蒋黎[1]2004年在《人鼠嵌合肝动物模型及其感染HBV的初步研究》文中研究表明肝脏是最早进行细胞移植实验的器官之一。人肝细胞移植是当前医学研究的重点领域,它不但可作为有效的治疗手段,而且利用人肝细胞异种移植建立动物模型对于研究病毒感染性肝病大有裨益。异种肝细胞移植到具有免疫活性的啮齿动物体内会因宿主免疫系统的T淋巴细胞激活和迟发性超敏反应而排斥供体细胞。要克服异种移植引发的排斥反应可选用无免疫活性的小鼠作为受者,或是诱导产生针对移植物的特异耐受。免疫系统具有重要的识别功能,即识别自己和异己。对自身组织细胞产生耐受,而对非己组织细胞识别后,引起有效的免疫应答,通过排斥反应,从体内消除异己物质。实验证明,动物在胚胎发育时期接触到外来抗原会逐渐对这些抗原产生免疫耐受,出生后允许异种移植物在体内存活。本课题采用诱导胎鼠出生前对人胎肝细胞产生免疫耐受,出生后移植人胎肝细胞的方法,建立人鼠嵌合肝动物模型。而后接种乙型肝炎病毒(HBV)感染人血清,观察嵌合在具有正常免疫活性大鼠肝内的人肝细胞是否能感染HBV。实验方法和结果如下:一、人鼠嵌合肝动物模型的初步建立妊娠14～18日Wistar大白鼠。在无菌操作下,暴露孕鼠子宫,对胎鼠腹腔内注射人胎肝细胞。逐层缝合,让孕鼠自然生产。胎鼠出生后24小时内于新生小鼠脾内注射人胎肝细胞。采用免疫印迹法(Western blot)、逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)及免疫组织化学等方法,于不同时相检测实验大鼠血清人白蛋白、肝组织中人白蛋白mRNA及人肝细胞型细胞角蛋白CK18。结果于4、6、8周龄大鼠血清中测出人白蛋白;4、6、8、10周龄大鼠肝组织中测出人白蛋白mRNA;4、6、8、10、12周龄大鼠肝组织中有CK18表达。上述结果表明经过胚胎期人胎肝细胞诱导对其产生免疫耐受的胎鼠,出生后24小时内接受人胎肝细胞移植,不需要免疫抑制剂而能够在大鼠肝中存活。移植了人胎肝细胞的嵌合鼠能表达人白蛋白,说明移植的人胎肝细胞不仅在嵌合鼠肝内存活,而且能够保持一定的功能,维持近12周。
周笛[2]2010年在《利用人干细胞制备人鼠嵌合肝的实验研究》文中研究说明人类病毒性肝炎病毒具有严格的种属特异性,一直缺乏能够模拟机体感染过程的动物模型。本研究利用人类干细胞具有能分化为其他细胞的潜力并且有在肝脏增殖的特性来制备人鼠嵌合肝,以期为建立研究人类肝炎的动物模型奠定基础。第一部分:利用人脐带血干细胞制备人鼠嵌合肝。目的:利用体外移植技术,将人脐血干细胞移植到裸鼠体内,制备人鼠嵌合肝,并用乙肝病毒(HBV)感染。方法:将人脐血干细胞,经尾静脉分两次注射到裸鼠体内。分别于第7,14,21天取肝组织,进行甲胎蛋白(AFP)免疫组织化学检测,分析人肝细胞在裸鼠体内嵌合生长情况,并进行乙肝病毒感染实验,定量检测感染后小鼠血清中甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)。另取正常裸鼠做对照组。结果:实验组小鼠在第7、14、21天肝脏内AFP持续阳性表达,甲胎蛋白表达于细胞质内。乙肝病毒感染后小鼠肝脏乙肝表面抗原(HBsAg)组化显示密集成片的阳性细胞。实验组和对照组表达差异显着(P<0.05)。结论:将人脐血干细胞移植裸鼠肝脏内可以存活并分化成人肝细胞形成嵌合肝,并能被乙肝病毒感染。第二部分:利用人骨髓干细胞制备人鼠嵌合肝。目的:利用直接外科手术法,将人骨髓干细胞移植到胎鼠肝组织,制备人鼠嵌合肝。方法:人骨髓干细胞,经手术直接注射到一定日龄胎鼠肝组织,每只移植1×10~9人骨髓细胞。对出生的嵌合肝小鼠不同时相点进行血清AFP和ALB长期测定和肝组织免疫组化检测,分析人肝细胞在小鼠体内嵌合生长情况,并用携有丙肝病毒的病人血清经尾静脉注入嵌合肝小鼠体内进行感染实验。结果:2月龄、4月龄、6月龄、12月龄嵌合肝小鼠血清甲胎蛋白含量显着高于正常鼠;20d后尾静脉取血进行丙肝病毒PCR定量检测,结果表明感染阳性率可达66.67%。结论:将人骨髓干细胞移植胎鼠肝脏内能够在免疫功能正常的小鼠体内实现嵌合肝并可分化,具有人肝细胞特性可被丙肝病毒感染,存活时间能够维持达12月以上。
蒋黎[3]2002年在《人鼠嵌合肝:研究肝脏病学的新工具》文中指出病毒性肝炎威胁着人类的健康,但因尚未完全掌握肝炎病毒的感染、复制和发病机制全过程而影响到对肝炎病毒的深入研究。动物模型的建立为我们提供了研究病毒性肝炎的平台,本文就人肝细胞异种移植建立的人鼠嵌合肝动物模型的研究进展作了综述。
樊全荣[4]2013年在《基于肝损伤小鼠模型重构小鼠和人的肝脏》文中研究表明目前,肝病相关的体内研究多基于在小鼠的肝脏开展。然而,小鼠肝脏与人的存在差异,致使基于小鼠肝脏获得的许多研究结果不能直接应用到人体,而人的体内研究受伦理和技术等方面的制约。肝脏人源化的嵌合体(人鼠嵌合肝)小鼠是在人肝脏发育和再生机制、人类肝脏相关疾病(肝炎、肝硬化和肝癌等)发病机制、肝炎病毒(HBV和HCV等)易感动物模型建立、药物代谢动力学等领域具有重要的应用价值,其也为在大动物(如小型猪)体内重构人肝脏提供理论依据和进行实践探索,并成为临床前研究由鼠到人之间的重要载体和桥梁。因此,制备高比率嵌合有人肝细胞的人-鼠嵌合肝对人类的肝病研究具有巨大而深远的意义。早期是将人肝细胞异位移植进小鼠体内建立人鼠嵌合肝,现在随着科学技术的不断进步,人们开始将目光转向利用干细胞来实现人和鼠肝脏的嵌合。干细胞(stem cells, SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞,它是一种未充分分化,尚不成熟的细胞,具有再生各种组织器官和人体的潜在功能,医学界称为“万用细胞”。这就为干细胞在一定环境下发育成肝细胞提供了理论依据。同时也为在小鼠体内建立人鼠嵌合肝模型提供了可能。截止到现在,国内外均有文献报道将干细胞通过核移植或宫内移植进正常动物体内,以实现多组织多器官的嵌合。但是,由于宿主体内的微环境中缺乏移植细胞生长的各种激素和生长因子,宿主细胞的增殖将优先于移植细胞,因此,各组织器官的嵌合率比较低。为了克服上述困难,得到高比率嵌合的个体,选用特定器官缺陷的动物模型作为受体环境是较为理想的选择。富马酰乙酰乙酸盐水解酶(Fah)基因敲除小鼠缺乏Fah基因,酪氨酸分解代谢的最后一步受到阻碍,导致富马酰乙酰乙酸盐(FAA)和前体(MAA)底物的聚集,FAA与MAA对肝脏有毒性。利用此肝损伤小鼠模型作为受体动物,将人干细胞移植进该鼠的囊胚中,有望提高人干细胞在宿主体内的增殖优势,这对研发人肝细胞高比率嵌合的嵌合肝模型是至关重要的。为实现灵敏的非损伤、实时和可视化体内示踪移植供体细胞及其在体内衍生的细胞,通过综合分析活体内生物发光[用荧光素酶(Luciferase, Luc)基因标记细胞等]成像和荧光[荧光报告基团(GFP和RFP等)]成像各自的特点和优势,为将生物发光成像和荧光成像的优点集为一身,我们将用双报告或叁荧光报告基因标记供体移植细胞,已达到活体示踪的目的。在研究中,我们首先利用小鼠诱导性多潜能干细胞(Mouse induced pluripotent stem cells, miPSCs)通过囊胚腔移植(Blastocyst transplantation)建立鼠/鼠嵌合肝动物模型,待方法和技术成熟后再利用人骨髓间充质干细胞(Human bone marrow mesenchymal stem cells, hMSCs)通过囊胚腔移植建立人/小鼠嵌合肝动物模型。第一部分小鼠诱导性多潜能干细胞(miPSCs)囊胚腔移植建立鼠/鼠嵌合肝动物模型目的：通过小鼠诱导性多潜能干细胞(miPSCs)囊胚腔移植建立鼠/鼠嵌合肝动物模型,一方面可以观察干细胞在体内对受损肝脏的修复作用,另一方面为建立人/鼠嵌合肝模型提供理论和实践基础。材料和方法：(1)慢病毒载体pEF1a-ZsGreen-Fluc鉴定,慢病毒生产与鉴定,慢病毒感染miPSCs;(2)检测病毒感染后的miPSCs(LG-miPSCs)是否仍然保持其干性；(3)鼠/鼠嵌合体动物的制作将携带有绿色荧光蛋白(ZsGreen)和荧光素酶(Flue)双报告基因的miPSCs移植进Fah(-/-)小鼠的囊胚中,然后将囊胚移植进假孕母鼠的子宫内,待其出生；(4)体式荧光显微镜检测待小鼠出生后3天在镜下观察是否可以看到绿色荧光,待小鼠成年后取材,取其肝脏、肾脏、心脏、脑、肺脏、脾脏等脏器在镜下观察是否可见绿色荧光；(5)小动物活体成像仪检测小鼠从出生到成年,不同时间点腹腔注射Flue底物,观察是否可见Fluc荧光；(6)PCR检测取成年后小鼠的肝脏、鼠尾、肺、脑、肾脏、心脏、脾脏、肠等组织,一部分用于提取基因组DNA[另一部分用于制备石蜡切片以用于HE染色和免疫荧光(Immunofluorescence)检测],并采用Fah引物PCR检测各器官中是否有移植细胞的嵌合；(7)HE染色观察嵌合体动物肝脏的组织结构以确定肝脏结构是否正常；(8)免疫荧光检测检测嵌合体小鼠肝脏中Fah基因的表达水平,及其白蛋白(Alb)、CK18、CK19、转铁蛋白(transferrin)的表达；(9) Western blot检测嵌合体小鼠肝脏中Fah基因表达。结果：(1)慢病毒载体鉴定、感染miPSCs以及其干性的鉴定鉴定结果符合预期,感染miPSCs(LG-miPSCs)效率接近100%,LG-miPSCs仍保持其多向分化潜能；(2)妊娠结局先后将LG-miPSCs移植进160枚Fah(-/-)小鼠的囊胚中,接着种植到10只假孕母鼠的子宫内,有四窝仔鼠顺利出生,数量共38只,经过撤药处理后,最终有2只幸存鼠发育到成年；(3)体视荧光显微镜和小动物活体成像仪检测从出生到取材各个时间点均未检测到ZsGreen和Flue双报告基因的表达；(4)Fah或Luc基因的基因型鉴定采用PCR对潜在的嵌合鼠所取肝脏组织针对FAH或Luc基因行基因型鉴定,在嵌合肝中检测到野生型Fah基因和报告基因Flue的存在；(5)HE染色嵌合鼠肝脏组织结构与正常小鼠的结构基本一致,而撤药的和没撤药的Fah(-/-)小鼠肝脏组织结构紊乱无序；(6)免疫荧光检测嵌合体小鼠肝脏免疫荧光检测结果显示,大部分肝细胞表达Fah,两只嵌合体小鼠的嵌合肝中LG-miPSCs衍生的鼠肝细胞的嵌合率分别为84.69%和88.43%,同时Fah阳性的肝细胞(即LG-miPSCs衍生的鼠肝细胞)能够正常表达Alb、CK18、CK19和transferrin;(7) Western blot检测Fah基因表达两只嵌合体小鼠的嵌合肝均能正常表达Fah基因,而Fah(-/-)小鼠未检测到Fah基因表达。结论：(1)成功获得LG-miPSCs衍生的鼠肝细胞高比率嵌合的鼠-鼠嵌合肝小鼠模型,这为进一步利用hMSCs通过囊胚腔移植建立人/小鼠嵌合肝动物模型奠定了良好基础。第二部分人骨髓间充质干细胞(hMSCs)囊胚腔移植建立人/鼠嵌合肝动物模型的前期工作目的：通过人骨髓间充质细胞(hMSCs)囊胚腔移植在小鼠受损肝脏上建立人／鼠嵌合肝动物模型,该模型一方面将为在生物活体内研究人干细胞生物学行为提供理想模型,另一方面也将为在体内研究人类肝脏发育和再生、肝脏疾病的发生发展和治疗以及药物代谢评价提供理想模型。材料和方法：(1)慢病毒载体pCMV-RFP-Alb-fLuc-ZsGreen(简称为pCRAGL)鉴定,慢病毒生产与鉴定,慢病毒感染hMSCs;(2)病毒感染后hMSCs干性的鉴定；结果：(1)慢病毒载体鉴定、感染hMSCs以及其干性的鉴定鉴定结果符合预期,感染hMSCs效率为95%以上,感染后hMSCs(简称为RLG-hMSCs)仍保持其多向分化潜能；
林沪[5]2006年在《L02人肝细胞在人鼠嵌合肝中增殖的实验研究》文中进行了进一步梳理近几年,啮齿类动物模型在了解特异基因的功能、代谢通路和疾病进程方面起了巨大的作用。肝炎病毒感染具有明显的种属特异性,其易感宿主局限于人及黑猩猩等高级灵长类动物,但黑猩猩、猕猴、树鼩以及一些转基因动物模型等因为各种原因而限制了其应用。人鼠嵌合肝是利用人肝细胞异种移植到受体鼠肝内建立的新型动物模型,该模型解决了肝炎病毒感染的种属特异性问题,可应用于已知和未知肝炎病毒感染的研究。本课题采用诱导免疫耐受的方法建立的动物模型,系构建在正常免疫系统基础上,能够模拟病毒感染的全过程,可应用于研究发病机制、抗病毒治疗和开发疫苗。但是,直接移植入鼠肝的人肝细胞,其生存时间有限,要建立稳定持久的人鼠嵌合肝动物模型,必须提高移植细胞的增殖能力。若首先给予肝毒性药物或放射线照射,抑制受体细胞增殖,使移植肝细胞有更强的生长优势,随后给予外源性生长刺激如部分肝切除,则能显着提高移植细胞的增殖能力,此即是本课题的出发点。本课题采用宫内诱导免疫耐受的SD(Sprague-Dawley)大鼠,出生后2~3周注射2-乙酰氨基芴(2-acetaminofluorene, 2-AAF)或倒千里光碱(Retrorsine, Rts)抑制受体肝细胞的增殖,后行2/3部分肝切除术(Partial hepatectomy, PH)刺激再生,同时经脾移植DiI(1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)染色后的L02人肝细胞,从而建立具有正常免疫活性的人鼠嵌合肝动物模型。通过多种方法,检测人鼠嵌合肝内L02人肝细胞的增殖和存活时间,同时进一步完善对人鼠嵌合肝动物模型的检测手段。研究目的探讨药物2-乙酰氨基芴和倒千里光碱,是否可以提高人肝细胞在具有正常免疫活性的人鼠嵌合肝中的增殖及成活时间,从而建立稳定持久的人鼠嵌合肝动物模型。研究内容和方法2-AAF组和Rts组各分配6只SD孕鼠,每组共产胎鼠各约60只,均分为实验组和对照组大鼠。
蒋黎, 毛青[6]2004年在《丙型肝炎病毒感染动物模型研究进展》文中研究指明丙型肝炎病毒(HCV)感染是全球关注的公共卫生问题,对HCV分子生物学特性的深入探讨有赖于实验模型的建立.建立理想的HCV动物模型,不仅有利于丙型肝炎疫苗的研制,同时对深入研究丙型肝炎慢性化机制,包括病毒变异与宿主免疫应答以及与疾病的关系等,均具有重要意义. 文章主要介绍了黑猩猩、猴、树鼩转基因鼠以及人鼠嵌合肝模型感染HCV,同时探讨了该模型体系存在问题及应用前景。
参考文献：
[1]. 人鼠嵌合肝动物模型及其感染HBV的初步研究[D]. 蒋黎. 第叁军医大学. 2004
[2]. 利用人干细胞制备人鼠嵌合肝的实验研究[D]. 周笛. 新疆农业大学. 2010
[3]. 人鼠嵌合肝:研究肝脏病学的新工具[J]. 蒋黎. 国外医学(流行病学传染病学分册). 2002
[4]. 基于肝损伤小鼠模型重构小鼠和人的肝脏[D]. 樊全荣. 南方医科大学. 2013
[5]. L02人肝细胞在人鼠嵌合肝中增殖的实验研究[D]. 林沪. 第叁军医大学. 2006
[6]. 丙型肝炎病毒感染动物模型研究进展[J]. 蒋黎, 毛青. 世界华人消化杂志. 2004
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