死，随着脓毒症的进展，过度的肝细胞凋亡衰减，而肝细胞坏死进行性增加。丹参对脓毒症肝细胞损伤保护作用可能与抑制肝细胞过度凋亡有关。
【关键词】脓毒症 急性肝损伤 细胞凋亡 丹参
The role of hepatocellular apoptosis in septic liver injury and treated effects of salvia miltiorrhiza in rats
Qin Changchun Wu Xinmin.
Qinghai provincial people’s hospital, Xining, China
ABSTRACT Objectives To investigate the role of hepatocellular apoptosis and the treated effects of salvia miltiorrhiza in septic liver injury on the model of sepsis in rat induced by cecal ligation and puncture (CLP). Methods The male rats were assigned randomly to control group (Control), sham operated group (Sham), cecal ligation and puncture group (CLP) and salvia miltiorrhiza treated group (Salvia), and there were 30 rats in each group. Each group divided 5 time point, and six rats were allocated randomly for each time point. The changes of serum alanine transaminase (ALT) and hepatocellular apoptosis were observed consecutively. Results Septic liver injury was affirmed by the changes of serum ALT levels and hepatic morphocytology. Comparing with Sham group, The TUNEL-positive cell rate in CLP group increased at 6 hour and reached its peak at 24hour. The advance in TUNEL-positive cell rate in Salvia group lagged behind CLP group and reached peak at 48 hour, and the rate in Salvia group was significant lower than that in CLP group at 24 hour (p < 0.01). Conclusions Excessively hepatocellular apoptosis coexist with necrosis and the former occurs earlier than the latter. While excessive hepatocyte apoptosis decreases, necrosis increases with development of sepsis. The treated effects of Salvia miltiorrhiza for hepatocellular injury in sepsis may be through preventing excessive hepatocyte apoptosis.
Key words: Sepsis Acute liver injury Apoptosis Salvia miltiorrhiza
【中图分类号】R459.7 【文献标识码】A 【文章编号】2096-0867（2016）-12-005-03
脓毒症 (sepsis) 是由细菌、真菌、病毒、及寄生虫感染引起的全身炎性反应综合症[1]。脓毒症急性肝损伤可发生在脓毒症的任何阶段，肝功能不全是脓毒症发展为多脏器功能衰竭的标志之一[2,3]。但目前对脓毒症肝脏损伤的机制的研究多为体外研究或采用内毒素注射休克型模型[4-6]。为此，本课题采用盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture, CLP)复制大鼠脓毒症造成肝脏急性损伤，采用TUNEL技术检测肝细胞凋亡，动态监测发病期间动物肝细胞TUNEL阳性率的变化，探讨细胞凋亡在脓毒症肝损伤的作用机制以及丹参的干预影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物、试剂及实验仪器 雄性Wistar大鼠，体重180 ~ 240g，6 ~ 8周龄，兰州医学院提供。丹参注射液，正大青春宝药业有限公司出品，批号：0307022；TUNEL试剂盒，购自华美生物工程公司，批号：40304。7170S型全自动生化仪，日本HITACHI公司；
1.2 动物分组及处理因素
大鼠采用随机数字表法随机分为对照组 (control group, Control)、假手术组 (sham operated group, Sham) 、模型组 (cecal ligation and puncture group, CLP) 和丹参干预组 (salvia miltiorrhiza treated group, Salvia)四组，每组30只，每组又分3h、6h、12h、24h和48h 五个时间点，各时间点6只。Control组仅给3%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉，Sham组麻醉进腹后仅翻动盲肠。CLP组行盲肠结扎、穿刺，Salvia组行CLP后于关腹时腹腔注射丹参注射液10g/kg。所有大鼠均在相应时间点活杀，采腹主动脉血，留取血清。切除肝左外叶，二等分，用于组织匀浆制备和肝脏病理组织学检查。
1.3 CLP脓毒症模型的制作：参照Chaudry报告[7]的方法行盲肠结扎穿孔复制脓毒症模型。用3%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉，腹部正中切口入腹，于盲肠和升结肠交汇处结扎盲肠，20号针贯穿盲肠3次。术毕皮下注射复方乳酸钠溶液40mg/kg。
1.4 检测指标和方法
血清丙氨酸转氨酶 (ALT) 检测，采用全自动生化分析仪测定。肝脏病理组织学检查，标本经固定、切片、HE染色后，光镜下观察肝脏病理组织学改变。
原位细胞凋亡检测采用TUNEL法，按照试剂盒操作。结果判定：细胞核有棕色颗粒者(以DAB为底物时)为阳性细胞。细胞凋亡阳性率是光镜下观察5个高倍视野，分别计数TUNEL染色阳性细胞数总数和细胞总数，按下列公式计算：
1.5 统计方法
所得数据均用美国SPSS公司的统计软件SPSS for Windows10.0进行统计学处理。采用多因素方差分析进行多组间样本均数的比较，均数采用±s表示。采用多因素方差分析进行多组间样本均数的比较，频数的比较采用R×C表资料的X2检验。p < 0.05 为差异具有显著性。
2 结果
2.1 大鼠腹腔解剖所见
Control组和Sham组动物腹腔无明显炎症改变。CLP组动物腹腔炎症与时间呈依赖关系，在3h时间点炎症最轻，仅回盲部充血及部分小肠扩张，24h腹腔有少量~中量的脓性渗出液，盲肠及全部小肠高度扩张、水肿及充血；48h腹腔内有大量脓性渗出液或血性渗出液，并出现小肠节段性缺血性改变。Salvia组动物腹腔炎症也呈进行性加重，但肠管扩张充血程度轻于同时间点CLP组，24h周围组织粘连包裹回盲部，形成盲肠周围脓肿，但48h时腹腔病理改变类似于同时间点CLP组。
2.2 各组肝脏组织镜下所见
Control组肝脏光镜下见肝细胞轻度水肿，但各时间点未见明显差异。Sham组肝细胞水肿进行性增加，在24h达到高峰，48h水肿程度减轻。CLP组肝细胞水肿也进行性增加，48h达到高峰，并有肝索排列紊乱、肝窦挤压变窄等改变；该组24h偶见散在肝细胞点状坏死；48h肝细胞点坏死灶增加。Salvia组于3h可见肝细胞轻度水肿，水肿程度进行性增加，于48h达到高峰，但在24h肝细胞水肿程度轻于同时间点CLP组，48h也出现散在肝细胞点状坏死灶，但其病变严重程度仍低于同时间点CLP组。
2.3 血清ALT水平的变化
Control组血清ALT未见明显变化。与Control组相比，Sham组ALT在6h升高，12h达到高峰，其后水平回落，在48h与Control组无明显差异，说明手术对大鼠血清ALT有影响，该影响在48h消失。与Sham组相比，CLP组ALT在6h未见明显改变，于12h时间点开始迅速增高，在48h达到高峰。Salvia组血清ALT也在12h增高，但其增高程度小于CLP组，在48h达到其峰值，该组血清ALT水平在12、24和48h分别显著低于同时间点CLP组，见表1。
表 1 各组大鼠血清ALT的变化 (U/L)
注：* 与Control组相比， p<0.01；◆ 与Sham组相比， p<0.01
▼ 与Control组相比，p<0.01； ▽与Control组相比， p<0.01
△ 与Sham组相比， p<0.01； ▲ 与CLP组相比， p<0.01
2.1 各组大鼠肝细胞凋亡的变化
TUNEL法检测的凋亡肝细胞在肝组织中呈棕褐色，细胞核变小、浓缩，可见到核碎裂，偶见凋亡小体。Control组各时间点偶见凋亡的肝细胞。Sham组3h、6h时间点偶见散在肝细胞凋亡，12h肝细胞TUNEL阳性率较正常组有所增加，24h时间点达到其峰值。CLP组在6h阳性率增加，在24h达到高峰，48h阳性率减少。Salvia组在6h阳性率开始增高，但其峰值滞后于CLP组，于48h达到高峰，见图1。
图1 各组大鼠肝细胞TUNEL阳性率的变化
Fig.4-1 Changes of liver TUNEL-positive cell rates among four groups
CLP Vs Control * p<0.01, Salvia Vs CLP **p<0.01
3 讨论
既望脓毒症实验研究多采用注射模型[8]，其方法是采用大剂量细菌或毒素一过性打击而造成组织脏器的损伤，但却不能完全模拟临床脓毒症渐进性全身损伤的病理过程，并且从该模型获取的脓毒症治疗结果与临床研究不一致[9,10]。因此，本实验采用了与临床病理过程较一致的CLP脓毒症模型。本组结果显示CLP后肝脏进行性充血肿大，血清ALT进行性升高以及肝细胞形态学进行性恶化提示发生肝损伤，可确认大鼠CLP脓毒症模型造成了急性肝损伤。
TUNEL染色检测凋亡的原理[11]是依据细胞凋亡时，双链DNA会出现许多不对称的断裂点，形成的断裂缺口使3’端断端羟基(OH)暴露，末端转移酶可标记DNA缺口末端的3’-OH。利用末端转移酶 (TDT) 将标记的dUTP结合在DNA 3’末端游离羟基上，标记后的样品与相应的酶链抗体作用后，可催化底物产生颜色反应后在普通显微镜下观察。只要凋亡的细胞DNA中有一定量的断裂点形成，就可出现阳性反应，因此，该方法敏感性较高，并且有较好的定位作用。
资料表明，脓毒症时肝细胞发生凋亡，但资料主要来自于内毒素注射休克模型的研究[6,12-14]。在CLP多重细菌混合感染脓毒症模型模型上，Ayala 等[15]证明存在肝细胞凋亡，并且凋亡和坏死是共存的。本试验采用大鼠CLP模型，结果显示，脓毒症CLP组肝细胞于6h时间点凋亡率增多，于24h达到高峰，其后凋亡明显减少，HE染色发现，自24开始有肝细胞的坏死，因而脓毒症大鼠肝细胞凋亡的发生早于肝细胞坏死，在24肝细胞凋亡与肝细胞坏死共存。
当细菌和其毒素作用肝细胞时，初期启动与激活了组织自身的细胞凋亡机制，通过此方式清除受损的肝细胞。由于凋亡细胞的细胞膜仍保持完整，被巨噬细胞吞噬清除后不致引起炎症反应，因而可避免炎症扩大。但随着细菌和毒素作用时间延长，细胞凋亡大量发生，则势必损害器官组织的功能，并可激发组织炎症、坏死的病理机制。脓毒症细胞凋亡与细胞坏死机制的转换可能是由于过度的细胞凋亡造成了线粒体ATP的耗竭，凋亡启动信号不能激活Caspase-3而开始了细胞坏死的过程[16]。本研究显示，CLP组大鼠肝细胞凋亡在24h达到高峰，在48h时间点凋亡率迅速减少，而HE染色病理学检查提示48h肝细胞坏死增加，因此可认为大鼠在24h时间点肝细胞处于过度凋亡状态，其后由于肝细胞坏死，使肝功能遭到进一步的损害。
丹参(salvia miltiorrhiza)为唇形科鼠尾草属植物丹参(salvin miltiorrhiza bunge)的干燥根部，分为脂溶性和水溶性两大部分[17]。本实验结果显示，Salvia组血清ALT水平在12h、24h、48h三个时间点均显著低于同时间点的CLP组，同时，Salvia组肝脏组织病理学改变轻于CLP组，提示丹参对脓毒症肝损伤具有保护作用。本试验显示，Salvia组大鼠肝细胞TUNEL染色阳性率于24h显著低于CLP组，提示丹参在脓毒症可能通过抑制脓毒症肝细胞的过度凋亡而产生肝脏的保护作用。
研究脓毒症肝损伤的细胞凋亡有助于了解影响疾病发生发展的凋亡机制，从而寻找更好的治疗脓毒症方法，如采取抑制caspase-9和caspase-3的活性以及促使Bcl-2或Bcl-XL等抗调亡蛋白过度表达等抗调亡治疗等。但抗调亡治疗只是脓毒症的一种潜在治疗方案，临床应用仍面临许多技术困难。为避免或减少阻断细胞调亡所致细胞恶变的风险性，需寻找适宜的信号通路、特异性的细胞群和限定的阻断细胞凋亡时间[18]。通过对中药丹参药的研究，可望发现安全有效的抑制脓毒症过度细胞凋亡的药物。
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通讯地址：秦长春，青海省人民医院普外科（810001）
论文作者:秦长春,吴新民
论文发表刊物:《临床医学教育》2016年12月
论文发表时间:2017/3/15
标签：肝细胞论文; 凋亡论文; 丹参论文; 细胞论文; 时间论文; 盲肠论文; 损伤论文; 《临床医学教育》2016年12月论文;