刘莉 魏武杰 李黎 马燕凌△（通讯作者）
湖北省第三人民医院肿瘤科 湖北武汉 430030
【摘 要】目的：检测结肠癌中UCA1的表达，探讨其与肿瘤转移的关系。方法：应用实时荧光定量PCR的方法检测94例结肠癌及其配对癌旁正常组织中UCA1的表达，统计学分析其表达与结肠癌转移的关系。结果：统计学分析表明结肠癌组织与配对癌旁正常组织比较UCA1表达都有显著升高（P<0.01）；结肠癌转移灶中UCA1表达亦升高。结论 UCA1与结肠癌转移明显相关，可作为结肠癌复发和转移倾向的新标记物
【关键词】结肠癌；长链非编码RNA；UCA1
结肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤。探索早期预示结肠癌复发和转移倾向的新标记物，对结肠癌患者生存率和生活质量的改善是非常重要的。一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA—长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）也可作为的预示转移的新标记物[1-3]。本研究收集了2014.1-2016.1在我院手术的共94例的结肠癌标本发现在结肠癌细胞株中存在三种lncRNA—UCA1、Malat-1和MEG3的表达异常[4]。其中UCA1在结肠癌组织中表达较癌旁正常组织明显增高；在已有淋巴结转移的结肠癌组织中较无淋巴结转移结肠癌组织中表达水平高，因此UCA1可能可作为新的预示结肠癌转移的标记物分子。
1.实验方法：
1.1实验中使用的细胞株、培养基、质粒、siRNA和转染手段
实验中用的结肠癌细胞株有：SW620和LoVo结肠癌细胞株（购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）。实验中使用的培养基有RPMI-1640、DMEM、胎牛血清等，均购自美国Gibco公司；青链霉素溶液、胰酶等购自Corning公司（美国）。UCA1的表达载体pcDNA3/UCA1和UCA1的siRNA（Si-UCA1）都已经由上海申工生物工程有限公司合成。使用美国Invitrogen公司lipofectamine 2000转染质粒和siRNA，对照组细胞均使用空载体或无意义链（nonsense siRNA）同时转染。
1.2 细胞生物学行为的检测
1.2.1 细胞转染载体或siRNA：SW620和LoVo结肠癌细胞铺于六孔板后，待细胞生长至90-95%时分别采用lipofectamine2000转染pEGFP-C1-MALAT1/shf、pcDNA3/UCA1、pcDNA3/MEG3、pcDNA3空载体、三种lncRNA的siRNA及nonsense siRNA后16或24小时进行后续实验。
1.2.2 细胞内UCA1表达水平的测定：主要使用实时荧光定量PCR的方法，使用的引物为序列如下表所示，ACTB为内参基因。
用于扩增目的lncRNA和对照基因的引物序列
2.结果
2.1结肠癌组织较癌旁正常组织MALAT-1和UCA1的表达升高
本实验收集了2014.1-2016.1共94例的结肠癌标本（癌和癌旁正常组织配对），在预实验中选取一定数量标本（n=34）检测了一系列肿瘤相关的lncRNA，并使用GraphPad Prism（Version 5）软件分析。结果如图1所示，结肠癌组织较癌旁正常组织MALAT-1和UCA1的表达升高（p<0.05），而MEG3的表达降低（p<0.05）。其中，由于UCA1的表达升高更为明显，课题组在全部94例结肠癌组织和配对癌旁正常组织中检测UCA1的表达，发现结肠癌组织中UCA1的表达较癌旁正常组织显著升高（图1B，p<0.0001）。
图1. 结肠癌组织与配对癌旁正常组织中HULC、MALAT-1、NEAT1、MEG3、HOTAIR和UCA1长链非编码RNA相对表达水平的比较，纵坐标为目的lncRNA表达量与ACTB内参基因表达量的比值。
2.2 结肠癌转移灶中UCA1表达升高
本实验同时比较了有淋巴结转移和无淋巴结转移结肠癌组织中UCA1的表达水平，结果如图2A所示，有淋巴结转移的结肠癌组织中UCA1的表达水平相对较高（p=0.0379）。同时课题组也比较了有淋巴结转移的结肠癌样本中原发灶和转移灶中UCA1表达的水平，结果发现转移灶中UCA1的表达水平较配对的原发灶高（图2B，p=0.0171）。这些结果表明结肠癌中UCA1的表达水平与结肠癌转移倾向有非常密切的关系。
图2. UCA1的表达水平与结肠癌转移倾向正相关。A. 有淋巴结转移和无淋巴结转移结肠癌组织中UCA1相对表达水平比较，纵坐标为癌组织与癌旁正常组织中表达量的比值；B、有淋巴结转移样本中配对的转移灶和原发灶之间的UCA1相对表达水平比较，纵坐标为UCA1表达量与ACTB表达量比值。
3.讨论
目前关于结肠癌中lncRNA研究的报道很少，相关分子机制研究也处在起步阶段。本研究发现结肠癌细胞中存在三种lncRNA—UCA1、Malat-1和MEG3的表达异常。其中UCA1和MALAT-1在结肠癌组织中表达较癌旁正常组织明显增高；在已有淋巴结转移的结肠癌组织中较无淋巴结转移结肠癌组织中表达水平升高，淋巴结转移灶中表达较原发灶高。这些都提示了UCA1和MALAT-1等lncRNA在结肠癌转移过程中的作用。
当然，我们还需要进一步综合体外和体内实验研究UCA1对结肠癌细胞的增殖、侵袭、转移和凋亡等生物学行为的影响，分析其在结肠癌发展过程中的作用，研究其作用的分子机制，研究其在结肠癌中异常表达的调控机制。更深入地阐明结肠癌发生发展过程中lncRNA发生异常表达的原因、产生的影响、内在的分子机理和潜在的干预手段，为结肠癌中lncRNA的研究提供更多的实验数据，为结肠癌的侵袭转移的早期判断和基因靶向治疗等提供全新的线索。
参考文献：
[1]Zhang J，Zhang P，Wang L，Piao HL，Ma L. Long non-coding RNA HOTAIR in carcinogenesis and metastasis. Acta biochimica et biophysica Sinica. 2014；46（1）：1-5.
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[4]Wang XS，Zhang Z，Wang HC，Cai JL，Xu QW，Li MQ，Chen YC，Qian XP，Lu TJ，Yu LZ，Zhang Y，Xin DQ，Na YQ，Chen WF. Rapid identification of UCA1 as a very sensitive and specific unique marker for human bladder carcinoma. Clinical cancer research：an official journal of the American Association for Cancer Research. 2006；12（16）：4851-8.
通讯作者：
马燕凌，硕士学历，副主任医师，研究方向：肿瘤内科学。
论文作者:刘莉,魏武杰,李黎,马燕凌△（通讯作者）
论文发表刊物:《航空军医》2016年第12期
论文发表时间:2016/7/20
标签：结肠癌论文; 组织论文; 淋巴结论文; 水平论文; 转染论文; 细胞株论文; 纵坐标论文; 《航空军医》2016年第12期论文;