吴劲风
广州市红十字会医院 广州市海珠区同福中路396号 510220
骨性关节炎（Osteoarthritis，OA）是关节软骨的退行性变，一种骨科常见的疾病，伴随着中国老龄化社会的进程加速，社会肥胖人口的增加，越来越多的人将罹患此病。OA 临床症状表现为早期的关节疼痛和晚期关节功能障碍，甚至关节的强直，是影响老年人生活质量的主要疾病之一[1]。我国的流行病学调查显示，OA 在 60 岁以上人群中的患病率高达 49%，随着我国人口逐步老龄化，OA 患病人数将越来越多，OA 已成为备受关注的医疗和社会问题。研究骨性关节炎发病机理，从中寻找可能的治疗靶点，延缓关节退变的发生，提高骨性关节炎的防治水平对国民经济和社会发展中有重要意义[1]。
关节软骨的退变是骨性关节炎形成的基础，关节软骨的退变是不可逆的过程，骨桥蛋白通过调节基质金属蛋白酶的表达及细胞外基质的降解参与骨性关节炎的退变过程，本实验首次研究外源性骨桥蛋白对软骨细胞中ERK5 信号通路的调控对软骨细胞细胞外基质Ⅱ型胶原、糖胺多糖、炎症因子TNF-α、IL-1β、基质金属蛋白酶及其抑制因子的影响。探索ERK5 信号通路在骨桥蛋白对软骨细胞功能影响的过程中的作用。本研究可望阐明ERK5 信号通路在骨桥蛋白刺激软骨细胞后细胞外基质及相关炎症因子改变的机制，为寻找潜在的治疗靶点、开发新药提供新的研究方向。
1.材料与方法：
人OA软骨细胞体外培养及软骨细胞的鉴定
收集膝关节置换软骨标本后，取手术中摘除的兔椎间盘组织，分离出髓核，吸取到0. 25%Ⅱ 型胶原酶液中，37℃ 消化15～20 min，200目不锈钢网过滤，悬液1 000 r·min-1离心8 min，混悬计数细胞，F12-DMEM加10%的胎牛血清培养。取两组原代及传代细胞，制备细胞爬片，收集样品并用4%多聚甲酫固定30 min，于双蒸水中洗涤三次，-20℃保存备用；免疫组化染色用SABC 法，并按照试剂盒说明书进行操作，以DAB显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶固封。
RT-PCR 检测方法
本检测快速灵敏，污染机率降低，适用于本试验样品检测，检测灵敏度高，可以在宽广范围内进行准确定量。采用TaqMan probe 技术，首先设计引物，利用热变性、引物和探针与模板退火、延伸反应原理，在基因水平检测Ⅱ型胶原、糖胺多糖、MMPs、TIMPs 的mRNA表达。
Western Blot 检测方法
蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方
法。对骨组织内进行蛋白质定量分析，检测ERK5 信号通路抑制剂PD98059 对软骨细胞ERK5信号通路的抑制情况。
2.结果：
加入外源性骨桥蛋白，可以促进软骨细胞ERK5基因表达，可以促进软骨细胞II型胶原及糖氨多糖mRNA表达，抑制炎症因子TNF-α、IL-1β、基质金属蛋白酶mRNA表达。
加入外源性骨桥蛋白，可以促进软骨细胞ERK5蛋白表达，可以促进软骨细胞II型胶原及糖氨多糖蛋白表达，抑制炎症因子TNF-α、IL-1β、基质金属蛋白酶表达。
外源性骨桥蛋白对软骨细胞中ERK5表达具有促进作用，通过促进ERK5的表达间接促进软骨细胞II型胶原及糖氨多糖的表达，降低炎症因子TNF-α、IL-1β、基质金属蛋白酶的表达，抑制软骨细胞外基质II型胶原及糖氨多糖的降解。
3.讨论
临床研究己经证实，OA 的关节软骨的破坏最主要的是其软骨细胞外基质（ECM）的合成与降解失衡所致；其中，基质金属蛋白酶（MMPs）对ECM 的降解起到了重要作用。TIMPs 作为内源性的抑制因子，能1：1 的和MMPs 结合并抑制其引起的基质降解。MMPs 和TIMPs 的动态平衡对于软骨ECM 的降解起着重要作用[2]。
骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是一种糖基化磷酸蛋白，存在于全身各种组织中，在初次膝关节置换的患者关节液及关节软骨终OPN 的含量与关节损害程度正相关，可能是有价值的OA 患者的一个生物学标记。Attur 等[3]研究发现在OA 患者关节软骨内高度表达，类似于内源性的抑制IL-1，NO，PGE2 的表达，这种多向性的炎症因子在调节软骨细胞平衡方面发挥着重要作用，与细胞外基质的其他蛋白一起和软骨细胞相互作用。Yamaga 等[4]在前交叉韧带断裂后引起的软骨的退变研究发现，前交叉韧带断裂1 月内，患者关节液中OPN 及其N 端片段和患膝的疼痛程度正相关，OPN 浓度和胫骨侧的关节软骨损伤正相关。
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ERK5 信号通路被发现在不同的软骨细胞中发挥着重要的调节软骨特有的基因表达的
作用，ERK5 信号通路引起的软骨形成的大小和方向由软骨细胞的类型和细胞分化过程中
ERK5 的改变[5]。Yan 等[6]在研究牛乳铁蛋白素对人关节软骨细胞影响的过程中发现，ERK5信号通路是激活TIMP-3 的表达的主要信号通路，抑制其激活后TIMP-3 的表达明显降低。Bobick 等[7]在研究成人骨髓来源的多能祖细胞像软骨分化的过程中，ERK5 的磷酸化高低平行于软骨形成。基因沉默ERK5 之后，软骨特有的基因标记表达水平下降Prasadam 等[8]研究发现骨性关节炎患者，其软骨下成骨细胞和关节软骨细胞的相互作用明显影响软骨和骨的特性并产生非正常水平的血小板反应蛋白和MMP，这个过程及其相互作用是通过MAPK-ERK5 信号通路调节的。
本研究表明通过外源性骨桥蛋白的表达，可通过ERK5途径抑制关节软骨退变。
参考文献：
[1]程亮，赵洪海，曾国庆，等. Akt 与ERK1/2 在人骨关节炎软骨细胞中的表达 [J]. 中国病理生理杂志，2012，v.28（05）：889-894.
[2]Smith GN，Jr. The role of collagenolytic matrix metalloproteinases in the loss of articularcartilage in osteoarthritis [J]. Frontiers in bioscience：a journal and virtual library，2006，11：3081-3095.
[3]Attur MG，Dave MN，Stuchin S，et al. Osteopontin：an intrinsic inhibitor of inflammationin cartilage [J]. Arthritis and rheumatism，2001，44（3）：578-584.
[4]Yamaga M，Tsuji K，Miyatake K，et al. Osteopontin level in synovial fluid is associated with the severity of joint pain and cartilage degradation after anterior cruciate ligamentrupture [J]. PloS one，2012，7（11）：e49014.
[5]Bobick BE，Kulyk WM. Regulation of cartilage formation and maturation bymitogen-activated protein kinase signaling [J]. Birth defects research Part C，Embryotoday：reviews，2008，84（2）：131-154.
[6]Yan D，Chen D，Hawse JR，et al. Bovine lactoferricin induces TIMP-3 via theERK1/2-Sp1 axis in human articular chondrocytes [J]. Gene，2013，517（1）：12-18.
[7]Bobick BE，Matsche AI，Chen FH，et al. The ERK5 and ERK1/2 signaling pathways playopposing regulatory roles during chondrogenesis of adult human bone marrow-derivedmultipotent progenitor cells [J]. Journal of cellular physiology，2010，224（1）：178-186.
[8]Prasadam I，Crawford R，Xiao Y. Aggravation of ADAMTS and matrix metalloproteinaseproduction and role of ERK1/2 pathway in the interaction of osteoarthritic subchondralbone osteoblasts and articular cartilage chondrocytes -- possible pathogenic role in
osteoarthritis [J]. The Journal of rheumatology，2012，39（3）：621-634.
注基金项目：该项目获得广州市医药卫生项目资助（20161A011014）
论文作者:吴劲风
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年7月20期
论文发表时间:2018/8/30
标签：软骨论文; 细胞论文; 基质论文; 蛋白论文; 关节论文; 因子论文; 抑制论文; 《中国误诊学杂志》2018年7月20期论文;