湖南省肿瘤医院药学部 湖南长沙 410006
【摘 要】目的：探讨苏铁叶的生药学鉴定与抗肿瘤活性部位的筛选。方法：通过性状鉴别、薄层色谱鉴别、原植物形态鉴别、显微鉴别四种方法鉴定苏铁叶的生药学特点；采用CCK-8法检测苏铁叶的乙酸乙酯部位、二氯甲烷部位与正丁醇部位在不同浓度状态下对人肺腺癌细胞A549增殖产生的影响。结果：苏铁叶各部位的浓度不同，对人肺腺癌细胞A549增殖所产生的抑制效果也不同。结论：苏铁叶的主要鉴别特点为生药鉴定提供了参考依据，苏铁叶的乙酸乙酯、正丁醇和二氯甲烷三个部位均能够抑制人肺腺癌细胞549的增殖，抑制效果首先和药物浓度呈正相关，而后呈负相关，本研究结论为后续的深入研究奠定了可靠的理论基础。
【关键词】苏铁叶；生药学鉴定；抗肿瘤活性部位；筛选
苏铁叶是一种苏铁科苏铁属植物苏铁GyeasrevotutaThunb的叶子，又被叫做铁树叶、辟火蕉、凤尾松、凤尾铁等。中药学书籍记载[1]：苏铁叶性平、味甘、涩，有小毒，能起到止血、清热、散瘀效果，适用于吐血、尿血、跌打肿痛、痢疾、月经量多、便血与胃痛的治疗。现代研究显示[2]：苏铁叶中含有新铁树素甲、新铁树素乙以及铁树素，能够抗癌，因此在药物和食品中的应用非常广泛。本研究对苏铁叶的生药学特征采用四种方法鉴别，并筛选出抗肿瘤活性部位，现将结果报告如下。
1仪器、试剂与材料
1.1仪器和试剂
①仪器：武汉俊杰电子有限公司生产的JB-L5冻台、JJ-12J脱水机、JB-P5包埋机；日本Olympus公司生产的Olympus BX41光学显微镜，日本尼康公司生产的NIKON DS-U3成像系统、NIKON ECLIPSE CI正置光学显微镜；上海徕卡仪器有限公司生产的RM2016病理切片机；浙江省金华市科迪仪器设备有限公司生产的KD-P组织摊片机；上海慧普仪器制造有限公司生产的DHG-9140A烤箱；江苏世泰实验器材有限公司生产的10212432C载玻片与盖玻片；武汉谷歌生物科技有限公司生产的G1031番红固绿染色试剂盒；日本岛津公司生产的LC-1010AHT高效液相色谱仪；国药集团化学试剂有限公司生产的中性树胶。
②试剂：北京拜尔迪生物技术公司生产的Cell Counting Kit-8（CCK-8）、DMEM/F12培养基与胰蛋白酶；碧云天生物技术研究所生产的Hoechst33258染色试剂盒；杭州四季青生物工程有限公司生产的胎牛血清（FBS）。对照品：甲醇是色谱纯，其它试剂均属于分析纯。
1.2材料
于河北保定安国药材市场购买苏铁叶药材与细胞株，产地：广西玉林；本课题组鉴定后，确认为苏铁GyeasrevotutaThunb的叶，在中央民族大学中国少数民族传统医学研究院少数民族药物基础研究所实验室存放标本；人肺腺癌细胞A549标本由上海匹拓生物科技有限公司生产。
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1.3方法
1.3.1生药学鉴定
①性状鉴别：叶大、叶轴为扁圆的柱形、一回羽状、叶柄基部双侧有刺，颜色是黄褐色。质地较硬，断面呈纤维性。羽片为线状的披针形，黄褐色或者黄色，长、宽分别为9~18cm、4~6mm；边缘朝背面反卷，背面有稀疏的褐色柔毛。质地脆，容易折断，背面较为平坦，气味较淡。
②薄层色谱鉴别：第一步：将苏铁叶磨制成粉末，取1g，加入到10mL80%的乙醇中，超声处理45min，过滤并蒸干滤液，在残渣中加入10mL水，使之溶解，使用10mL的三氯甲烷振摇，并提取2次。将合并三氯甲烷的溶液浓缩到1mL，当作供试品溶液。第二步：在橞花杉双黄铜中加入三氯甲烷，制作比例为0.5mg/1mL的对照品溶液。第三步：进行薄层色谱法实验，吸取对照品、供试品溶液各5μL，滴在同一硅胶GF254薄层板上，制作比例为乙烷（6）：乙酸乙酯（2.5）：甲醇（1）的展开剂，晾干后喷上3%的三氯化铝水溶液，105℃环境下加热，放置半小时。放置在365mm的紫外灯下仔细观察对照品、供试品的斑点，发现在对照品色谱位置上，供试品有着和对照品相同、Rf值同样相同的斑点，提示苏铁叶内含有橞花杉双黄铜，与相关研究结果一致[3]。
③原植物形态鉴别：常绿木本植物，茎干高度1~4m，粗壮但没有分枝；密被宿有叶痕、叶基，茎顶部生长出羽状叶，长度0.5~2.0m；基部双侧均有刺，长度2~3mm；羽片超过100对，条状，厚革质，长度9~18m，宽度4~6mm，先端尖锐，边缘明显朝下卷曲，基部狭窄，双侧不对称；下面为浅绿色，中脉明显隆起；上面为光泽的深绿色，中央微微凹陷。雌雄异株，雄球花为圆柱形，直径8~15cm，长度30~70cm；小孢子叶为长度3~7cm的楔形，有尖头，下面中肋和先端密生灰黄色或者褐色的长绒毛；大孢子叶的长度为14~22cm，扁平状，密生灰黄色或者淡黄色的绒毛，上部顶片呈宽卵形，边缘表现为羽状分裂，下端两侧有若干类似球形的胚珠。种子为微扁的卵圆形，顶部凹陷，长度2~4cm，直径1.5~3cm，成熟时表现为朱红色，花期6、7个月，10月份种子成熟。
④显微鉴别：按顺序把切片放置在二甲苯I、二甲苯II、无水乙醇I、无水乙醇II、95%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒精中蒸馏水洗，脱蜡至水，把切片放进1%的番红染液中，染色1~2h；自来水冲洗后，把切片分别放置在50%、70%、80%的无水乙醇I、无色乙醇II中，前者脱色半分钟，后者脱色1min[4]。最后一步，将切片放置在60°的烤箱中烤干，于二甲苯透明5min，使用中性树胶封片，镜检后采集图像。
1.2.2苏铁叶各部位的制作方法
在80%的乙醇中提取15kg的苏铁叶，共3次，比例8：1，每次提取时间1h。用等量的乙酸乙酯、二氯甲烷和正丁醇萃取3次，得到苏铁叶的相应部位。
1.2.3人肺腺癌细胞A549的培养
在3~4mL的PBS中清洗两次，加入0.25%的胰蛋白酶消化液1mL，37℃环境下消化2、3min，直至细胞突起回缩，胞体变圆为止，以1000r/min的速度离心分离细胞悬液，弃上清，以同样的速度离心分离PBS重悬细胞，弃上清；加入细胞液重悬细胞（含血清），采用台盼蓝拒染法细胞计数[5]，细胞浓度合适后，种板或者继续传代培养。
2结果
苏铁叶的乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇三个部位在不同浓度下对A549均具有体外抑制效果，药物浓度越高，抑制效果越明显，当浓度＞250μg/mL时，浓度越高，抑制作用反而越低。
3讨论
本文研究了苏铁叶乙酸乙酯、二氯甲烷和正丁醇三个部位的活性，结果显示三者均能抑制人肺腺癌细胞A549。后续研究中，笔者会进一步分离、钝化苏铁叶的粗提物，评价抗肿瘤活性。
参考文献：
[1]史红艳，朱海萍，杨培君等.苏铁叶黄酮类化合物的检测与提取工艺研究[J].中国现代中药，2015，17（2）：125-129，152.
[2]李娟，林建勇，何应会等.广西崇左叉叶苏铁种群结构与分布格局研究[J].广东农业科学，2016，43（12）：25-29.
[3]楚永兴.多歧苏铁和长柄叉叶苏铁杂交育种的初步研究[J].山东林业科技，2013，43（3）：13-15.
[4]史红艳，朱海萍，屈亚娟等.流动注射-化学发光法分析苏铁叶黄酮类化合物的研究[J].中药材，2015，38（3）：481-484.
[5]王运华，李楠，陈庭，邓焕祥.种间转移扩增筛选仙湖苏铁微卫星位点及其遗传多样性研究[J].广西植物，2014，34（05）：608-613.
论文作者:苏卫,贺双艳
论文发表刊物:《中国蒙医药》2018年第6期
论文发表时间:2018/8/17
标签：苏铁论文; 乙酸乙酯论文; 甲烷论文; 细胞论文; 部位论文; 浓度论文; 腺癌论文; 《中国蒙医药》2018年第6期论文;