（乐山市人民医院消化内科 四川 乐山 614000）
【摘要】目的：构建DNAJA1(DnaJ heat shock protein family(Hsp40) member A1)基因过表达质粒，转染结肠癌细胞株，并对其是否转染成功进行鉴定。方法：Real-time聚合酶链反应(PCR)及Western blot检测6株结肠癌细胞及瞬时转染DNAJA1质粒的细胞中DNAJA1 mRNA水平。采用全基因合成法合成DNAJA1编码区序列并克隆入pEGFP-C1载体末端，构建重组质粒pEGFP-C-DNAJA1并进行测序及凝胶电泳鉴定。结果：6株结直肠癌细胞中，DNAJA1在HT29和HCT116中的mRNA和蛋白水平最较低，在LOVO和SW620细胞中较高。测序及凝胶电泳结果表明DNAJA1重组质粒构建成功。瞬时转染HT29和HCT116细胞后，与对照组相比，DNAJA1 mRNA分别升高约50倍，蛋白表达也明显升高。结论：成功构建DNAJA1基因过表达重组质粒，并有较高的转染水平，为进一步的研究提供了条件。
【关键词】DNAJA1；结肠癌；基因转染
【中图分类号】R735.35 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）33-0184-02
【Abstract】Objection To construct the recombinant DNAJA1 (DnaJ heat shock protein family (Hsp40) member A1) overexpressed plasmids and transfect them in HT29 and HCT116 colorectal cancer (CRC) cell lines.Methods The expression of DNAJA1 mRNA in six CRC cell lines and DNAJA1 transient transfected cells was detected by using real-time polymerase chain reaction (PCR) and Western blot. DNAJA1 coding region was synthesizedto splice whole gene and then cloned into C terminus of pEGFP ovector to construct recombinant plasmids, and finally verified by gel electrophoresis and DNA sequencing. Results Among the six CRC cell lines The lowest levels of DNAJA1 mRNA and protein were observed in HT29 and HCT116 cells, and its highest levels were detected in SW620 and LoVo cells. The DNA sequencing and gel electrophoresis results validated the well recombinant plasmids. DNAJA1 mRNA in transient expressed SW480 cells was significantly increased by 50 fold, and the protein level of DNAJA1 was also obviously increased. Conclusion The recombinant DNAJA1 overexpressed plasmids were successfully constructed, which offered a well condition for our further research.
【Key words】DNAJA1; Colorectal cancer; Gene transfection
近年来，随着医学技术的不断进步，结直肠癌的病死率有所下降，但它仍是人类最常见的恶性肿瘤之一，且它的发病率有逐年上升的趋势[1]。DNAJA1是热休克蛋白40家族（也称DNAJ家族）成员之一，主要负责如展开错误折叠的蛋白质、折叠多肽链、参与多肽的跨膜运输、组装及拆卸蛋白质复合物并控制、调节蛋白质生成等细胞生理活动[2-3]。近年来，DNAJA1越来越多地出现在肿瘤相关领域的研究报道中。在敲除DNAJA1的小鼠C6恶性胶质瘤细胞的研究中，发现C6胶质瘤细胞敲除DNAJA1后，细胞的迁移和侵袭能力增强[4]。另外，DNAJA1可以增强神经胶质瘤细胞的放疗抵抗性[5]。但目前，DNAJA1在结直肠癌中的作用尚无文献报道。
1.材料与方法
1.1 材料
Lipofectamine2000、Trlzol购自life公司；PCR试剂盒、T4 DNA连接酶和DNA Marker均购自Promega公司；PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒和质粒小提取试剂盒均购自QIA InC公司；限制性内切酶KpnI、Xhol购自NEB公司。
1.2 方法
1.2.1 PCR扩增目的基因 DNAJA1（NM_001314039.1）的扩增编码区序列（CDS区）总共723个碱基。利用primer5软件进行引物设计。以人正常结直肠cDNA为模板对目的片段进行PCR扩增。PCR扩增条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，62℃退火40s，72℃延伸90s，完成35个循环后再延伸5min。扩增完成后，分别取5ul PCR扩增产物进行琼脂糖（1.5%）凝胶电泳鉴定。
1.2.2瞬时转染结直肠癌细胞 用含10%胎牛血清的RPMI.1640培养基培养6株结直肠癌细胞并放置在37℃、5%的C02培养箱中。转染前l天将HT29和HCT116细胞转种至6孔板，当细胞融合到60%～70%时，以脂质体（Lip0fectamineTM2000）为载体分别转染重组质粒pEGFP-C1-DNAJA1和空白质粒pEGFP-C1，48 h后收集细胞，进行Real-time PCR及Western-blot检测。
1.2.3 Real-time PCR收集细胞，按Trizol和反转录试剂说明书分别提取RNA及逆转录合成cDNA。DNAJA1上游引物 5’CCTTCAT TTGGATT CTTATCAGG3’；下游引物 5’GAGCCAAAACCACCACCTGC3’；GAPDH 上游：5'-GTCCACCACCCTGTTG CTGTA-3'；下游：5'-CTTCAACAGCGACACCCACTC-3'。PCR反应体系10ul，反应条件：95℃预变性3min，95℃变性10s，60℃退火40s，72℃延伸30s，共40个循环。根据PCR反应曲线得到各样品目的基因和看家基因的Ct值，计算2-ΔΔCt值进行相对定量。
1.2.4 Western blot检测：细胞总蛋白提取及浓度测定按说明书操作。蛋白变性、制胶、电泳、转膜，封闭1h，用兔抗人DNAJA1单克隆抗体（1:300）、鼠抗人GAPDH单克隆抗体（1:1000），4℃过夜孵育，PBST溶液洗膜三次，每次10分钟，羊抗鼠、兔IgG二抗（1:10000），室温孵育1h，发光显影。
1.3 统计学处理
本研究的实验数据运用SPSS20.0统计软件进行统计学分析。数据结果采用均数±标准差（δ±s）表示，各项指标的两样本均数的比较采用独立样本的检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.结果
图1 DNAJA1 在6株结直肠癌细胞中的mRNA（图A）和蛋白水平检测（图B）
图2 DNAJA1过表达载体的构建（图A）及在结直肠癌细胞HCT116和HT29中的mRNA（图B）和蛋白水平检测（图C）
2.1 结直肠癌细胞株中DNAJA1的含量
Real-time PCR 及 Western blot检测6株结直肠癌细胞：HCT-116、HT-29、LoVo、SW620、SW480、174T 中DNAJA1 mRNA及蛋白水平。结果显示：DNAJA1在HCT116及HT29细胞中的mRNA及蛋白水平较低，在LoVo和SW620中的含量较高（见图1）。故选择HCT116和HT29细胞用于转染DNAJA1基因过表达重组质粒。
2.2 DNAJA1过表达质粒的构建及鉴定
以重组质粒为DNA模板，进行DNAJA1 PCR 扩增实验、凝胶电泳鉴定（图2A），为保证合成的DNAJA1基因编码区序列定向克隆至pEGFP-C1表达载体，进行DNA测序鉴定及BLAST比对，显示插入的碱基序列片段与目的基因完全一致，表明重组质粒构建成功。同时，我们将DNAJA1 过表达质粒转染结肠癌HT29和HCT116细胞。Real-time PCR及 Western blott 结果显示，HT29和HCT116细胞中瞬时转染DNAJA1过表达质粒后，DNAJA1 mRNA及蛋白表达水平显著增高（见图2B和2C）。以上结果显示，DNAJA1过表达质粒在结直肠癌细胞中转染及表达成功。
3.讨论
DNAJA1是HSP40蛋白家族成员之一，在与肿瘤相关的研究中，DNAJA1参与了包括蛋白降解[6]、侵袭[4]和凋亡[7]等在内的多种肿瘤细胞生理活动。在胸膜恶性间皮瘤中，DNAJA1的低表达与病人在术后短期内复发相关[8]。但它在结直肠癌中功能还没有进行深入的研究。
本篇文章中，我们首先检测了DNAJA1在6株结直肠癌细胞株中的表达情况。我们发现在高转移和侵袭的SW620和LoVo细胞中DNAJA1表达较高，而在低转移的HCT116和HT29中，表达较低。这可能表明DNAJA1 在结直肠癌的侵袭和转移中有重要作用。但这与之前报道的在恶性胶质瘤中敲除DNAJA1后促进细胞的迁移和侵袭的结论截然不同[4]。因此为了进一步研究DNAJA1在结直肠癌中的作用及分子机制，接下来，我们以人正常的结直肠cDNA为模板对DNAJA1因进行扩增。DNAJA1基因开放阅读框全长723bp，我们利用primer5软件进行引物设计，然后进行PCR扩增、酶切、胶回收、连接、转化、筛选阳性克隆以及反复验证，成功将全长DNAJA1基因克隆至过表达载体pEGFP-C1中，并借助脂质体将其瞬时转染至HCT116和HT29细胞，经Real-time和Westen-blot检测表明pEGFP-C1-DNAJA1过表达载体构建成功，并在SW480细胞株中的转染率较高，这为我们下一步进行更深入的研究创造了条件。
【参考文献】
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[8] Ivanov SV, Miller J, Lucito R, Tang C, Ivanova AV. Genomic events associated with progression of pleural malignant mesothelioma. Int J Cancer;2009;12(3):589-99.
论文作者:易礼智,王琴,程征宇（通讯作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2018年33期
论文发表时间:2018/12/10
标签：转染论文; 质粒论文; 细胞论文; 基因论文; 蛋白论文; 结直肠癌论文; 细胞株论文; 《医药前沿》2018年33期论文;