汪小锋[1]2002年在《中国对虾（Penaeus chinensis）酚氧化酶的生物化学性质及几种免疫促进剂对中国对虾酚氧化酶和血细胞的影响》文中研究表明中国对虾(Penaeus chinensis)酚氧化酶是中国对虾非特异性免疫系统中的主要成员，在对虾免疫防御中起着关键性作用。对酚氧化酶的研究，对于弄清酚氧化酶的精确生物化学性质，进而确定其在对虾免疫防御中的生物学功能及其作用机制具有重要意义。本文以中国对虾(Penaeus chinensis)的血淋巴为材料，利用凝胶过滤和离子交换等方法，对酚氧化酶(phenoloxidase)进行了分离纯化和生物化学性质研究。实验发现，酚氧化酶原(prophenoloxidase)的分子量为87.5kDa左右，在实验操作过程中极易发生降解或自身降解，变成有活性的大小约77kDa的酚氧化酶，1％SDS可使该酶原全部被激活而成为有活性的酚氧化酶。以L-二羟苯丙氨酸(L-DOPA)为特异性底物对酚氧化酶活性进行研究发现，其最适pH值为6.0左右，最适温度为40℃，K_m值约为1.99mmol/L。利用多种氧化酶抑制剂对酚氧化酶纯化样品的酶活性进行研究，发现抗坏血酸(ascorbic acid)，半胱氨酸(cysteine)和二硫苏糖醇(dithiothreitol)对酚氧化酶活性具有很强的抑制作用，硫脲(thio urea)对酚氧化酶活性也具有较强的抑制作用，而酚氧化酶对苯甲酸(benzoic acid)、柠檬酸(citric acid)和亚硫酸钠(sodium sulfite)不敏感，而且该酶对酪氨酸等单酚还具有高特异性的酚氧化酶活性，表明它可能是一种酪氨酸酶型的酚氧化酶；利用各种蛋白酶抑制剂对其性质进行研究发现，该酶的活性为SBTI、Bestatin、p-APMSF和chymostatin等蛋白酶抑制剂较强抑制，但几乎不受PMSF、pepstatin、leupeptin、TLCK和TPCK等的影响，表明该酶在蛋白酶性质上很象是一种胰蛋白酶类型的蛋白酶。此外，该酶对EDTA和金属离子非常敏感，其活性能被Cu~(2+)强烈抑制，被Mg~(2+)强烈激活，并且Cu~(2+)能有效的回复被DETC抑制的酶活，表明该酶很可能是一种Cu-金属酶(Cu-metalloenzyme)。 许多免疫促进剂均具有提高动物自身免疫力的功能，能增强被刺激动物抵御外来病原侵袭的能力。在对虾中也已报道了一些免疫促进剂，能不同程度地提高对虾的自身免疫力，但其具体作用机理目前还不清楚。筛选出高效的免疫促进剂，查清其增强对虾自身免疫力的分子机制，不仅具有重要的理论意义，中国对虾酚氛化酶的生物化学性质及几种免疫促进剂对对虾酚氛化陇和血细胞的影晌而且对于利用免疫促进剂增强对虾免疫力、降低死亡率，促进对虾养殖业的可持续发展，还具有重要的应用价值。本文利用脂多糖(LPS)、p一葡聚糖(p一1，3一glucan)、灭活哈维氏弧菌和灭活鳗弧菌4种免疫促进剂对中国对虾进行了免疫刺激，通过分离纯化、光镜和透射电镜观察等技术对刺激前后中国对虾酚氧化酶的产量、活性以及血细胞的数量、超微结构的变化进行了研究。研究结果表明，经p一葡聚糖刺激后的中国对虾，其血细胞总数量增多了83.4%，其中小颗粒细胞的数量增多了100.4%，酚氧化酶的产量提高了104.7%，总酶活性提高了79.4%，而单位酶活性并无变化(实验组/对照组，0.99);经LPS刺激后的中国对虾，其血细胞数量增多了52.0%，其中小颗粒细胞数量增多了673%，酚氧化酶的产量提高了81.3%，总酶活性提高了113.1%，单位酶活性几乎没有变化(实验组/对照组，1.04);经灭活哈维氏弧菌刺激后的中国对虾，其血细胞数量增多了73.4%，其中小颗粒细胞数量增多了572%，酚氧化酶的产量提高了30.1%，总酶活性提高了37.8%，单位酶活性基本上没有变化 (实验组/对照组，1.06);经灭活鳗弧菌刺激后的中国对虾，其血细胞数量增多了1 n.3%，其中小颗粒细胞数量增多了102.9%，酚氧化酶的产量提高了40.4%，总酶活性提高了46.3%，单位酶活性几乎没有变化(实验组/对照组，1.04)。透射电镜下的观察结果表明，中国对虾血细胞的超微结构在免疫刺激前后也发生了变化，叁种血细胞的糙面内质网、核糖体和线粒体的数量均有一定程度的增加，其中以小颗粒细胞和大颗粒细胞的超微结构变化幅度最大。从以上研究结果可得出如下结论:免疫促进剂刺激后，免疫刺激所引起的血细胞数量的增加主要是小颗粒细胞数量的增加(小颗粒细胞数量占血细胞总量的85.3%)，证明小颗粒细胞在免疫促进剂的作用发挥中具有至关重要的作用;免疫促进剂刺激后，酚氧化酶产量增加，总酶活性提高，而单位酶活性基本上没有变化，从而证实中国对虾在接受免疫刺激后主要是通过增加酚氧化酶的产量而不是通过提高酚氧化酶的单位酶活性来增强自身免疫力的;综合几种免疫促进剂对中国对虾酚氧化酶产量及血细胞尤其是小颗粒细胞数量、结构的影响，发现脂多糖和p一葡聚糖在四种免疫促进剂中的效果最好，可望应用于对虾养殖业中以降低对虾的死亡率。
王晓斐[2]2008年在《中国对虾（Penaeus chinensis）主要过敏原的鉴定及性质研究》文中研究表明虾味道鲜美,营养丰富,深受消费者喜爱,但其同时也是联合国粮农组织公布的8种常见的高过敏活性食物之一。本论文以原产于我国的中国对虾(Penaeus chinensis)为研究对象,旨在获得有关中国对虾过敏原的基础数据,为海产品过敏原的控制提供依据。首先,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对中国对虾过敏原组分进行分析,经免疫印迹鉴定其主要过敏原Pen c 1;然后利用高效液相色谱纯化Pen c 1;经苯酚-硫酸法、肽质量指纹图谱和红外光谱分析等方法对其性质进行初步研究。结果表明Pen c 1为分子量36kD的糖蛋白;糖含量为4.4%;检索出了17条吻合肽段;其二级结构存在α-螺旋。为研究Pen c 1的分子生物学特征,我们根据已报道的其它品种虾过敏原的核苷酸序列设计引物,应用PCR方法克隆Pen c 1的基因并进行测序,结果显示Pen c 1开放阅读框长825bp,编码274个氨基酸。从GenBank数据库中检索不同种属海产品的过敏原,运用生物信息学软件进行分析,研究氨基酸同源性并构建系统进化树,结果表明不同海产品过敏原的氨基酸存在较高的同源性,并且其亲缘关系越近其同源性也越高。分析免疫球蛋白E结合区域的9个肽段的抗原表位,发现这些海产品过敏原中存在相同的抗原表位。除此之外,利用在线软件,推测Pen c 1的二硫键,等电点,疏水性,二级结构以及O-糖基化位点等。利用气相色谱分析Pen c 1的单糖组成;根据β消去分析其糖苷键类型;通过表示扫描热量仪分析糖链对过敏原热稳定性的影响;以质谱为主要研究手段,确定Pen c 1的糖基化位点。结果表明:Pen c 1单糖组成有两种,它们分别是D-甘露糖和D-葡萄糖;Pen c 1中存在O-糖苷键;糖链能增强Pen c 1的热稳定性;122位天冬酰胺为Pen c 1的N-糖基化位点,第101苏氨酸为潜在的O-糖基化位点。利用N-肽糖苷酶F专一酶切N-糖链;通过美拉德反应合成多糖与蛋白复合物;根据实验建立起来的ELISA体系,测定糖链酶切前后、美拉德反应前后Pen c 1的过敏活性变化。结果表明:N-糖基化位点以及潜在的O-糖基化位点均不在9个肽段的抗原表位上,糖链对Pen c l的过敏活性影响不大。通过胰蛋白酶水解降低Pen c l的过敏活性,采用叁因素二次旋转正交回归设计对水解反应的工艺参数pH值、水解温度( T)、酶和底物比( E:S)进行了优化。建立了以反应过敏活性的OD值为响应值的二次旋转正交回归模型。方程通过F检验、t检验和应用验证,表明模型能较好地反映胰蛋白酶水解Pen c l反应体系的运行规律,优化出水解条件为: pH值为8.12,水解温度为43.3℃,E:S为4.3 U/g。
李海兵[3]2008年在《对虾肠道益生菌的筛选与免疫物质活性评价指标的建立》文中研究指明近年来,频繁发生的病毒性和细菌性疾病,使对虾养殖业蒙受了巨大损失,严重制约了该产业的可持续发展。在认识到使用抗生素等药物的负面影响后,人们己把注意力转移到调动或激活虾类自身的免疫系统。对虾的免疫机能与对虾的健康密切相关。免疫增强剂能提高动物的免疫机能,促进动物的健康,增强动物的抗病力。因此,对虾高效免疫增强剂的筛选和筛选方法的建立便成为了此项研究的重点。本研究分为5部分:中国对虾各个生长阶段的肠道菌群及其安全性的研究,对虾肠道细菌中病原菌拮抗菌的筛选及其益生作用,以上两部分旨在为有突出免疫激活效果益生菌或细菌成分的筛选与组合奠定基础;凡纳滨对虾受病原侵染后某些免疫因子的变化规律,旨在建立对虾免疫物质活性评价的敏感指标,同时探讨了克氏原螯虾能否作为一种模式动物来进行对虾免疫增强剂的筛选;最后一部分为牙鲆鳗弧菌疫苗及抗体对中国对虾的保护作用。中国对虾各生长阶段肠道可培养的菌群分析:本试验对中国对虾各个生长阶段的肠道菌群数量和种类进行了研究分析,结果显示:从卵到成虾到亲虾肠道细菌数量不断增加,其细菌数量在3×107-4×108 cfu/g范围内;细菌种类也在不断增加,卵到仔虾的肠道细菌中主要优势菌为芽胞杆菌,该阶段中卵、无节幼体仅含有芽胞杆菌,蚤状幼体时细菌种类开始增多,出现了副溶血弧菌和溶藻胶弧菌,到糠虾幼体又增加了交替假单胞菌和曲挠杆菌,到仔虾期又增加了根瘤菌和哈维氏弧菌;成虾和亲虾则以弧菌和杆菌为优势菌,细菌种类也增加了坎贝尔弧菌、交替假单胞菌、发光杆菌、微小杆菌和鞘氨醇单胞菌数种。中国对虾肠道细菌的安全性研究:本试验分别给中国对虾(Penaeus chinensis)注射从健康中国对虾肠道内分离的几株可培养细菌PC070460、PC070461、PC070462、PC070463、PC070368、PC070370、PC070373、PC070374、PC070375和PC070376,计算其累计死亡率,观察它们对中国对虾的安全性。结果显示:高剂量的菌株PC070461和PC070374对中国对虾有致病性(P<0.05),而低剂量的PC070461和PC070374却使中国对虾的累计死亡率降低,对对虾起到保护作用;菌株PC070462和PC070373对中国对虾有保护作用,能显着提高中国对虾成活率(P<0.05);低剂量的菌株PC070463对中国对虾有明显的保护作用(P<0.05),而高剂量的却无此作用;菌株PC070376为对虾弱毒菌,该菌对中国对虾有一定的致病性。4株对虾肠道益生菌的分离及筛选:用体外拮抗试验的方法,先从不同生长阶段的对虾肠道中分离的96株细菌中筛选出4株对病原菌(鳗弧菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌等)有拮抗作用的细菌。通过固体扩散法和液体混合法确定其拮抗作用,之后进行安全性实验,证明它们对对虾无害。进行了常规生理生化和细菌鉴定系统测试,并测定了其16S rRNA基因序列,分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了系统发生树,最终鉴定结果为:LV060806、LV060808为Vibrio natriegens;LV060810、LV060815为Vibrio alginolyticus。WSSV感染过程中凡纳滨对虾的免疫特性分析:以WSSV感染的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为材料,分别用化学方法、基因定量方法比较了酚氧化酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、抗菌肽、溶菌酶等免疫因子在攻毒后各时间段的相对活性。结果显示:凡纳滨对虾受病原刺激后,各免疫指标随虾体健康程度改变有明显的应激反应,且变化显着。在受低剂量WSSV感染后,5 d内各组酶活力均升高,明显高于对照组(P<0.05),5 d后便低于对照组或与对照组处于同一水平。受高剂量WSSV感染后,酚氧化酶和溶菌酶活力均升高,而且显着高于对照组水平(P<0.05),直到实验结束;酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、抗菌肽活力则分别在WSSV感染后升高,明显高于对照组水平(P<0.05),而1 d后降至低于对照组水平。由此证实WSSV感染对虾时,其血清酚氧化酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、抗菌肽、溶菌酶都会发生明显的变化,且这种变化的整体趋势是先高后低,但升高维持的时间随着免疫因子的不同,病毒感染剂量的高低有所不同。结果提示以上免疫指标,尤其是溶菌酶和抗菌肽的基因表达可作为WSSV感染的敏感指标,进一步研究病毒感染的分子机理,或作为筛选对虾免疫活性物质的依据。WSSV感染对克氏原螯虾血细胞吞噬和肝胰腺磷酸酶活性的影响:本试验分析了人工感染白斑综合征病毒(White Spot Syndrom Virus, WSSV)后,克氏原螯虾(Procambarus clarkia)血细胞吞噬(Phagocytosis),肝胰腺酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)的变化,为WSSV感染与螯虾的免疫防御反应等研究提供依据。结果显示:随着WSSV感染克氏原螯虾时间的延长,血细胞吞噬活性,肝胰腺ACP和AKP活性也随之改变,其中血细胞吞噬活性的变化规律更为明显,可以用于间接指示克氏原螯虾的健康状况指标。而ACP与AKP的变化规律并不十分明显,在不同的感染时间内其变化规律不同。鳗弧菌疫苗对中国对虾鳗弧菌人工感染的免疫保护作用:本试验分别给中国对虾(Penaeus chinensis)注射鳗弧菌灭活疫苗和鳗弧菌疫苗在牙鲆体内产生的抗血清,之后注射鳗弧菌,计算其累计死亡率与保护率,观察它们对中国对虾的免疫保护情况。结果显示:鳗弧菌疫苗和抗体均对中国对虾有一定的免疫保护作用,其累计死亡率分别为25.82%、9.09%,均显着低于对照组(P<0.05),在7 d内抗体的保护作用更强一些,其免疫保护率达80.45%。
赵君[4]2007年在《中国对虾（Penaeus chinensis）孵化酶的分离纯化、性质及其鉴定研究》文中指出在早期胚胎发育过程中,许多种动物的胚胎周围都包被有一层保护性外膜,称之为卵壳。发育到特定阶段后,胚胎必须从这层膜的包围中解脱出来,才能进一步生长和发育,这种脱出称为孵化。孵化酶(HE)是由动物早期孵化胚胎中孵化腺细胞特异性分泌的、在孵化过程中起关键作用的一种蛋白酶,它是研究早期胚胎发育过程中特定阶段特定蛋白质的基因表达及其调控机制的一个理想分子模型,查清孵化酶的性质对于研究动物的孵化机制以及动物孵化率的控制技术具有重要的理论意义。目前,对动物孵化酶的研究主要集中在两栖类和鱼类动物中,对对虾孵化酶的研究极少。为了查清中国对虾孵化酶的性质,本文首次利用凝胶过滤和离子交换柱层析对中国对虾孵化酶进行了分离纯化,并以酪蛋白和孵化酶特异性底物卵膜对其生化性质和酶性质进行了研究,进而用免疫组化和电镜技术对孵化前后胚胎中的孵化酶和分泌细胞进行了初步鉴定。本文利用67%硫酸铵沉淀、Sephacryl凝胶过滤柱层析和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析,经过卵膜降解活性鉴定,从中国对虾胚胎孵化液中成功纯化出了中国对虾孵化酶,所得纯化样品的得率为44.29%,纯化倍率为48.05,其在SDS-PAGE电泳中的分子量约为43 kD,该酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH值为6.0,其对酪蛋白降解活性的Km值为7.47 mg/ml。抑制剂对其酶活性的影响结果显示,该孵化酶的活性几乎可被SBTI、p-APMSF、Bestatin和NEM所完全抑制,被ovomucoid、TLCK、IAM、chymostatin和PMSF所强烈抑制,而对pepstatin A、TPCK、LBTI和leupeptin不敏感,表明该酶极可能是一种属于胰蛋白酶类型的丝氨酸蛋白酶。EDTA、DETC和几种金属离子对该酶活性的影响结果发现,该酶对EDTA、DETC、Zn~(2+)、Ca~(2+)、Mg~(2+)和Cu~(2+)非常敏感,表明该孵化酶有可能是一种金属蛋白酶。金属离子的活性回复结果显示,为EDTA所抑制的孵化酶活性几乎可被10mmol/l Zn~(2+)完全回复,进一步证明中国对虾孵化酶很可能是一种Zn -金属蛋白酶。为了验证从中国对虾胚胎孵化液中分离纯化孵化酶的实验方案以及所得酶为中国对虾孵化酶,本文利用免疫组化和电镜技术对中国对虾孵化酶在孵化期胚胎中的出现情况及分泌细胞的超微结构进行了研究。免疫组织化学染色结果显示,在中国对虾孵化期胚胎中,出现了大量的孵化酶;透射电镜研究结果显示,在中国对虾孵化期胚胎中,出现了含有大量酶原颗粒的孵化腺细胞;说明中国对虾胚胎在孵化期合成了大量的孵化酶,也证明本文利用中国对虾胚胎孵化液分离纯化孵化酶的实验方案是切实可行的。综合上述研究结果以及在中国对虾孵化酶分离纯化时使用了孵化酶的特异性底物——卵膜,从而证实本文从中国对虾胚胎孵化液中分离纯化出的酶为中国对虾孵化酶,该酶极可能是一种属于Zn -金属蛋白酶类型的胰蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶。中国对虾孵化酶性质的查明,为进一步研究中国对虾孵化机制及其孵化率提高技术奠定了理论基础。
李义[5]2007年在《中华绒螯蟹新型免疫调节剂及其酚氧化酶的纯化和性质研究》文中进行了进一步梳理本文综述了甲壳动物免疫防御机制研究的现状及最新进展,首次比较系统地研究了左旋咪唑、米糠多糖、山药多糖及CpG寡脱氧核苷酸(ODN-2006)对中华绒螯蟹(Eriociteir sinensis)免疫功能和抗病力的影响;探讨了ODN-2006触发中华绒螯蟹血细胞酚氧化酶原激活系统的信号转导机制;从中华绒螯蟹血细胞破碎物上清液中分离纯化到了酚氧化酶并对其生物化学性质进行了研究。现将研究结果总结如下:(1)左旋咪唑对中华绒螯蟹免疫功能及抗病力的影响为研究饲料添加左旋咪唑(levamisole,LMS)对中华绒螯蟹的免疫调节作用,以0(对照)、100、200和300mg·kg~(-1)干饲料的剂量将LMS添加于基础饲料中,制成颗粒饲料投喂中华绒螯蟹7 d,然后投喂不含LMS的对照组饲料。在投喂含LMS的饲料之前(0周)和投喂后2、4、6、8周,采样测定中华绒螯蟹的血细胞总数(THC)、不同血细胞数量(DHC)、吞噬活性、呼吸爆发(超氧阴离子的释放)、酚氧化酶(PO)活性和溶菌酶(LSZ)活性;并在投喂含LMS的饲料后的第4周,按1.2×10~7 cfu·kg~(-1)体重的剂量,体腔注射接种中华绒螯蟹致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)CL99920菌株,记录接种10d后中华绒螯蟹的累积死亡率。结果显示,各LMS处理组的THC、透明细胞(HC)数量、吞噬百分率(PP)、呼吸爆发、PO活性和LSZ活性均显着地高于对照组(P＜0.05);颗粒细胞(GC)数量、血细胞吞噬指数(PI)与对照组无显着差异(P＞0.05);LMS处理的中华绒螯蟹对嗜水气单胞菌的抵抗力明显增强。由此表明,饲喂适量的LMS可增强中华绒螯蟹的免疫力和抗病力;在试验条件下,200 mg·kg~(-1)干饲料的剂量为最适添加剂量;LMS可作为中华绒螯蟹的新型免疫调节剂在疾病预防中使用。(2)两种植物多糖对中华绒螯蟹免疫功能的调节作用为研究饲料添加米糠多糖(Rice bran polysaccharide,RBP)和山药多糖(Chinese yam polysaccharide,CYP)这两种高等植物多糖对中华绒螯蟹免疫功能的调节作用,将RBP、CYP按0(对照)、1.0、2.0和4.0 g·kg~(-1)干饲料的剂量添加于基础饲料中投喂中华绒螯蟹,采取间隔投喂的策略,即每投喂7天试验饲料后再投喂7天对照饲料,整个试验持续6周。在试验开始后1、2、4、6周采样,对中华绒螯蟹的一系列免疫学参数进行测定,并在试验开始后2周,按1.2×10~7 cfu·kg~(-1)体重的剂量,体腔注射接种中华绒螯蟹致病性嗜水气单胞菌CL99920菌株,记录接种7 d后中华绒螯蟹的累积死亡率。结果显示,饲料添加2.0～4.0 g·kg~(-1)的RBP、1.0～2.0 g·kg~(-1)的CYP能显着地提高中华绒螯蟹的THC和HC数量(P＜0.05),显着地增强血细胞的吞噬活性和HIS的PO活性(P＜0.05),显着地提高血清POD、SOD、ACP、ALP活性及抗菌活性(P＜0.05),并能明显地增强中华绒螯蟹对嗜水气单胞菌的抵抗力,但对血清LSZ活性的影响没有规律性。上述结果表明,饲喂2.0～4.0 g·kg~(-1)的RBP或1.0～2.0 g·kg~(-1)的CYP能显着地增强中华绒螯蟹的免疫功能和抗病力;两种植物多糖可作为中华绒螯蟹的新型免疫调节剂在养殖生产中试用。(3) CpG寡脱氧核苷酸对中华绒螯蟹免疫功能的调节作用将ODN-2006(含3个CpG基序)、ODN-R(含1个反向CpG基序)按0(对照)、1、5和25μg·kg~(-1)体重的剂量体腔注射中华绒螯蟹(0.1 mL·只~(-1)),同时设注射等体积的0.85%生理盐水的对照组,研究了两种ODN对中华绒螯蟹免疫功能的调节作用。在注射ODNs或生理盐水之前(0 d)和注射后第1、3、5、8 d采样,对中华绒螯蟹的一系列免疫学参数进行测定,并在注射ODNs后第3 d,按1.2×10~7 cfu·kg~(-1)体重的剂量,体腔注射接种中华绒螯蟹致病性嗜水气单胞菌CL99920菌株,记录接种7 d后中华绒螯蟹的累积死亡率。结果显示,25μg·kg~(-1)ODN-2006能显着地提高中华绒螯蟹的THC、吞噬活性和呼吸爆发活性(P＜0.05),显着地增强血清PO、SOD、ACP、ALP、溶血素及抗菌活性(P＜0.05),但对中华绒螯蟹的DHC、血清POD及LSZ活性没有显着影响(P＞0.05)。此外,25μg·kg~(-1)ODN-2006能明显地增强中华绒螯蟹对致病性嗜水气单胞菌的抵抗力。与此相对,25μg·kg~(-1)ODN-R除对血清PO活性具有显着的增强作用外(P＜0.05),对其他免疫学参数没有明显的影响(P＞0.05)。上述结果表明,ODN-2006能显着地增强中华绒螯蟹的免疫功能和抵抗力,是中华绒螯蟹潜在的新型免疫调节剂,可进一步加以研发和利用。(4) CpG寡脱氧核苷酸触发中华绒螯蟹proPO激活系统的信号转导途径以0、5、10、15、20和25μg·mL~(-1)浓度的ODN-2006体外处理中华绒螯蟹血细胞30min,研究了ODN-2006对中华绒螯蟹PO活性的影响。结果显示,10μg·mL~(-1)以上浓度的ODN-2006能显着地增强血细胞胞内外受ODN刺激的PO(PO_S)活性及胞外总PO(PO_T)活性(P＜0.05),但胞内PO_T活性有所下降;ODN-2006诱导的胞内外PO活性的上升或下降均显示出剂量依赖性。由此表明,在试验条件下,ODN-2006能刺激中华绒螯蟹血细胞脱颗粒,但不能刺激血细胞合成新的proPO。进一步以10μg·mL~(-1)ODN-2006和一定浓度的特异性信号激活剂或抑制剂分别单独或联合体外处理中华绒螯蟹血细胞30 min,通过检测血细胞胞内外PO活性的增减情况,对ODN-2006触发proPO激活系统的信号转导途径进行了探讨。结果显示,用氟化钠(G蛋白激活剂)处理血细胞,胞内外PO_T活性均增加;用8-Br-cAMP(PKA激活剂)或咖啡因(磷酸二酯酶抑制剂)或白屈菜赤碱(PKC抑制剂)处理血细胞,胞内PO_T活性增加,胞外PO_T活性下降;用佛波酯(PMA,PKC激活剂)处理血细胞,胞外PO_T活性增加,胞内PO_T活性下降;用叁羟基异黄酮(酪氨酸蛋白激酶抑制剂)处理血细胞,胞内外PO_S活性及胞外PO_T活性均上升,胞内PO_T活性下降。当用白屈菜赤碱和ODN-2006或PMA共同处理血细胞时,白屈菜赤碱对ODN或PMA诱导增强的胞内外PO_S活性及胞外PO_T活性具有较强的抑制作用。此外,试验发现氟化钠、PMA及叁羟基异黄酮与ODN-2006对血细胞脱颗粒具有协同刺激作用,ODN-2006可部分地解除被8-Br-cAMP、咖啡因或白屈菜赤碱对血细胞脱颗粒的抑制作用。上述结果表明,ODN-2006可能经由G-蛋白介导的PKC途径活化中华绒螯蟹血细胞proPO系统,并通过酪氨酸蛋白激酶途径进行负调控。(5)中华绒螯蟹酚氧化酶的分离纯化及其生物化学性质以中华绒螯蟹的HLS为材料,利用凝胶过滤和离子交换层析等方法,对中华绒螯蟹的酚氧化酶(PO)进行了分离纯化和生物化学性质研究。试验发现,中华绒螯蟹酚氧化酶原(proPO)的相对分子质量约为76.4 kDa,在试验操作过程中极易发生降解或自身降解,变成有活性的大小约70.1 kDa的PO。以L-二羟苯丙氨酸(L-DOPA)为特异性底物对PO活性进行研究发现,中华绒螯蟹PO的最适温度为40℃,最适pH值为7.0,对L-DOPA和邻苯二酚的K_m值分别约为2.63 mmol·L~(-1)和6.25 mmol·L~(-1)。中华绒螯蟹PO对苯硫脲极为敏感,对硫脲、半胱氨酸、抗坏血酸及苯甲酸也很敏感。根据中华绒螯蟹PO对抑制剂的敏感性和对底物的亲和力,将其鉴定为邻二酚氧化酶(o-diphenoloxidase)。中华绒螯蟹PO对胰蛋白酶抑制剂SBTI较为敏感,但几乎不受另一种胰蛋白酶抑制剂TLCK的影响,推测该酶在蛋白酶性质上与胰蛋白酶存在着一定的相似性。此外,中华绒螯蟹PO的活性可被二乙基二硫代氨基甲酸钠(DETC)、乙二胺四乙酸(EDTA)、Cu~(2+)、Zn~(2+)及Ca~(2+)强烈抑制,Cu~(2+)能有效地恢复被DETC或EDTA抑制的PO活性,表明该酶很可能是一种Cu-金属酶(Cu-metalloenzyme)。
王娟[6]2013年在《中国对虾、南美白对虾和斑节对虾肌肉营养成分的比较》文中研究指明对中国对虾、南美白对虾和斑节对虾肌肉的营养成分进行了测定,分析比较了其基本营养成分、脂肪酸和氨基酸的组成,并对其营养品质进行了评价。结果表明:斑节对虾的水分含量和粗脂肪含量高于中国对虾和南美白对虾,南美白对虾的粗蛋白含量高于中国对虾和斑节对虾。中国对虾、南美白对虾和斑节对虾中均检测到17种氨基酸,氨基酸总量分别为78.89%、80.67%和74.57%,鲜味氨基酸总量分别为30.83%、31.52%和29.11%。3种对虾的必需氨基酸指数分别为67.51、70.36和63.21,其中蛋+胱氨酸、异亮氨酸和缬氨酸均较低。棕榈酸和油酸分别是饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸中含量最高的脂肪酸,多不饱和脂肪酸中二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的总量分别为24.20%、24.69%和23.65%。
董世瑞[7]2006年在《形态标记与微卫星标记在中国对虾遗传选育中的应用研究》文中进行了进一步梳理通过遗传改良提高中国对虾的生长、抗病力等经济性状是对虾养殖的主要突破点。形态学标记(Morphological markers)具有易于识别和掌握、简单直观等优点,在遗传研究和品种选育上有重要的应用价值。分子标记突破了表现型的局限性,具有稳定性高、受环境条件的影响较小、信息含量高等特点。微卫星(microsatellite)以其数量多、分布广、多态性丰富、检测快速方便、共显性遗传等优点而被广泛应用于构建连锁图谱、个体识别、亲子鉴定、遗传多样性分析、疾病诊断、基因定位等诸多领域,是最具应用价值的标记技术之一。本论文应用形态标记和微卫星标记对中国对虾遗传选育中遇到的有关问题进行了探讨,为形态标记及分子标记技术应用于中国对虾新品种的培育提供借鉴,研究结果报道如下:1.测定中国对虾体长、全长、体重、头胸甲长、头胸甲宽、第一腹节高、第五腹节高、第六腹节长、额剑上刺数目、额剑下刺数目10个指标,计算了各性状间的相关系数。采用通径分析方法对各性状的影响大小进行剖分。结果表明,头胸甲宽对体重的直接影响最大。经显着性分析,剔除与体重多元相关不显着的性状,建立了体长、全长、头胸甲长、头胸甲宽、第五腹节高与体重的多元回归方程,此结果表明在中国对虾的选择育种中,体长、全长、头胸甲长、头胸甲宽、第五腹节高是对体重进行间接选择的理想的测度选育指标。2.在群体水平上,分析了两类中国对虾各8各微卫星位点的等位基因频率,选择5个微卫星标记,对家系鉴定的准确性及其应用价值做了研究。模拟分析表明4个微卫星标记可以鉴定95%的后裔,5个微卫星座位的累积排除率可以达到96%以上。单个养殖家系的研究结果表明,微卫星标记对家系的鉴定准确率达到92.9%。实测结果表明,在30个可能的父母对,215尾混养后代或在64个可能的父母对,304尾混养后代中,识别率分别达到90.7%和92.4%,证明微卫星标记可以应用于中国对虾的家系鉴定。模拟分析与实际应用的差异及父母与子代间的错配部分原因是由于无效等位基因的出现,基因分型错误也是一个重要原因。
韦嵩[8]2007年在《对虾免疫活性物质作用效果及机制的初步研究》文中认为近年来,严重的暴发性养殖虾类疾病,使我国水产业蒙受了巨大损失。在认识到使用抗生素等药物的负面影响后,人们己把注意力转移到调动或激活虾类自身的免疫系统。对虾的免疫机能与对虾的健康密切相关。免疫增强剂能提高动物的免疫机能,促进动物的健康,增强动物的抗病力。本试验分3个内容进行,旨在研究WSSV卵黄抗体[Ig-Guard(shrimp)]作为一种免疫增强剂,对中国对虾、凡纳滨对虾的非特异性免疫及抗病毒能力的影响,及对克氏原螯虾LD50的影响。WSSV卵黄抗体提高中国对虾抗白斑综合征病毒感染力的研究:在基础饲料中分别添加3个水平(1%、0.5%、0.1%)的Ig-Guard(shrimp)制成3种试验饲料,同时以基础饲料为空白对照,以P280 Premix为阳性对照。采用连续投喂的方法,饲喂中国对虾(Penaeus chinensis) 21 d,分别测定了第7,14,21 d血淋巴的酚氧化酶(PO)、溶菌酶(UL)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)活力,并对血蓝蛋白进行定量。结果显示这些免疫指标均能不同程度的被Ig-Guard (shrimp)促进。在免疫试验结束时,1% Ig-Guard (shrimp)组PO、UL、SOD活力与空白对照组均无显着差异(P>0.05),ACP活力与空白对照组有显着差异(P<0.05);PO、UL、SOD、ACP活力与阳性对照组均有显着(P<0.05)或极显着差异(P<0.01)。0.5% Ig-Guard (shrimp)、0.1% Ig-Guard (shrimp)组的PO、ACP、SOD与空白对照组均有极显着差异(P<0.01),0.5% Ig-Guard (shrimp)UL与空白对照组无显着差异(P>0.05),0.1% Ig-Guard (shrimp) UL与空白对照组有极显着差异(P<0.01);0.5% Ig-Guard (shrimp)组的UL、ACP、SOD活力与阳性对照组有极显着(P<0.01)或显着差异(P<0.05),PO活力与阳性对照组无显着差异(P>0.05),0.1% Ig-Guard (shrimp)组的四种免疫因子活力与阳性对照组均无显着差异(P>0.05)。在第21 d,用白斑综合征病毒(WSSV)投喂感染。虽然感染后的11 d内,免疫组对虾和对照组对虾均全部死亡,但是相对于对照组来说Ig-Guard(shrimp)对对虾的死亡具有一定的延迟作用,尤其是低剂量攻毒时的0.1%剂量组,效果尤为明显。但是在高剂量攻毒的情况下,Ig-Guard(shrimp)并没有显示出很好的保护效果。WSSV卵黄抗体对凡纳滨对虾免疫相关酶活力和抗病力影响的研究:在基础饲料中分别添加3个水平(1%、0.5%、0.1%)的Ig-Guard (shrimp)制成3种试验饲料,同时以基础饲料为空白对照。采用连续投喂的方法,饲喂凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) 20 d,分别测定了第5,10,15,20 d血淋巴的酚氧化酶(PO)、溶菌酶(UL)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)及肌肉匀浆液的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等非特异性免疫因子活性,并对血清及肌肉匀浆液中蛋白进行定量。结果表明,免疫组的PO、UL、ACP、AKP、SOD、CAT活力均显着高于对照组(P<0.05)。到免疫试验结束时,1% Ig-Guard (shrimp)、0.5% Ig-Guard (shrimp)两组的PO活力与对照组无显着差异(P>0.05),0.1% Ig-Guard (shrimp)组与对照组有显着差异(P<0.05);0.5% Ig-Guard (shrimp)组UL活力与对照组有显着差异(P<0.05),1% Ig-Guard (shrimp)、0.1% Ig-Guard (shrimp)两组与对照组均无显着差异(P>0.05);1% Ig-Guard (shrimp)组ACP活力与对照组无显着差异(P>0.05),0.5% Ig-Guard (shrimp)和0.1% Ig-Guard (shrimp)组分别与对照组有显着差异(P<0.05)和极显着差异(P<0.01);1% Ig-Guard (shrimp)、0.5% Ig-Guard (shrimp)、0.1% Ig-Guard (shrimp)叁组的AKP活力与对照组均有极显着差异(P<0.01);1% Ig-Guard (shrimp)、0.5% Ig-Guard (shrimp)、0.1% Ig-Guard (shrimp)叁组的SOD、CAT活力与对照组无显着差异(P>0.05)。免疫20 d后,用白斑综合征病毒(WSSV)投喂感染。攻毒后第7 d各免疫组的相对免疫保护率分别为17.95%、23.08%、35.90%。结果说明,Ig-Guard (shrimp)能有效提高对虾免疫因子的活性,对于提高抗WSSV感染能力也有一定作用。WSSV卵黄抗体保护克氏原螯虾防御白斑综合征病毒的研究:在基础饲料中分别添加3个水平(1%、0.5%、0.1%)的Ig-Guard (shrimp)制成3种试验饲料,同时以基础饲料为空白对照。以克氏原螯虾(Procambarus clarkii)为模式动物,采用连续投喂的方法,免疫21 d后,用白斑综合征病毒(WSSV)肌肉注射感染。注射相同稀释浓度的螯虾,其死亡率与添加Ig-Guard (shrimp)的剂量呈负相关,即添加Ig-Guard (shrimp)剂量越高,其死亡率越低;免疫组螯虾的半数致死剂量(LD50)高于对照组的半数致死剂量,而且其效果随着免疫剂量的增加而越来越明显。结果说明,Ig-Guard (shrimp)能延迟螯虾的死亡时间,在一定程度上对于提高抗WSSV感染能力有一定作用。对于特异性免疫系统尚不明确的对虾来说,信号识别蛋白在防御病原微生物过程中的作用尤为重要。到目前为止,已经成功地从对虾体内分离出β-1,3-葡聚糖结合蛋白(βGBP)、脂多糖结合蛋白(LBP),但是始终没有关于对虾肽聚糖识别蛋白(PGRP)的报道。我们之前的研究证实肽聚糖和Ig-Guard (shrimp)类似,也能够激活对虾体内酚氧化酶系统的活性及其它非特异性免疫因子活性,提高抗病力,这意味着PGRP有可能在对虾中存在。为了证明这一推测,我们分别用RT-PCR和PCR的方法,尝试克隆对虾PGRP基因,并对其进行初步的研究,但没有成功克隆出PGRP基因,本文也对此原因进行了初步的分析。
王丹[9]2007年在《逆转录病毒介导法将SV40LT基因导入中国对虾淋巴细胞的初步研究》文中研究说明近年来由于对虾病害的威胁,对虾养殖产业的发展受到了严重的影响。为了深入研究对虾病毒和发展有效的疾病防治策略,建立对虾细胞系的要求日益迫切。本文采用逆转录病毒介导的方法将细胞转化基因-猿猴病毒大T抗原基因(SV40LT)导入培养的中国对虾(Penaeus Chinensis)淋巴细胞(lymphoid cells)中,尝试对其进行转化培养。本研究旨在探索对虾细胞体外培养的可行技术,为对虾细胞的建系工作奠定基础。从携带SV40LT基因的质粒pLLTSN中高保真PCR扩增出2.1 Kb的SV40LT基因,将其插入到泛嗜性逆转录病毒载体(pantropic retroviral vector)pLXRN的BamHⅠ和XhoⅠ位点之间,构建重组载体pLXRN-SV40LT。酶切分析和测序验证结果表明,载体插入基因的位置、大小、序列均正确,成功构建重组泛嗜性逆转录病毒表达载体pLXRN-SV40LT。采用磷酸钙沉淀法将重组载体pLXRN-SV40LT与包装质粒pVSV-G共转染GP2-293细胞,病毒包装48小时后收集上清。经NIH3T3细胞测定,重组病毒的滴度为4×106 cfu/ml。以重组病毒感染原代培养的中国对虾淋巴细胞,经G418筛选阳性细胞后传代培养。细胞培养结果表明,转基因细胞株具有贴壁能力下降,从壁上脱落的细胞可悬浮生长等转化细胞的特征,传至10代时,其生长状态和分裂势头仍很好,而对照细胞只能传至3代;转基因细胞株传至12代时因真菌污染而丢失。PCR法检测第10代转基因细胞株基因组中的SV40LT基因,结果表明成功扩增出270 bp SV40LT片段,证实转基因细胞株基因组中较稳定的含有SV40LT基因;采用端粒重复序列扩增法(TRAP)分析转基因细胞株的端粒酶活性,聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,转基因细胞株的端粒酶活性明显高于原代对照细胞,这从一个侧面反映了转基因对虾细胞株获得了转化的特性。本研究有希望发展成为建立对虾永生化细胞系的可行技术,同时为探索其他海洋无脊椎动物细胞的建系方法提供了有益的借鉴。
战文斌, 俞开康, 孟庆显[10]1995年在《中国对虾（Penaeus chinensis）杆状病毒病的研究》文中进行了进一步梳理１９９３年养殖的中国对虾（Ｐｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）发生了暴发性流行病，经人工感染和电镜观察，证实是由杆状病毒引起的。病虾活力差，体色暗淡或微红，头胸甲上有浅黄色至白色的斑点，头胸甲与表皮不粘连，容易剥离，血淋巴混浊，淋巴器官和肝胰腺肿大、糜烂。在肝胰腺、淋巴器官、中肠、皮下组织和鳃等组织细胞的核内均发现有大量病毒粒子。病毒粒子杆状，无包涵体，具囊膜，平均长３５０ｎｍ，宽１５０ｎｍ，核衣壳长３００ｎｍ，宽１００ｎｍ。暂将这种病毒定名为中国对虾杆状病毒（Ｐｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ，简称ＰＣＢＶ）。
参考文献：
[1]. 中国对虾（Penaeus chinensis）酚氧化酶的生物化学性质及几种免疫促进剂对中国对虾酚氧化酶和血细胞的影响[D]. 汪小锋. 中国海洋大学. 2002
[2]. 中国对虾（Penaeus chinensis）主要过敏原的鉴定及性质研究[D]. 王晓斐. 中国海洋大学. 2008
[3]. 对虾肠道益生菌的筛选与免疫物质活性评价指标的建立[D]. 李海兵. 中国海洋大学. 2008
[4]. 中国对虾（Penaeus chinensis）孵化酶的分离纯化、性质及其鉴定研究[D]. 赵君. 中国海洋大学. 2007
[5]. 中华绒螯蟹新型免疫调节剂及其酚氧化酶的纯化和性质研究[D]. 李义. 南京农业大学. 2007
[6]. 中国对虾、南美白对虾和斑节对虾肌肉营养成分的比较[J]. 王娟. 食品科技. 2013
[7]. 形态标记与微卫星标记在中国对虾遗传选育中的应用研究[D]. 董世瑞. 中国海洋大学. 2006
[8]. 对虾免疫活性物质作用效果及机制的初步研究[D]. 韦嵩. 中国海洋大学. 2007
[9]. 逆转录病毒介导法将SV40LT基因导入中国对虾淋巴细胞的初步研究[D]. 王丹. 中国海洋大学. 2007
[10]. 中国对虾（Penaeus chinensis）杆状病毒病的研究[J]. 战文斌, 俞开康, 孟庆显. 中国水产科学. 1995