（常州市第四人民医院骨科 江苏 常州 213003）
【摘要】 目的：探讨电刺激作用于失神经骨骼肌萎缩Fox03a表达变化。方法：选用54只Wistar大鼠建立右下肢腓肠肌失神经支配模型，随机分为空白对照组，去神经对照组和电刺激组。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western Bloting），分别检测失神经支配第2天、7天、14天和28天的腓肠肌中Fox03a不同时段的蛋白质表达水平。结果：去神经组与对照组比较，Fox03a表达持续增加，P<0.05。电刺激组与对照组对比，Fox03a的mRNA和蛋白表达水平均降低，P<0.05。去神经组和电刺激组对比，Fox03a的mRNA和蛋白持续增加，P<0.05，去神经组和电刺激组对比，mRNA和蛋白持续减少，P<0.05。结论：电刺激通过抑制Fox03a的表达，起到延缓失神经骨骼肌萎缩的作用。
【关键词】电刺激；肌萎缩；Fox03a，失神经
【中图分类号】R322.85 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）08-0230-02
周围神经损伤后，所支配的骨骼肌不可避免地发生萎缩，严重阻碍肢体的功能。骨骼肌萎缩，其本质是一个由复杂基因调控的主动过程。近年来的研究发现，Fox03a是肌蛋白降解的分子开关之一，是肌肉蛋白的合成、分解代谢和骨骼肌细胞凋亡的调控中心。本实验旨在对失神经支配后的腓肠肌中Fox03a表达的变化，为电刺激治疗失神经骨骼肌萎缩提供理论依据[1]。
1.材料和方法
1.1 实验动物
选用成年雄性WISTA大鼠体重180±10g，由山西医科大学生理实验室提供。
1.2 动物模型建立
54只随机分为对照组，去神经组和电刺激组。应用10%水合氯醛行腹腔内注射后暴露右侧坐骨神经，神经组和电刺激组大鼠在距梨状肌下孔0.5cm处切断坐骨神经约0.8～1.0cm，近端翻转180°与周围组织缝合，造成右下肢腓肠肌失神经支配模型；对照组进行假手术处理。对照组大鼠在术后0天，实验组大鼠分别在手术后2天、7天、14天和28天麻醉下分离切取双侧腓肠肌，标记后分别提取RNA和蛋白质,切断坐骨神经并保证坐骨神经之间缺损不少于10mm。电刺激组术后第2日给予电刺激。先将大鼠麻妥俯卧位固定，右小腿脱毛，将电极片固定于皮肤表面，刺激频率50Hz(连续波)，刺激电压25～35V,强度是以见到腓肠肌明显收缩为标准，每次刺激的时间是25分钟，每天一次。
1.3 RT-PCR
Fox03a多克隆抗体PCR引物。Fox03a上游引物：5’CTC AGC CAG TGG ACA GTG AA3’；下游引物：5’GCT CTG GAG TAG GGA TGC TG3’。用Trizol试剂提取不同时段总RNA。根据试剂盒将其反转录合成cDNA。PCR反应产物在2%的琼脂糖凝胶电泳上检测，凝胶成象仪成象。
1.4 Western Blot
处理、变性、用加样针取各组蛋白，进行SDS- PAGE凝胶电泳,将蛋白条带电转移至NC膜上,10%脱脂奶粉室温封闭2h,加入兔抗鼠Fox03a多抗室温反应24h,TBST洗膜4次,每次15min ,再加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗室温反应2h,TBST洗膜4次,每次15min。漂洗后用ECL化学发光法显色，压片、曝光、显影，测量密度扫描仪进行灰度扫描。
1.5 结果分析与统计学处理
使用ImageJ软件、对图像进行分析获取数据，统计分析采用SPSS13.0软件，对整理的数据进行统计描述和析因方差分析，进行组间分析比较，P<0.05时有统计学意义。
2.结果
2.1 失神经后腓肠肌细胞内Fox03amRNA的表达升高，且随着失神经时间的延长持续增加。失神经后Fox03a蛋白的变化水平较其mRNA的变化水平低，Fox03a蛋白的表达水平分别在术后治疗7天和14天后开始低于同期对照组，差异均具有统计学意义。(表1)。
（图1）去神经及电刺激组不同时段Fox03a蛋白表达情况。（A表示空白对照。）
3.讨论
很多疾病都能引起骨骼肌萎缩。Marco Sandri发现其中Fox03a是肌萎缩调控基因中的核心，去磷酸化的FOXO因子进入细胞核内引起了生长抑制及细胞凋亡进而引发肌萎缩的发生，而且它几乎在全部的肌萎缩类型都存在[2]。Foxo基因表达也紧密地调节其肌萎缩相关基因的表达，在二型糖尿病中，Foxo因子与胰岛素相拮抗进而加重肌萎缩的发生。
电刺激治疗是预防肌萎缩的一种有效方法[3]，本实验证实电刺激可以明显降低Fox03amRNA和蛋白质的表达，说明其防止骨骼肌萎缩的一个重要机制可能是降低Fox03amRNA和蛋白质的表达。为临床防治肌萎缩的机制及效果提供研究基础。
【参考文献】
[1]裴艳宏,刘坤祥. 失神经骨骼肌萎缩机制及治疗的研究进展[J]. 中国医疗前沿,2013,8（05）:15-17+2.
[2]王红兵,梁炳生,彭春辉,王鹏飞.川芎嗪对失神经骨骼肌萎缩大鼠FoXO3a、MAFbx以及MuRF1表达的影响[J].中国修复重建外科杂志,2012,26（05）:597-600.
[3] 张立宁，王兴林.电刺激对周围神经再生的影响，中国康复理论与实践，2006，12（7）：588-590.
本实验由常州市局级项目支助：联合NF-κB及FOXO3a基因治疗延缓失神经肌萎缩的研究.
论文作者:夏铭阳,陆佳俊,张磊
论文发表刊物:《医药前沿》2017年3月第8期
论文发表时间:2017/3/31
标签：腓肠肌论文; 肌萎缩论文; 蛋白论文; 骨骼论文; 对照组论文; 大鼠论文; 坐骨神经论文; 《医药前沿》2017年3月第8期论文;