mRNA分析在体液斑迹组织来源推断中的应用研究进展
赵一霞，胡 胜，叶 健，孙启凡*，季安全*
（公安部物证鉴定中心，现场物证溯源技术国家工程实验室，法医遗传学公安部重点实验室，北京100038）
摘 要: mRNA因其自身的不稳定性和易被降解的特性而一直被法医学研究所忽略。然而，终点逆转录PCR、实时荧光定量PCR、转录组分析等分子生物学技术的进步打破了这些关于mRNA的传统认知，为mRNA分析的法医学应用奠定了基础。目前，基于mRNA分析的体液斑迹组织来源的推断已有主流方法，就是构建复合检测体系检测不同体液中特异性mRNA分子的表达。2011年至今，欧洲DNA分型工作组（EDNAP）组织了6次联合试验，评估了mRNA分析在体液鉴定中的有效性和可重复性。本文主要概述mRNA分析技术在体液斑迹组织来源推断中的研究进展及应用。
关键词: 法庭科学；mRNA分析；体液斑迹；组织来源推断；复合检测
人体液斑迹是犯罪现场常见的生物检材，体液斑迹组织属性的准确判定能为犯罪现场重建和案件审判提供重要的参考信息，是法医物证研究的重要内容。
既往基于生物化学、血清学和免疫学等的传统组织或体液鉴定方法费时费力，单个实验对样品的需求量大，结果假阳性及假阴性率均偏高[1]，而来自犯罪现场的生物检材多为微量，故常难以满足检验鉴定的要求。虽然DNA的STR分型检测技术日益完善，可判定常见的生物检材如唾液、血液和精液等的个体来源，但因DNA的同一性，同一个体不同组织分泌的体液斑迹就无法区分。然而，在法医工作中，判定案件性质有时仅有个体识别是不够的，还需要确认犯罪现场体液斑迹的组织来源。
期中考试后，蒋海峰得了奖学金，请水仙芝吃饭，在学校外面的暖水阁，紫云作陪。火锅燃起，对坐一方小桌，心灵的距离，近在咫尺。他那鹰隼般的目光，静默在灯影里。
因此，基于mRNA分析进行体液斑迹组织来源的鉴定，就很有实用价值，其方法的主要优势在于高灵敏度和高特异性，可在一个复合反应中检测多种体液，并兼容目前的DNA提取、分析流程，从而节约实验成本。因对来自于犯罪现场的微量检材能提高鉴定结果的可靠性，其正成为解决体液斑迹组织来源判定的主要分子生物学手段。本文综述目前mRNA分析在法医学体液斑迹组织来源推断中的研究进展和应用，以期为相关研究提供参考。
1 mRNA在法医学中应用的生物学基础
1.1 mRNA是蛋白质生物合成的中间模板
mRNA携带有所表达蛋白质的氨基酸序列基因信息。一个成年人含有大约210种不同功能的细胞类型，而每种类型的细胞都有其各自特性，如大小、形状、代谢类型以及对信号的应答反应等。高度分化的细胞因其功能的特异性而会表达特定的mRNAs。不同体液含有多种类型的细胞，每一种细胞又有各自独特的基因表达谱，即所谓转录组[2]，对体液转录组做研究、寻找新的特异性标记分子，正是法医学工作者关注的热点。不同体液中特定的多细胞组合转录形成的特异性表达谱将能为体液斑迹组织来源鉴定提供理论参考和物质依据。
随着RNA提取、逆转录PCR (RT-PCR) [26]和cDNA扩增以及实时荧光定量PCR (qRT-PCR) [27]等重要分子技术方法的建立与应用，mRNA分析作为体液斑迹组织来源推断的方法逐渐成为研究热点。
1.2 mRNA在生物斑迹中具有良好的稳定性
3.改编。校本课程开发中的课程改编，主要是指教师对正式课程的目标和内容加以修改以适应具体的课堂情境。课程改编要着重考虑目的、内容选择、内容组织、学习经验和学习资料等五个方面，遵循遴选、二次创作、补充、拓展和创新等五个流程。
长期以来，mRNA因其自身的不稳定性、易降解而被法医学研究与应用所忽略。但研究发现RNA在干燥载体上具有较好的稳定性[3]，Zubakov等[4]研究表明在保存180 d的血液和唾液斑痕中能够检测到组织特异的mRNA分子标记。2003年Bauer等[5-6]证明利用RT-PCR方法可在保存15年的干燥血迹中检测到高水平的β-actin和cyclophilin A，并由此提出假设——利用转录本恒定的降解速率推断血液斑痕的形成时间。
2012年，美国研发出Total ScriptTM RNA-Seq试剂盒，5 ng的总RNA样品（含有rRNA）即可完成全转录组测序，且不需要片段化RNA，甚至能够完成单细胞水平的转录组分析[33]。国内华大基因同年推出微量转录组测序技术（TruSeq），实现了高效、稳定的微量转录组测序，便利于法医学领域体液斑迹组织来源推断中发现新的标记分子。Hanson等[34]利用RNA-seq技术结合文献检索的方式筛选出100多个皮肤的候选mRNA标记分子。经验证，其中有5个标记分子（LCE1C、LCE1D、LCE2D、CCL27、IL1F7）具有高度的皮肤特异性，从皮肤拭子或各种接触性样品中提取到5～25 pg总RNA即可满足皮肤鉴定。2013年，Hanson等[35]再次利用RNA-seq技术筛选了200多个阴道分泌物候选mRNA标记分子，经验证有6个标记分子（SFTA2、FUT6、DKK4、IL9、MYOZ1、CYP2B7P1）未曾被报道且具有高度的特异性，其中MYOZ1和CYP2B7P1能够显著地将阴道分泌物与其它体液包括上皮细胞，特别是唾液和皮肤进行区分，并且CYP2B7P1与目前已知的体液/组织无交叉反应。
1.3 常见体液斑迹中具有组织特异性的mRNA分子
外周血、月经血、唾液、精液和阴道分泌液等是法医物证常见的体液类型。大量的研究表明，不同组织来源的体液均具有特异的mRNAs。其中，外周血的标记分子与血红蛋白、红细胞膜蛋白和白细胞蛋白有关。月经血是由血液、退化的子宫内膜和阴道上皮细胞等多种组织组成的混合样本，血液中的标记分子HBB、CD93和JAML在其中都有相对的低表达，但其中稳定存在的标记分子主要为基质金属蛋白家族成员MMPs。精液则主要分为两部分，一是精子细胞，标记分子有PRM1和PRM2；二是精浆，标记分子有TGM4、SEMG1、PSA和MSMB，精浆中的标记分子可用于先天性无精子症或是结扎男性精液的检验（详见表1）。理论上，在所有细胞中稳定表达的管家基因均可作为法医学体液斑迹来源鉴定的阳性对照，但主要受不同细胞代谢类型差异的限制，目前法医学上仍在寻找合适的阳性对照，现有研究结果如表2所示。
表1 法医学上常见体液斑迹中具有组织特异性的mRNA标记分子Table 1 mRNA markers eligible for forensic body f uid identification
续表1
表2 法医学上用于体液斑迹组织来源鉴定的管家基因
Table 2 Housekeeping genes for forensic body fluid identification
2 mRNA分析技术在法医学体液斑迹组织来源推断中的应用和发展
3) 药剂喷施。当茶棍蓟马虫量达到防治指标(若虫>100头/100张嫩叶)且不断增加时施药。采用静电喷雾器进行蓬面和侧面喷施。
自主学习就是在学习过程中有发自内心的学习动机，并且能够自己安排学习，自主学习必须要学习者自己制定学习计划，控制学习进度，做好学习准备。学习者在学习中投入感情，有学习的动力，就使学习中的情感体验变得积极。思考策略和学习策略是学习者应该积极发展的，要学会在解决问题中学习，也就是“会学”。自我评价，自我总结，自我补救，自我检查，也是学习活动后需要进行的，也就是所谓的“坚持学”[2]。
2.1 Northern印迹和斑点杂交技术
Northern印迹法和斑点杂交法是分子生物学中检测mRNA的传统方法。Northern印迹法可测单RNA或poly(A)+RNA样品中特定的mRNA分子大小，也可作定量分析。在早期研究中，Northern印迹法是验证克隆和生物信息学分析所得mRNA数据可靠性的方法；斑点杂交法是利用核酸单链分子碱基互补的原理，用标记的已知RNA核苷酸片段作为探针，与待测样品相应的目的片段结合形成稳定的杂交体，经显色反应，在光学显微镜或电子显微镜下观察相应的mRNA分子。但这两种传统的检测方法自动化程度和灵敏度都较低，而对样本的需求量较高，要微克级样品才能避免假阴性，且不能进行高通量的检测[28]。
2.2 终点逆转录PCR技术
随着全基因组DNA测序技术的成熟，功能基因组学研究成为主流，其中包括转录组学、蛋白组学、代谢组学等。高通量测序技术是一种快捷可靠的获取转录组信息的方法。目前，转录组测序 (RNA sequencing, RNA-Seq) 技术在研究转录组组装、基因表达定量与基因差异表达、转录本变异检测（如基因融合、编码区SNP研究）以及基因共表达和调控网络等方面发挥重要作用，相对于传统的芯片杂交平台，转录组测序技术具有高灵敏度、可数字化信号、系统性、个体组织差异性、时间独立性等优势，能够提供最全面的转录组信息。
基因芯片（gene chip），又称DNA微阵列（DNA microarray），该方法是将DNA分子固定于支持物上，并与标记的样品杂交，通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量，进而得知样品中mRNA的表达量。基因芯片技术是一种高通量研究mRNA表达的方法，可以短时间内同时检测大量mRNA的表达丰度，是目前检测整个基因组内组织特异性mRNA表达丰度比较有效的手段。这种方法信息量大但质量低，常伴有假阳性结果，且基于不同技术原理的芯片检测效果存在差异，一般用于前期筛选[32]。
2.3 实时荧光定量PCR技术
将mRNA分析用于犯罪现场体液斑迹判定的最大挑战是RNA降解导致结果出现假阳性。许多mRNAs不是绝对的体液特异，即有的mRNAs可能在某种体液中表达水平很高，但同时也会在其它体液中低表达，降解后的RNA产生的弥散条带很容易造成结果误判。实时荧光定量PCR技术 (Realtime PCR,qRT-PCR) 具有高灵敏度和高通量的优势[27]。该方法在反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号累积实时检测整个PCR进程，在扩增的指数期连续检测荧光信号强弱变化而即时测定特异性产物的量，从而实现对起始模板进行定量分析。应用qRT-PCR法，可以较准确地定量检测低丰度表达的目标mRNA分子。
Nussbaumer等[8]采用实时定量PCR (qRT-PCR)方法检测不同体液中kalikrein 3（KLK）的含量，结果显示KLK转录本仅存在于精液中，而在血液、唾液和阴道分泌液中检测不到。在这种转录本表达绝对特异的条件下，终点逆转录PCR方法是适用的。同时研究发现hemoglobin-alpha-1 (HBA) 和mucein(MUC) 虽分别在精液和阴道分泌液中高表达，但在其它体液中同样能够检测到，因此其需要利用定量方法来检测。在定量PCR分析中，合适的标准化策略对减小实验误差有重要作用[29-31]。在定量分析情况下，可以通过可靠的内参来消除假阴性结果，一个合适的内参其表达量应该比目的基因要低。
2.4 基因芯片技术
Bauer等[3]利用RT-PCR结合琼脂糖凝胶电泳方法第一个探索mRNA用于体液鉴定的方法，结果表明MMP和鱼精蛋白mRNA可以分别用来鉴定月经血和精子[20,25]。Juusola等[24]证明在生物斑痕中的RNA具有重建性，从斑痕中提取的RNA的数量和质量均能满足ACTB、GAPDH、S15三个内参基因分析的需要，并且提出STATH、HTN3、PRB1、PRB2和PRB3可以用于唾液鉴定。
2.5 二代测序技术
终点逆转录PCR (endpoint reverse transcription-polymerase chain reaction, Endpoint RT-PCR) 是将分离自样品中的RNA经逆转录酶将mRNA逆转录为cDNA，通过PCR扩增出目标片段，再以琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳检测目的片段的方法[26]。在RT-RCR过程中常用的引物有Oligo(dT)和Random Hexamer，其中Oligo(dT)特异性高，适合用于带有poly(A)尾的mRNA反转录，但对于较长的mRNA，通常不能延伸到5’端。Random Hexamer是一个混合物，有6个碱基长度，它的3’和5’端都有-OH，因此可以向两端延伸。该引物特异性低，常用于获取5’末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。由于样品RNA随暴露时间的增长会降解为小片段，因此在操作中以50～300 bp的扩增片段长度为宜。人类基因是断裂基因，DNA转录为mRNA时要经历mRNA剪切，因此一般采用mRNA的外显子-外显子接头作为引物的结合部位，以减少基因组DNA干扰[3]。目前国际法医遗传领域，对PCR扩增产物检测主流技术是毛细管电泳检测技术 (capillary electrophoresis，CE)，又称“高效毛细管电泳”。该方法具有样品用量微、利于重复检测，分离高效、快速且与检测同时完成等优点，不足是只能对样品进行定性检测。
Setzer等[7]针对血液、唾液、精液和阴道分泌物4种体液的斑迹在不同储存条件下对转录本的影响做了全面的研究，结果表明室温下存储547 d的样品中能够成功地检测到mRNA，并且其质量可以达到mRNA分析的标准。在室外且不受潮湿如雨水等污染的条件下，保存7 d的唾液斑/精斑、30 d的血斑和180 d的阴道分泌物斑痕中仍然能够检测到组织特异的mRNAs，而在雨水影响下体液斑迹中转录本的稳定性将受到很大破坏。
2018年，EUROFORGEN/EDNAP[36]联合组织了一次大规模平行测序试验，验证靶向mRNA测序用于体液斑迹鉴定结果的有效性。该试验以外周血、唾液、精液、阴道分泌物、月经血和皮肤的干燥斑迹为对象，通过Illumina MiSeq/FGx和the Ion Torrent PGM/S5两个测序平台分别设计了针对上述6种体液斑迹的靶向mRNA序列引物池，结果证明基于大规模测序技术的靶向mRNA测序可以应用于体液斑迹组织来源推断。
有关专家表示，女孩的骨龄超过14岁，男孩的骨龄超过16岁骨骺线就已接近闭合，基本没有长高的机会了。所以，矮小症在临床上强调“早发现、早诊断、早治疗”，3～12岁是矮小症治疗的黄金时间。患者的年龄越小，对治疗的反应越敏感，药物促生长效果越好；另一方面，矮小症的治疗费用跟患者的体重成正比，患者年龄越大治疗费用就越高。
叶片采用叶表皮离析法：选取3个分布区形态大小基本一致的新鲜成熟叶片，在其叶片近中脉的区域剪取1 cm×1 cm的小块，放入FAA固定液中固定。将固定好的材料放入等量的30%过氧化氢和冰醋酸中(1∶1)[12]，在60℃恒温箱中放置18 h充分分离，取上、下表皮，LEICA DM2500型光学显微镜下观察叶片上、下表皮形态拍照、记录并测量相关数据。
表3 不同mRNA分析技术的特点比较
Table 3 Comparison among the different mRNA analytic techniques
3 mRNA复合检测体系
面对微量的生物检材，建立mRNA复合检测体系，即在一个反应体系中检测多个组织特异表达的mRNAs，实现较为准确的对体液斑迹组织来源的判定，将能够极大地提高样本利用率，为案件审判提供更多有力证据。因此，建立mRNA复合检测体系是使用mRNA进行体液斑迹组织来源鉴定的重要基础。
3.1 常见体液组织来源推断的mRNA复合检测体系
目前报道的用于建立复合体系的技术方法包括RT-PCR和qRT-PCR。2005年Juusola等[17]提出体液鉴定的多重PCR方法，证明基于毛细管电泳的RTPCR方法能够鉴定血液、唾液、精液和阴道分泌物。利用8个体液特异的mRNAs（血液标记分子SPTB、PBGD，唾液标记分子STATH、HTN3，精液标记分子PRM1、PRM2，阴道分泌物标记分子hBD-1、MUC4），能够检测四种单一体液或混合体液斑迹。同时结果表明利用0.2～12 ng的RNA能够成功地鉴定体液斑迹，由此说明，多重PCR实验的灵敏度已经能够满足法医学的需求。2007年Juusola和Ballantyne[15]建立荧光定量PCR复合检测体系，用于鉴定血液、唾液、精液和月经血，该体系中血液特异性标记PBG被ALAS2替代，月经血的标记分子选用MMP7、MMP10，筛选GAPDH作为管家基因用来标准化体液特异性基因的表达。与基于毛细管电泳平台的复合检测方法相比，荧光定量PCR复合检测体系的优势在于定量检测基因表达，其检测的灵敏度可以提高5至40倍甚至更高，且能够检测0.00002～500 ng范围的RNA。2012年Lindenbergh等 [12]建立起19个mRNA标记分子组成的Endpoint PCR复合体系（3个管家基因ACTB、GAPDH、18S-rRNA，3个血液标记分子HBB、CD93、AMICA1，2个唾液标记分子STATH、HTN3，2个精液标记分子PRM1、SEMG1，2个月经分泌物标记分子MMP7、MMP11，2个阴道黏膜标记分子MUC4、HBD1，3个黏膜标记分子KRT4、KRT13、SPRR2A和2个皮肤标记分子LOR、CDSN）检测6种体液斑迹，该体系实现首次将皮肤特异的mRNA分子标记加入到复合检测体系中，结果显示该mRNA复合检测体系对血液、精液和唾液都有很高的灵敏性，而检测体系中的皮肤标记分子能够检测来自手、足、背部和唇部的皮肤，舌部的皮肤检测结果呈阴性，同时该实验证明每一种体液斑迹应至少使用两个mRNA进行确认。Xu等[37]使用的复合扩增系统XCYR1可以同时检测12个mRNA位点和2个管家基因，可以完成常见体液斑迹以及汗液和尿液的检测。目前已有的检验方法已经能够一次性检验20个以上的mRNA标记，可对数种常见的法医体液斑迹和混合斑进行检验。
3.2 欧洲DNA分型组织对mRNA分析体系的评估
为评估mRNA分析在体液鉴定中的有效性和可重复性，2011年以来，欧洲DNA分型工作组（EDNAP）先后组织了6次从体液斑迹中提取DNA和RNA并进行分析的联合试验[10,14,23,38,39]，利用基于毛细管电泳的mRNA检测技术对mRNA在体液组织来源推断中的实用性与可行性进行检测，研究结果见表4。
表4 EDNAP对mRNA分析体系的评估试验
Table 4 Evaluation test on mRNA analytic system by EDNAP
4 讨论
20世纪90年代后，发挥PCR技术的高灵敏度和STR基因座高多态性的优势，法医DNA分析实现了高效、灵敏和快速的目标。采用STR分型技术能够实现个体识别、个体信息推断、个体间亲缘关系分析等，然而法医案件的检验鉴定还需要利用其他类型的遗传标记如DNA甲基化、RNA、氨基酸多态性等提供更多的生物学信息。此外，基于微生物基因组的体液斑迹组织来源推断方法对法医学鉴定也具有重要参考价值，研究表明在不同体液中存在特异的微生物群，鉴别一种或多种微生物菌群能够有效推断其体液组织的来源。2016年，Zou等[40]首次报道了在中国汉族人群中利用微生物特征进行阴道分泌物、唾液和粪便的鉴定。结果 表明，在中国汉族人群中，L.crispatus 和L.jensenii 可以作为阴道分泌物的特异性微生物标记，B.uniformis 和B.thetaiotaomicron 可以作为粪便的特异性微生物标记，分别用于阴道分泌物和粪便的鉴定，该方法弥补了mRNA分析存在的易降解的不足，可提高检材利用率。目前，国内法医学领域将mRNA分析广泛应用到实际犯罪现场重建和案件审判中还有一些问题有待解决。首先，虽有研究表明RNA在干燥载体上具有很好的稳定性，但犯罪现场环境复杂多样，湿度、紫外线和RNA水解酶等因素对mRNA的稳定性都有一定的影响；其次，组织特异的mRNA在不同体液中的表达并不是绝对有或无差异，这些因素给实验结果的判定增加了困难；再次，案件现场检材数量受限，而获取的样品需同时满足DNA分析和mRNA分析，这对于当前的提取和检测技术而言具有一定的挑战。因此，筛选并有效监测组织/体液斑迹中稳定表达的特异标记mRNAs和管家基因，建立各标记分子在不同条件下的表达谱，优化DNA/RNA共提取技术，建立多靶标mRNA的高灵敏度检测体系，将能为提高使用mRNA遗传标记进行体液斑迹属性推断的实用性和准确度奠定基础。随着分子生物学的发展[40]，RNA在细胞功能和器官进化中的作用更多地被发现并确认。除了利用mRNA进行体液斑迹组织来源推断外，也有研究表明，mRNA随机体死亡时间/离体时间也呈现一定的降解规律，这为利用mRNA推断死亡时间、创口形成时间、斑痕形成时间提供了理论基础，故此mRNA分析技术被视为目前最有潜力和应用价值的新技术。实时荧光定量PCR技术的进步也在一定程度上弥补RNA易降解的特性，实现对低丰度靶分子的定量检测，为犯罪现场重建和案件审判提供更加可靠的科学依据。生物信息学的发展助力功能基因组学的研究，转录组测序作为其中最重要的一部分，为我们提供了更加精准的转录方面的信息，有望为RNA在法医学领域应用的研究开辟新的技术方法。
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Researches of mRNA Profiling for Forensic Body Fluid Identification
ZHAO Yixia, HU Sheng, YE Jian, SUN Qifan*, JI Anquan*
(MPS’s Key Laboratory of Forensic Genetics & National Engineering Laboratory for Crime Scene Evidence Investigation and Examination & Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security (MPS), Beijing 100038, China)
ABSTRACT: Molecular biology brings many resorts and revelations for forensic scientists to rely in transforming the relevant molecular biological technologies into forensic application. Such a kind of practice is of identifying the origin of body fluids left at a crime scene so that the evidence can be provided for crime scene reconstruction and case trial. For a long time,mRNA has not been concerned in forensic medicine because of its instability and easy-to-degrade characteristics. However,the innovations of molecular biology, including endpoint reverse-transcriptional/real-time fluorescent quantitative PCR and transcriptome analysis, have changed the stereotyping perception of RNA, laying the foundation for mRNA profiling to apply into forensic science. At present, the major methods for body fluid identification based on mRNA profiling are to construct multiple detection system so as to simultaneously detect the various specific markers expressed in different body fluids or the stains. Since 2011, European DNA profiling group (EDNAP) has organized six collaborative exercises to assess the effectiveness and reproducibility of mRNA profiling for identifying forensic body fluids. This review is to provide a general survey of the present knowledge and detection methodologies of mRNA profiling for forensic body fluid identification and discuss its potential forensic applicability.
KEY WORDS: forensic science; mRNA profiling; body fluid stains; tissue source identification; multiple detection system
中图分类号: DF795.2
文献标识码: A
文章编号: 1008-3650(2019)05-0388-07
基金项目: “十三五”国家重点研发计划课题（No.2017YFC0803503）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（No. 2018JB006、2017JB003）
第一作者简介: 赵一霞，女，山东诸城人，硕士，法医师，研究方向为法医物证学。E-mail: 18146501798@163.com
* 通讯作者简介: 孙启凡，女，山东枣庄人，博士，副主任法医师，研究方向为法医物证学。E-mail: sunqifan@cifs.gov.cn季安全，男，山东日照人，硕士，主任法医师，研究方向为法医物证学。E-mail: aqjdna@tom.com
DOI: 10.16467/j.1008-3650.2019.05.003
收稿日期: 2018-03-09；修回日期:2018-05-03
引用本文 格式:赵一霞，胡胜，叶健，等. mRNA分析在体液斑迹组织来源推断中的应用研究进展[J]. 刑事技术，2019,44(5):388-394.
标签：法庭科学论文; mRNA分析论文; 体液斑迹论文; 组织来源推断论文; 复合检测论文; 公安部物证鉴定中心现场物证溯源技术国家工程实验室法医遗传学公安部重点实验室论文;