白氡[1]2003年在《神经营养素低亲和力受体p75NTR信号传导及诱导细胞凋亡的相关基因的功能研究》文中进行了进一步梳理神经营养素低亲和力受体p75NTR是神经元细胞表面的一种糖蛋白，可以以相似的亲和力和各个神经营养素结合，但其胞内区无激酶活性，因此，在细胞内介导的信号通路一直是研究的热点之一。p75NTR属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族，其共有的特征就是胞外区的半胱氨酸串，及胞内区长约80个氨基酸的死亡结构域(death domain)。含有死亡结构域或类死亡结构域的蛋白可以相互或与某些蛋白作用，从而进行信号传导。p75NTR可以不依赖高亲和力受体Trk独立进行信号传递，诱导细胞凋亡。在神经系统的发育过程中，大量神经元细胞竞争有限的促进存活的神经营养素，导致一部分细胞死亡，而细胞凋亡的异常可能也是一些神经系统退行性疾病(如阿尔海茨默病、帕金森氏病)中神经元细胞大量消失的原因。因此，研究p75NTR诱导细胞凋亡的分子机制有着重要的意义。 首先，我们对p75NTR介导的信号通路进行了研究，通过酵母双杂交系统检测与p75NTR有相互作用的蛋白。该方法理论基础为：含有异源BD(DNA binding domain)和AD(transcriptionaI activation domain)的融合蛋白可以借助BD和AD的结合形成完整的反式作用因子，激活下游报告基因的转录。结果如下： 1，通过PCR扩增出完整的p75NTR胞内区的cDNA片段p75ICD，克隆至BD表达载体pAS2-1，与表达AD的鼠脑cDNA pACT2文库质粒共转化酵母Y190细胞，通过叁营养缺陷(-Trp-Leu-His)、双报告基因表达(His，Lacz)的双重筛选及假阳性的排除，得到多个阳性克隆。 2，对这些阳性克隆的测序及同源性分析显示，一个长约2.7 kb的cDNA片段与RanBPM高度同源，并有着相同的读码框架。 3，在哺乳动物细胞COS7中共转染p75ICD和RanBPM的真核表达载体，经免疫共沉淀和蛋白印记杂交检测到这两个蛋白的表达，并验证了它们在细胞内的结合。 4，通过PCR扩增出p75NTR胞内区的两个已知功能结构域的cDNA片段p75dd、p75jux，分别构建其酵母表达载体，通过检测His报告基因的表达，确认RanBPM与p75ICD的结合位点位于死亡结构域。 5，通过PCR扩增出RanBPM蛋白中的SPRY结构域cDNA片段，克隆至pACT2载体得到pACT2-SPRY，通过检测His报告基因的表达，确认：单独的SPRY结构
王艳芹[2]2009年在《p75NTR、sortilin在黑质多巴胺能神经元的表达及其参与细胞变性的病理作用研究》文中指出研究目的帕金森(Parkinson’s disease,PD)是以黑质多巴胺能神经元大量变性死亡为特征的严重神经退行性疾病,其神经元变性死亡的发生原因与病理机制,仍然是制约PD临床治疗的关键问题。研究表明p75神经营养素受体(p75 neurotrophin receptor, p75NTR)是肿瘤坏死因子受体家族的重要成员,以低亲和力与神经营养素(neurotrophins,NTs)结合,介导神经元存活、分化与髓鞘形成。近来发现NT前体分子如神经生长因子前体(pro-nerve growth factor, proNGF)能够以高亲和力结合p75NTR,并通过辅助受体sortilin的协助启动细胞凋亡,在脑发育和脑损伤神经元的凋亡中发挥重要作用。成年后p75NTR主要在某些病理状态下表达,如脊髓侧索硬化症(ALS)和阿尔茨海默病(AD)等,异常表达的p75NTR参与疾病过程中的神经元变性或细胞凋亡。但目前p75NTR与PD病理关系问题,仍是研究空白,本研究针对这一问题,探讨p75NTR与辅助受体sortilin在黑质的表达、细胞定位、KA损伤模型的动态变化、及其参与中脑黑质多巴胺能神经元变性死亡的病理作用,为揭示p75NTR、sortilin凋亡信号参与PD病理发展机制和疾病治疗新靶点提供依据。研究方法①采用红藻氨酸(kainic acid,KA)立体定位注射黑质建立兴奋性毒性损伤动物模型。②通过半定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测p75NTR、sortilin、proNGFmRNA在黑质表达及其损伤后的变化。③免疫细胞化学、双标记、及激光共聚焦显微镜观察等方法,研究p75NTR、sortilin、proNGF在黑质多巴胺能神经元的定位。④Western Blot分析p75NTR、sortilin、proNGF蛋白在黑质的表达情况与水平变化。⑤F luoro-Jade C(FJC)染色方法显示和计数分析黑质神经元变性死亡。⑥细胞内凋亡信号的分析初步观察JNK、AIF细胞内信号通路的参与问题。主要结果1.发现p75NTR、sortilin在黑质多巴胺能神经元的表达,KA损伤后导致其表达上调。①免疫细胞化学研究发现黑质p75NTR和sortilin的表达:在中脑黑质切片上,检测到p75NTR、sortilin阳性神经元,它们主要分布在黑质的致密部。双标记染色与激光共聚焦显微镜观察证明47%TH阳性神经元表达p75NTR,而sortilin表达于全部的TH阳性神经元。②RT-PCR实验证明黑质p75NTR、sortilin mRNA的表达:RT-PCR结果发现p75NTR、sortilin mRNA阳性条带,p75NTR条带大小为309bp,sortilin条带大小为438bp,与预期的结果相符。③KA损伤导致黑质p75NTR、sortilin表达上调: p75NTR mRNA相对光密度由正常黑质的0.489±0.079上升为1.06±0.11(p﹤0.01,t test);sortilin mRNA相对光密度由正常黑质的0.724±0.056上升为1.226±0.078(p﹤0.01,t test);KA损伤后p75NTR上调表达于所有的TH免疫阳性神经元,sortilin的细胞数由204±4上升到293±13,具有统计学差异(p﹤0.01)。2.p75NTR、sortilin表达上调参与KA损伤模型黑质多巴胺能神经元变性死亡①p 75NTR、sortilin共存于黑质多巴胺能神经元:在p75NTR/TH、sortilin/TH双标结果基础上,进一步观察到大量的p75NTR/sortilin双标记神经元分布在黑质致密部,这些双标记神经元占全部p75NTR神经元的71.8%。②proNGF免疫阳性存在黑质神经元及星形胶质细胞:免疫细胞化学结果显示proNGF定位于黑质致密部腹侧带的多巴胺神经元,并且发现proNGF定位于激活的星形胶质细胞。③p roNGF在KA损伤后呈现与p75NTR、sortilin共同上调现象: proNGF mRNA相对光密度由正常黑质0.18±0.037上升为0.703±0.059(p﹤0.01,t test); proNGF/TH双标细胞数由正常黑质40±5,增加到75±5,具有统计学差异(p﹤0.01)。④p 75NTR、sortilin、proNGF、FJC及TH阳性细胞在KA损伤后的d1、d3、d7天时的动态变化:细胞计数结果显示p75NTR、sortilin、proNGF逐渐增加,TH神经元逐渐减少,同时FJC标记的变性神经元逐步增加。p75NTR、sortilin、proNGF与TH的相关性检验结果显示,p75NTR、sortilin、proNGF与TH细胞的减少成负相关性,相关系数分别为-0.988、-0.998、-0.993。FJC的增加与TH的减少呈负相关,相关系数为-0.999。3. KA损伤后p75NTR上调启动细胞内凋亡信号途径①KA损伤后启动JNK信号途径: c-jun属于caspase依赖的信号途径,研究发现KA损伤后黑质c-jun表达明显增加,c-jun/TH双标细胞数由10±1增加到20±2;Western Blot显示c-jun蛋白相对表达量由0.749±0.048增加到1.087±0.109。KA损伤后c-jun的磷酸化水平增高,p-c-jun/TH的双标细胞由26±2增加到65±4。②KA损伤后诱导AIF表达增加: AIF属于caspase非依赖性的信号途径,发现AIF在KA损伤后细胞数明显增加,由正常195±3增加到243±14。而分布在黑质致密部AIF/TH阳性细胞由正常177±4减少到112±4。结论①首次发现p75NTR、sortilin在黑质多巴胺能神经元的表达与KA损伤后表达上调现象。②p 75NTR、sortilin表达上调参与了KA损伤模型黑质多巴胺能神经元变性死亡过程。③KA损伤模型中p75NTR、sortilin表达上调可能启动JNK和AIF等细胞内凋亡信号途径,导致神经元死亡。本研究初步阐明了p75NTR、sortilin作为凋亡信号参与黑质多巴胺能神经元变性死亡的病理作用,为进一步揭示PD发生和发展机制、探索PD治疗的新靶点提供了重要依据。
李玉茹[3]2005年在《神经营养素及其受体在老年性大鼠耳蜗及下丘中表达规律的研究》文中认为目的:通过对老年性大鼠耳蜗及下丘的神经营养素及其受体表达规律的研究,探讨神经营养素及其受体与老年性耳聋发生的相关性及其机理,为老年性耳聋大鼠病因学及治疗和预防方面的研究提供了理论依据和参照数据。方法:用RealTime PCR 定量,免疫组织化学方法定位和定性,并辅助定量。结果:定量分析结果显示,在老年性耳聋大鼠耳蜗内, BDNF 的表达与对照组相比明显减少。表达于神经元的trk B 没有明显差别。NT3 及其高亲和性受体trk C 没有明显差别。p75在老年性耳聋大鼠耳蜗神经元中表达明显增高。下丘内:BDNF 及NT3 在下丘中没有明显差别,trk B 及trk C 在老年性耳聋大鼠下丘中的表达高于老年组大鼠,后者还高于青年组。p75 在老年性耳聋大鼠下丘中的表达明显高于老年组大鼠和青年组。结论:神经营养素及其受体在听觉系统的表达水平与老年性聋的发生相关;神经营养素及其受体可能通过其相互作用参与细胞凋亡;老年性聋的发生可能与细胞凋亡的发生有关。
马巍[4]2017年在《NGF在绒山羊皮肤组织中的表达及其对次级毛囊外根鞘细胞增殖作用的研究》文中指出绒山羊次级毛囊的生长发育与绒毛生产数量和质量息息相关。毛用哺乳动物的毛囊的生长发育一般经历叁个阶段(休止期、生长期、退行期)周而复始的循环,它是一系列信号分子相互作用相互调控的结果,在这一过程中,外跟鞘(Outer root sheath,ORS)细胞的增殖被认为是毛囊生长发育的重要动力来源之一。近年来的研究发现,神经生长因子(nerve growth factor,NGF)除了在神经系统发挥作用以外,还在一些非神经系统发挥生物学功能,如有研究发现NGF可以影响小鼠毛囊的形态学变化,NGF及其受体存在于小鼠毛囊发育的不同阶段,说明NGF是小鼠毛囊发育过程中至关重要的一种因子。然而,作为重要的毛绒用动物—绒山羊的皮肤毛囊中是否存在NGF及其受体酪氨酸激酶A(tyrosine kinase A,TrkA),如果存在其功能又有哪些?绒山羊ORS细胞中是否是NGF的分泌细胞或作用靶细胞,NGF是否参与ORS细胞的增殖过程?针对上述假设本论文对此进行了系统的研究,并获得了相应的研究结果。1.NGF及其受体TrkA在绒山羊绒毛生长周期皮肤组织中的表达利用RT-PCR方法检测了皮肤组织中是否有NGF及其受体TrkAmRNA的表达,并利用实时荧光定量PCR和Western blot的方法对毛囊生长发育叁个阶段皮肤组织中NGF及其受体TrkA的表达进行定量分析。结果表明:NGF及其受体TrkA的mRNA存在于毛囊生长周期各阶段的皮肤组织中;生长期皮肤组织中NGF及其受体TrkA mRNA的表达水平显着高于休止期和退行期(p<0.05);生长期皮肤组织中NGF蛋白水平显着高于休止期和退行期(p<0.05),生长期TrkA的蛋白水平与休止期没有显着差异,但显着的高于退行期(p<0.05)。利用HE染色观察毛囊生长发育叁个阶段的绒山羊毛囊的形态。结果表明:在生长期,初级毛囊(Primary hair follicle,PF)和次级毛囊(Secondary hair follicle,SF)的数量要多于休止期和退行期,且毛囊结构完整、清晰;在退行期,PF和SF的数量显着降低。毛囊的结构松散,毛乳头(Dermal papilla,DP)、ORS和内根鞘(Internal root sheath,IRS)分层不清晰;在休止期,PF和SF的数量少,PF的ORS和IRS层清晰可见,但SF的ORS和IRS层不清晰。利用间接免疫荧光技术对NGF和TrkA的蛋白进行定位。结果表明:NGF和TrkA的蛋白存在于PF和SF毛囊生长周期的所有阶段;在生长期,在ORS和IRS细胞中检测到NGF的高表达,并且在ORS细胞中检测到TrkA的阳性信号。信号强度为生长期最高,休止期其次,退行期最低。2.NGF及其受体TrkA在体外培养绒山羊次级毛囊ORS细胞中的表达分离生长期绒山羊的SF,进行ORS细胞的体外分离与培养。结果表明:中性蛋白酶消化法分离毛囊省时省力,毛囊周围组织去除较干净,细胞不易污染;分离培养的ORS细胞于培养基中2~3天贴壁,细胞多呈多角形,少数为卵圆形,特异性蛋白CK19鉴定ORS细胞的特征,ORS细胞纯度在90%以上。利用间接免疫荧光技术发现ORS细胞中均可检测到NGF、TrkA的免疫活性,NGF在细胞核中的信号强度高于细胞质中,在细胞核中没有TrkA的免疫活性。利用ELISA方法发现体外培养的ORS细胞可以持续分泌NGF,但随着时间的延长,分泌量显着下降(p<0.05)。3.NGF对绒山羊次级毛囊ORS细胞增殖作用的研究通过外源性添加NGF重组蛋白及其受体阻断剂K252a的方法研究NGF对ORS细胞增殖的影响。结果表明:20ng/mL或100ng/mL的NGF重组蛋白可促进绒山羊次级毛囊ORS细胞的增殖,当用20ng/mL的K252a处理后,NGF的这种促增殖作用消失。说明NGF/TrkA系统可以以剂量依赖的方式促进ORS细胞的增殖。此外,我们利用细胞免疫荧光的方法研究了ORS细胞中是否存在环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)。结果表明:ORS细胞中检测到了CREB的免疫阳性信号,且细胞核中的信号强度强于细胞质中。外源性添加20ng/mL或100ng/mL NGF重组蛋白能显着的提高细胞中CREB的活性,且NGF提高细胞内CREB的活性依赖于NGF/TrkA。通过研究增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)mRNA的表达情况,发现NGF/TrkA系统在维持和促进PCNA表达过程中发挥着重要作用。综上所述,本论文证实了绒山羊毛囊组织中存在NGF及其高亲和力受体TrkA的mRNA和蛋白,且在毛囊生长期显着的高于其他时期。体外培养的外根鞘细胞能检测到NGF及其受体TrkA的蛋白,且在体外条件下,外根鞘细胞能持续分泌NGF。另外我们还发现NGF/TrkA路径影响转录因子CREB的活性,且这一路径影响增殖相关基因PCNA的表达。本研究结果初步探讨了NGF在毛囊中表达规律及其作用机制,为深入研究绒山羊绒毛生长机制提供了思路。
陈悦[5]2007年在《神经生长因子及其受体在形觉剥夺性近视中作用的实验研究》文中研究表明近视是眼科的常见病、多发病。高度近视又称病理性近视或变性近视。病理性近视病理改变主要有后巩膜葡萄肿、视网膜和脉络膜萎缩变性、黄斑变性、脉络膜新生血管、孔源性视网膜脱离等严重并发症而致失明。形觉剥夺性近视(form deprivation myopia，FDM)模型的建立，为探索近视的发病机制提供了新途径。形觉剥夺使存在于局部视网膜的多种神经递质与生长因子水平发生改变，它们通过互相平行或彼此交叉的途径发挥作用。经视网膜-脉络膜-巩膜复杂而精细的调控机制，作用于巩膜，引起巩膜生物化学和超微结构的改变，巩膜主动重塑，眼轴延长，引起轴性近视。随着眼轴长度进行性增长和眼底病变的发展，视网膜光感受器细胞减少，视网膜细胞的凋亡是退行性变性疾病的重要病理特征。现今对其光感受器细胞死亡的机制及相应的药物治疗尚缺乏深入细致的研究。神经生长因子(never growth factor，NGF)是神经营养素家族成员之一，具有调控神经元和非神经元的分化、增殖和维持其功能的双重作用。在视网膜感光细胞、视网膜神经节细胞、双极细胞叁级神经元均有表达。Nastri将抗鼠NGF免疫血清通过局部点眼的方式阻止了鸡近视的发展，提出了NGF可能参与近视形成的推测。已知NGF的受体p75NTR与神经细胞凋亡密切相关，外源性NGF抑制实验性视网膜脱离的视网膜细胞凋亡。本实验在建立豚鼠形觉剥夺性近视模型的基础上应用免疫组织化学和RT-PCR的方法从蛋白质和RNA水平研究NGF与受体TrkA、p75NTR在FDM中的动态表达，首先探讨NGF与TrkA在FDM中的发生、发展的关系，然后研究了FDM发展过程中视网膜光感受器细胞是否也存在细胞凋亡现象及凋亡基因p75NTR、Caspase-3蛋白和mRNA表达的变化，并观察了NGF对视网膜细胞的保护作用，探索治疗高度近视的新途径。最后研究了NGF对体外培养的人巩膜成纤维细胞的影响。第一部分神经生长因子及其受体在豚鼠形觉剥夺性近视的表达方法1．动物模型的建立：选用出生7天花色豚鼠80只。随机分为4组，每组20只。A组(遮盖2周)，B组(遮盖4周)，C组(遮盖8周)，D组(遮盖7周去遮盖1周)。每组10只用于HE染色及免疫组织化学检测，另10只用于RT-PCR检测。右眼以半透明眼罩遮盖作为遮盖眼，左眼不做任何处理为对照眼。2．屈光度及眼轴长度测量：分别于遮盖前、遮盖后2周、4周、8周及遮盖7周去遮盖1周，检影镜检测豚鼠双眼屈光状态，A型超声仪测定双眼轴长度。3．HE染色与形态学观察：光学显微镜下观察遮盖前后视网膜形态学变化。4．免疫组织化学染色检测：NGF蛋白、TrkA蛋白表达。5．逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测：视网膜NGF mRNA、TrkA mRNA的表达。6．统计学处理：应用SPSS12.0统计软件进行统计学处理，数据以均数±标准差((?)±s)表示，双眼比较采用配对t检验，组间比较采用单因素方差分析，取α=0.05作为检验标准。结果1．遮盖眼与对照眼屈光度及眼轴比较：遮盖眼由实验前远视眼演变为近视眼，并随遮盖时间延长，近视度数加深，眼轴延长。遮盖8周，遮盖眼屈光度(-4.38±1.11)D与对照眼(3.75±0.71)D相比，眼轴长(8.18±0.16)mm与对照眼(7.26±0.20)mm相比屈光度前后变化为8.13D，眼轴前后变化为0.92mm，差异有统计学意义(P＜0.01)。遮盖7周去遮盖1周屈光度前后变化为5.91D，眼轴前后变化为0.52mm。去遮盖眼屈光恢复27％，眼轴长恢复43％。2．视网膜、巩膜形态学变化：遮盖眼视网膜较对照眼变薄，后极部巩膜变薄、稀疏。3．免疫组织化学染色：NGF、TrkA阳性细胞主要位于视网膜神经节细胞层、内核层，表现为细胞浆呈棕褐色。经图象系统分析处理，遮盖8周和去遮盖1周眼视网膜NGF蛋白、TrkA蛋白表达减少，与对照眼相比差异有统计学意义(P＜0.01)。4．RT-PCR：遮盖眼视网膜NGF mRNA、TrkA mRNA表达水平较对照眼降低，与对照眼相比差异有统计学意义(P＜0.05)。第二部分形觉剥夺性近视豚鼠视网膜细胞凋亡和神经生长因子的保护作用研究一豚鼠形觉剥夺性近视视网膜细胞凋亡和NGF受体p75NTR、Caspase-3的表达方法1．动物模型的建立：60只出生7天花色豚鼠随机分为3组：A组(遮盖4周组)、B组(遮盖8周组)、C组(遮盖12周组)，每组20只。右眼以半透明眼罩遮盖作为遮盖眼，左眼不做任何处理为对照眼。余同第一部分。2．屈光度及眼轴长度测量：同第一部分3．末端脱氧核苷酸转移酶介导d-UTP缺口末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated x-dUTP nick end labeling，TUNEL)染色技术：检测视网膜细胞凋亡。4．免疫组织化学染色：检测p75NTR蛋白、Caspase-3蛋白表达。5．逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)：检测视网膜p75NTR mRNA的表达。6．统计学处理：同第一部分。结果：1．各实验组遮盖眼分别与对照眼相比屈光度加深、眼轴增长，C组遮盖12周诱导出-11.47D近视，眼轴增长1.06mm，且其脉络膜、视网膜变薄，光感受器外节变长，视网膜色素上皮(Retinal Pigment Epithelium，RPE)细胞排列紊乱。2．TUNEL染色仅在C组遮盖眼视网膜内、外核层检测到凋亡细胞，对照眼、A组、B组遮盖眼未见到凋亡细胞。3．C组p75NTR蛋白、Caspase-3蛋白表达阳性染色呈棕褐色，主要位于神经节细胞层、内核层、外核层。与对照眼、A组、B组遮盖眼比较差异有统计学意义(P＜0.05)。4．对照眼及A组、B组遮盖眼有极弱p75NTR mRNA表达，C组遮盖眼后极部视网膜p75NTR mRNA表达增强，与对照眼及A组、B组遮盖眼比较差异有统计学意义(P＜0.05)。研究二神经生长因子对豚鼠形觉剥夺性近视细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响方法1．120只出生7天花色豚鼠随机分为6组：A组(正常对照组)、B组(遮盖12周组)、C组(遮盖12周+生理盐水组)、D组(遮盖12周+NGF5μg组)、E组(遮盖12周+NGF10μg组)、F组(遮盖12周+NGF20μg)组，每组20只。除A组外，各组均右眼以半透明眼罩遮盖作为遮盖眼，左眼不做任何处理为对照眼。按预定时间遮盖眼玻璃体腔注射NGF或生理盐水后检影验光，测量眼轴长度。2．流式细胞术检测各组视网膜细胞凋亡情况。3．免疫组织化学染色法检测TrkA蛋白、p75NTR蛋白、Caspase-3蛋白表达。4．逆转录聚合酶链反应检测视网膜TrkA mRNA、p75NTR mRNA的表达。5．统计学处理同第一部分，凋亡率应用多个样本比较秩和检验。结果：1．B组、C组、D组、E组、F组遮盖眼分别与对照眼、A组正常眼比较，其屈光度加深、眼轴增长。2．B组、C组视网膜细胞凋亡率为(4.45±0.48)％和(4.56±0.32)％，高于正常对照A组(0.31±0.22)％(P＜0.05)。D组、E组及F组NGF玻璃体腔注射后，遮盖眼视网膜细胞凋亡率均降低：F组(1.05±0.26)％，E组(1.94±0.42)％，D组(3.22±0.34)％，与A组及B组、C组差异有统计学意义(P＜0.05)。3．B组、C组遮盖眼视网膜p75NTR蛋白、Caspase-3蛋白阳性表达高于A组(P＜0.05)。D组、E组及F组玻璃体腔注射NGF后，p75NTR蛋白、Caspase-3蛋白的阳性表达降低，TrkA蛋白升高，但与A组及B组、C组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。4．D组、E组及F组NGF玻璃体腔注射后p75NTR mRNA表达降低，TrkA mRNA表达升高，与A组及B组、C组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。第叁部分神经生长因子对体外培养的人巩膜成纤维细胞的影响方法1．选取12周～18周人胚胎眼球，体外培养HSF，进行原代及传代HSF的形态学观察和波形蛋白免疫组织化学检测以鉴定是否为巩膜成纤维细胞。2．取第3～6代的细胞，MTT法观察NGF对体外培养HSF增殖的质量浓度、时间效应关系。3．流式细胞仪测定NGF对HSF细胞周期的影响。4．氯胺T法检测NGF对HSF胶原合成的影响。5．统计学处理同第一部分。结果1．原代、传代培养人胚胎巩膜成纤维细胞生长情况良好，波形蛋白免疫组织化学染色阳性。2．MTT法检测结果：NGF在25μg／L～200μg／L浓度范围内促进HSF的增殖且呈剂量效应关系，以100μg／L浓度时促进增殖作用最显着(P＜0.01)。流式细胞检测发现NGF100μg／L作用下G_1期细胞比例下降，S期细胞比例增加，反映细胞增殖状况的细胞增殖指数提高。3．NGF在第3天开始与对照组相比对巩膜成纤维细胞有显着的促增殖作用(P＜0.05)。4．NGF在25μg／L～200μg／L与对照组相比能有效刺激巩膜成纤维细胞胶原蛋白合成，并呈剂量效应关系。当浓度为200μg／L时，作用达到饱和。结论1．成功建立了豚鼠FDM的模型并在形态学上和生物特性方面进行了验证。2．在时空分布上从蛋白表达和RNA水平方面研究证实了NGF和功能性受体TrkA参与FDM的形成与发展。遮盖眼视网膜NGF蛋白、TrkA蛋白明显减少；NGFmRNA、TrkA mRNA表达水平明显降低。3．形觉剥夺可导致高度近视，遮盖眼视网膜内、外核层细胞出现凋亡细胞，p75NTR蛋白和Caspase-3蛋白明显增加，p75NTR mRNA表达水平明显升高。4．外源性NGF可能通过下调p75NTR与Caspase-3表达，上调TrkA表达而有效抑制形觉剥夺性高度近视视网膜细胞的凋亡。5．NGF可以促进HSF增殖并呈时间剂量效应依赖关系。其促细胞增殖作用可能与NGF对细胞周期的调节有关，在一定浓度范围内能有效刺激HSF胶原蛋白合成。
李德渊[6]2006年在《PVL新生大鼠脑组织P75NTR蛋白RhoAmRNA表达及意义》文中提出目的：建立新生大鼠PVL模型，了解新生大鼠PVL病理学改变及对神经行为学进行评价。 方法：1．将新生2日龄SD大鼠98只随机分为假手术组和PVL模型组。假手术组仅进行右侧颈总动脉分离术而不作结扎及缺氧处理。PVL模型组大鼠行右侧颈总动脉结扎后吸入含6％氧气和94％氮气的氧氮混合气体，处理4小时，建立新生大鼠PVL模型。 2．形态学观察：两组均在12h、24h、48h、72h、7d、14d、28d处死动物，取脑组织切片。HE染色观察病理改变，电镜观察超微结构。 3．正常饲养至一月后，在感觉运动功能及情感行为能力等方面作神经行为学评价和生长发育评估。 结果：1．脑组织HE染色光镜观察：假手术组细胞排列有序、胞核大、胞浆少、左右侧脑室对称。PVL组缺氧缺血后12h即见纹状体内胶质细胞水肿；48小时出现核固缩、胼胝体细胞稀疏、排列紊乱；72h可见侧脑室旁白质呈筛网状坏死；14天可见胼胝体变薄、脑室扩大、皮质下白质空囊形成。 2．脑组织电镜观察：假手术组少突胶质细胞染色质分布均匀、核不规则、核仁明显、胞浆少、线粒体形态规则。缺氧缺血后12小时即见胶质细胞线粒体明显改变；48小时可见胶质细胞洞亡；72小时可见胶质细胞坏死；28天可见髓鞘稀疏、形成不良。 3．生长发育观察：28天大鼠体重，假手术组为115.78±6.34g，PVL
杨晨[7]2004年在《NF-κB转录活性变化对大鼠脊髓神经细胞凋亡的影响及其与p75NTR关系的实验研究》文中指出在SCI后的继发性损伤过程中，损伤区及邻近区域细胞凋亡机制起着重要的作用。凋亡不仅会直接导致细胞死亡，也是损伤区域继续扩大和损伤区远旁幸存轴突长期延迟性脱髓鞘变性的主要原因所以我们有理由相信，阻断细胞凋亡的级联反应可以最大限度地减少细胞凋亡，保护幸存细胞，改善神经功能，从而达到有效的治疗措施。 核因子NF-κB因具有和某些基因上启动子区的固定核苷酸序列结合而启动基因转录的功能。在SCI的急性期，NF-κB的活化可以上调各种炎性介质因子，如：iNOS、细胞因子、趋化因子、粘附因子、蛋白水解酶等。它们的持续表达和聚集将对细胞产生毒害作用。所以以往对NF-κB的认识仅仅局限在其在炎症、应激、免疫方面的作用，直到发现NF-κB具有抑制中枢神经系统神经元的程序性细胞死亡的特点，它成为目前国内外脊髓损伤学术研究的热点。实验证实，NF-κB的活性表达可抑制中枢神经系统神经元的程序性细胞死亡，起到了抗凋亡的作用。 在完全没有TrkA的参与下，p75NTR可独立介导胞内信号传递，调控细胞凋亡这一现象后，p75NTR的研究受到举世瞩目，其最新研究成果频繁在Science和Nature等着名杂志上发表。近几年来，对p75NTR的研究更是进一步升温，因为在许多中枢神经系统疾病的发生中，p75NTR似乎都起到了关键性的作用，例如阿尔茨海默氏综合征、癫痫发作等。同时，通过对p75NTR信号传导途径的研究发现，一些信号分子参与了p75NTR引起的细胞凋亡过<WP=101>程如：ceramide、JNK、Bax、caspase、calpain等。上述研究都说明了p75NTR在介导神经细胞胞内信号传递，调控细胞凋亡方面的重要性。p75NTR在SCI后脊髓细胞内的表达分布及信号传导途径的研究，为指导继发性脊髓损伤的治疗奠定坚实的理论基础。本实验通过构建大鼠急性脊髓损伤模型，利用NF-κB的特异性抑制剂PDTC调控NF-κB的转录活性，采用western blot、RT-PCR、TUNEL及免疫组化、电镜分析、大鼠后肢功能的BBB评分等实验方法，研究NF-κB结合活性的变化对脊髓细胞凋亡过程及p75NTR表达产生的影响。深入的了解NF-κB在脊髓损伤后的表达作用机制，研究p75NTR在SCI后信号传导途径，阐明NF-κB与p75NTR的相互作用关系，对继发性脊髓损伤的治疗有着积极而重要指导意义。Crowe、Li和Liu等在SCI的研究中都发现了神经细胞凋亡这一现象，这种神经元和胶质细胞的凋亡可以解释损伤区的继续扩大和远离损伤区的幸存轴突长期延迟性脱髓鞘变性的原因。Emery等研究SCI病人的脊髓组织时，也发现了邻近损伤中心区域的白质都出现了神经细胞凋亡，和caspase-3的高度表达。在本实验中TUNEL染色和透射电镜分析发现，SCI后第7d时仍有许多凋亡的细胞，其主要由神经元和少突胶质细胞构成。caspase-3的表达分布在一定程度上可代表细胞凋亡的情况，实验发现SCI后24h时即有caspase-3的活性表达，第7d时仍维持着较高的水平。这种持续的高水平的神经细胞凋亡引起了广泛的脱髓鞘变化和轴突的破坏，对脊髓神经功能的恢复产生不利的影响。脊髓损伤后发生神经细胞凋亡这一现象是SCI研究领域中的一大进展，它使人们对SCI的认识不再局限于单纯的细胞坏死方面，细胞凋亡的发现为治疗急慢性脊髓损伤提供了新的思路和途径。研究者们很早就已发现SCI后会出现邻近损伤区域大量的细胞延迟性死亡这一现象，但未明其原因。美国的四个研究小组在研究了SCI患者脊髓时发现，损伤后期脊髓细胞的死亡并非由原发性损伤引起的坏死造成，而是细<WP=102>胞的一种程序性自杀性行为，即凋亡或程序性细胞死亡，并进一步指出细胞的凋亡是这一继发性损伤的关键。这就提示了如果能抑制细胞的凋亡就可以减轻损伤区域的扩大，减少脊髓麻痹的范围。这四个小组在大鼠SCI模型上发现，使用有抑制细胞凋亡作用的环己亚胺可明显提高大鼠后肢运动功能50%以上。同时研究还发现，大多数凋亡的细胞为构成髓鞘的少突胶质细胞。髓鞘可确保电信号沿中枢神经纤维快速传导，轴突脱髓鞘后将失去其传导冲动的能力。所以广泛的脱髓鞘变化和轴突的破坏是创伤性脊髓损伤后机体运动功能丧失的主要成因。而损伤区远旁的少突胶质细胞延迟性凋亡所引起的继发性脱髓鞘变化，则是SCI后损伤程度及范围进一步加重的原因。NF-κB活性表达的作用有其双面性—一方面通过介导炎性分子的转录起到了促进细胞坏死的作用；另一方面通过激活内源性途径起到抗凋亡功能。本实验中应用PDTC抑制NF-κB的结合活性，其结果是同时降低了NF-κB上述两方面的作用。但BBB评分却发现应用PDTC组（B组）大鼠的后肢功能行为学评分要低于SCI组（A组）的评分。也就是说，抑制了NF-κB活性表达所介导的细胞坏死作用，并没有提高大鼠后肢功能的BBB评分；而其抗凋亡功能的下降是评分低下的主要原因。这就说明了细胞凋亡在大鼠脊髓继发性损伤过程中起着重要的作用，其程度决定了大鼠后肢功能恢复状况。此外抑制脊髓神经细胞凋亡途径的实验研究，也证明了细胞凋亡在脊髓继发性损伤中的重要性，抑制神经细胞凋亡途径可显着改善大鼠后肢功能。目前有些学者认为NF-κB的活化表达起到促进细胞凋亡的作用。如Clemens等、Schneider等、Qin等的实验研究发
郭小兵[8]2011年在《proNGF及其受体p75、sortilin在人胚胎脊髓发育不同时期的表达变化》文中研究指明[目的]观察proNGF、p75和Sortilin在人胚胎脊髓发育不同时期的表达变化,从而探讨其与人胚胎脊髓发育的关系。[方法]应用免疫组织化学(immunohistochemistry, ICH)及逆转录聚合酶链式反应(Reverted Transciption Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)技术检测proNGF及其受体p75和Sortilin在人胚胎3M-7M脊髓内的表达及变化情况。[结果]1、proNGF蛋白在3M-7M发育过程的人胚胎脊髓中均有表达。低倍镜下,可见脊髓灰质背角大部分、白质背侧部分和后正中裂两侧等感觉功能相关的区域阳性染色,脊髓腹角运动神经元核团阳性染色。中央管阴性染色。脊髓其余部位均阴性染色。脊髓灰质位于中央管背内侧的Clarke背核着色清晰。脊髓proNGF染色3M到5M逐渐增强,5M到7M逐渐减弱(图4：A_1,B_1,C_1,D_1,E_1)。高倍镜下,脊髓灰质背侧阳性染色神经纤维成丝状,相互交织。脊髓灰质背侧部分5M组阳性染色最明显,且强阳性染色部位随着脊髓发育而不同,3M时为整片,5M时为内外侧两部分,7M时为灰质背侧边缘与白质交界处。灰质腹侧阳性染色神经元核团内可见散在神经细胞,胞浆着色,成不规则形。灰质腹侧神经纤维染色不及灰质背侧明显。高倍镜下,白质中神经纤维染色成丝状,相互交织,阳性染色神经细胞夹杂其间。3M-7M阳性染色部位有由外向里延伸的趋势(图4)。RT-PCR结果显示：proNGF组mRNA表达4M、5M、6M组较3M、7M组有显着增加(P<0.05),而4M、5M、6M组之间及3M、7M组之间比较无统计学意义。2、p75蛋白在3M-7M发育过程的人胚胎脊髓中均有表达,其表达模式与proNGF表达相似。低倍镜下,可见脊髓灰质背角大部分、白质背侧部分和后正中裂两侧等感觉功能相关的区域阳性染色,脊髓腹角运动神经元核团阳性染色。中央管阴性染色。脊髓其余部位均阴性染色。脊髓灰质位于中央管背内侧的Clarke背核弱染色。脊髓p75染色五组中3M最弱(图5：A1,B1,C1,D1,E1)。高倍镜下,脊髓灰质背侧阳性染色神经纤维成丝状,相互交织。脊髓灰质背侧部分5M组阳性染色最明显,且在脊髓灰质背侧强阳性染色区域随着发育而不同,开始整片,再分为内外侧两部分,7M时位于灰质背侧边缘与白质交界处。灰质腹侧阳性染色神经元核团内可见散在神经细胞,成不规则形,胞浆染色。灰质腹侧神经纤维染色不及灰质背侧明显。高倍镜下,白质中神经纤维染色成丝状,相互交织。阳性染色神经细胞夹杂其间。3M-7M阳性染色部位有由外向里延伸的趋势(图5)。RT-PCR结果显示：p75组mRNA表达3M到5M逐渐增加,而5M到7M逐渐减少,5M为峰值,与3M、6M、7M比较均显着增加(P<0.05)。3、Sortilin蛋白在3M-7M发育过程的人胚胎脊髓各个部位均有表达。脊髓灰质中背角、侧角、前后联合都可见阳性染色,腹角可见阳性染色神经元散在分布。脊髓白质普遍阳性染色,前正中沟、后正中裂均见阳性染色,且相比于灰质染色较深,与灰质形成清晰界线。脊髓sortilin染色5M和7M比3M、4M和6M深(图6：A_1,B_1,C_1,D_1,E_1)。高倍镜下,脊髓灰质可见阳性染色的丝状神经纤维、叁角形、圆形等各种形状的阳性染色神经细胞和圆点状神经胶质细胞,神经细胞和神经胶质细胞胞浆着色。脊髓白质中丝状神经纤维相互交织构成网状,其间夹杂着大量的各种形状的神经细胞及圆点样神经胶质细胞(图6)。RT-PCR结果显示：sortilin组mRNA表达4M、5M、6M组较3M、7M组有显着增加(P<0.05),而4M、5M、6M组之间及3M、7M组之间比较无统计学意义。[结论]1.在人胚胎发育过程中3M-7M的脊髓,proNGF、p75和sortilin都有表达。proNGF和p75表达于脊髓灰质背角和白质背侧等与感觉功能相关的部位,也表达脊髓灰质腹角的运动神经细胞中。sortilin在脊髓灰质和白质神经细胞和神经纤维中广泛表达。提示其在人胚胎脊髓的感觉功能和运动功能发育中发挥着作用。2.在3M-7M的人胚胎脊髓发育中,proNGF和p75在不同时间组的脊髓感觉功能相关部位的差异表达,提示其与脊髓感觉功能发育密切相关。鉴于proNGF/p75/sortilin复合体在介导凋亡中的作用,提示其在人胚胎脊髓发育过程中影响感觉神经的凋亡,在感觉神经的发育中发挥着重要作用。3. proNGF、p75和sortilin的mRNA表达在人胚胎脊髓3M-7M都存在着先升高再降低的趋势,提示proNGF/p75/sortilin复合体介导的凋亡在人胚胎脊髓3M-7M先增加后降低。
陈福军[9]2010年在《EGCG对APP/PS1转基因鼠保护作用及可能机制》文中进行了进一步梳理目的阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)亦称老年性痴呆(senile dementia),是一种发生于中老年的以进行性认知障碍和记忆能力下降为主的退行性神经病变。该病起病隐袭,病程呈进行性进展,以渐进性学习记忆、认知功能减退、行为异常、日常生活能力下降及情感、思维障碍等为主要临床表现。其典型的病理改变是神经细胞间出现大量以p-淀粉样肽(β-Amyloid, Aβ)为核心的老年斑(senile plaques, SP)、神经元的胞体中出现神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)及神经元的丢失等。AD的发病机制目前尚未完全阐明,但自由基损伤学说和细胞凋亡学说备受人们的关注。自由基形成和氧化应激增强,进一步引起神经细胞凋亡,是导致AD的功能退化和神经变性的基础。p75神经营养因子受体(P75 neurotrophin receptor, P75NTR)是神经营养素的低亲和力受体,与AD神经元细胞凋亡有关。TrkA即酪氨酸激酶A (tyrosine kinase A)是神经营养素的特异性受体,与神经元细胞分化、生长、修复、存活密切有关。p75NTR诱导凋亡的信号通路目前仍不十分清楚,但已广泛公认的是其对c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase, JNK)的激活是介导神经元细胞凋亡的关键步骤,并进一步通过激活促凋亡蛋白P53、Bad等的表达,促进或引起细胞凋亡。此外,JNK还能通过诱导细胞色素C的释放进一步活化Caspase-3而导致细胞凋亡。TrkA对神经元发挥促进其分化、生长、存活功能的机制研究的相对比较透彻,其主要通过激活Ras-MAPK-ERK信号转导通路,特别是通过活化的Erkl/2信号转导通路来实现。研究并建立可靠的AD动物模型对于探明AD的病因、发病机制及防治药物的研发均有重要的意义。到目前为止用于AD研究的动物模型很多,其中转基因模型是一种病因模型,过量表达人源性突变AD相关基因的转基因鼠,因其具有明确的病因,并能反映AD的部分病理与功能变化,有助于我们了解AD的发病机制,也逐渐成为研究AD的最为理想的整体模型。防治AD的抗氧化剂及抗凋亡药物的研究与开发成为当今药理学研究领域的重要课题之一。(-)表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)是绿茶的一种主要多酚成分,研究证实绿茶有效的铁螯和、抗氧化、抗炎、抗癌及神经保护等作用的发挥主要依赖于EGCG。Levites等人通过研究人类成神经细胞瘤SHSY5Y细胞和大鼠成纤维细胞瘤PC12细胞,发现EGCG能够减少具有神经毒性作用的Ap的产生。因此,本研究拟通过遗传性的APP/PS1转基因小鼠,采用Nissl、TUNEL染色、免疫组化、Western blot等方法研究APP/PS1转基因小鼠认知行为、病理改变、抗氧化能力、细胞凋亡、Aβ(1-40)、淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor Protein, APP)、促凋亡蛋白caspase-3及P75-JNK-P53凋亡相关通路及抗凋亡蛋白Phospho-c-raf、Phospho-MEK1/2、Phospho-ERK1、Phospho-p90RSK、Phospho-MSK1相关通路的影响,即9月龄的APP/PS1转基因小鼠上述指标的改变,同时进一步探讨EGCG对APP/PS1转基因小鼠模型的神经保护作用及其作用机制。材料与方法APP/PS1转基因小鼠实验取C57小鼠10只及APP/PS1小鼠22只,C57小鼠为对照组(Control)、APP/PS1小鼠22只随机分为模型组(APP/PS1)和实验组(APP/PS1+2 mg/kg EGCG)。实验组APP/PS1转基因小鼠按2 mg/kg的剂量灌胃0.04%的EGCG,每日一次,连续灌胃4周；对照组及模型组小鼠灌胃等量的双蒸水,每日一次,连续灌胃4周。最后一周对小鼠进行水迷宫、避暗及自主活动等行为学检测,其间继续给药。行为学结束后,快速取一部分小鼠脑组织入-80℃低温冰箱中冻存,分别进行SOD、GSH-Px、AChE酶活性、MDA含量的测定及Western blot印迹分析APP、caspase-3、NGF、P75、JNK2、P53、Phospho-TrkA.Phospho-c-raf、Phospho-MEK1/2、Phospho-ERK1、Phospho-p90RSK、Phospho-MSK1、CREB等蛋白表达水平的实验。另一部分小鼠进行灌流固定,取脑后分别进行HE染色、Nissl染色、TUNEL染色及Aβ(1-40)、caspase-3、APP、CREB、TrkA等免疫组化的检测分析。实验结果1、EGCG对APP/PS1转基因小鼠记忆及判断能力的影响水迷宫、避暗、自主活动等行为学结果显示APP/PS1转基因小鼠出现明显的学习记忆及判断能力的下降,但活动能力未受影响。EGCG明显的改善了APP/PS1转基因小鼠的学习记忆障碍,提高了小鼠的记忆与判断能力。2、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑组织病理改变的影响HE染色及Nissl染色结果显示,APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区神经元数量明显减少,细胞排列松散,细胞核固缩、染色质边集和核碎裂,尼氏体分界不清,排列紊乱、松散,细胞周围出现间隙,其中许多细胞胞体缩小、胞浆呈淡红色、胞核固缩,可见坏死的神经元；EGCG明显的减轻了APP/PS1转基因小鼠脑内神经元损伤程度,细胞排列相对整齐,细胞形态规则,层次丰富,核仁清晰。3、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ(1-40)蛋白表达的影响Aβ(1-40)蛋白免疫组化染色结果显示：APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区的Aβ(1-40)蛋白表达水平显着增高；EGCG能明显抑制小鼠大脑皮层及海马区的Aβ(1-40)蛋白表达水平。4、EGCG对APP/PS1转基因小鼠海马区SOD、GSH-Px及AChE酶活性及MDA含量的影响酶学结果显示APP/PS1转基因小鼠海马内SOD、GSH-Px活性明显降低,AchE酶活性及MDA含量明显升高；EGCG能明显的提高小鼠海马内SOD、GSH-Px酶活性,并明显的降低MDA含量和AchE酶的活性。5、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑区神经元细胞凋亡的影响TUNEL法染色结果显示APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区可见有较多的凋亡细胞,且细胞凋亡指数与空白对照组比明显增多；EGCG能明显的减少APP/PS1转基因小鼠大脑内神经元细胞的凋亡6、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑内CREB蛋白表达的影响CREB免疫组化染色及Western blot印迹分析结果显示APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区的CREB蛋白表达水平明显降低：EGCG明显的提高了APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区的CREB蛋白表达水平。7、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑内APP蛋白表达的影响APP免疫组化染色及Western blot印迹分析结果显示APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区的APP蛋白表达水平明显增高；EGCG明显的抑制了APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区的APP蛋白表达水平的增高。8、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑内内P75NTR、JNK2及P53蛋白表达的影响Western blot印迹分析结果显示APP/PS1转基因脑内海马内P75蛋白的表达水平增高,同时海马区JNK2及P53蛋白表达水平增加；EGCG可明显的抑制p75ICD、JNK2及P53蛋白表达水平。9、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑内内Phospho-c-raf、Phospho-MEK1/2、Phospho-ERK1/2、Phospho-p90RSK、Phospho-MSK1蛋白表达的影响Western blot印迹分析结果显示APP/PS1转基因小鼠脑内Phospho-c-raf、Phospho-MEK1/2、Phospho-ERK1/2、Phospho-p90RSK、Phospho-MSK1蛋白的表达水平降低；EGCG可明显的提高APP/PS1转基因小鼠脑内Phospho-c-raf、Phospho-MEK1/2、Phospho-ERK1/2、Phospho-p90RSK、Phospho-MSK1等蛋白表达水平。结论1、EGCG能够改善APP/PS1转基因小鼠的学习记忆障碍。2、EGCG能够提高APP/PS1转基因小鼠脑内内的抗氧化酶活性,及降低AchE酶的活性,发挥有效的抗氧化作用及增强记忆能力的作用。3、EGCG通过抑制APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马内的APP及Aβ(1-40)蛋白水平,对神经细胞发挥一定的保护作用。4、EGCG通过抑制APP/PS1转基因小鼠脑内内p75ICD、JNK2及P53凋亡通路相关蛋白表达水平,进一步抑制caspase-3蛋白活性,对神经细胞发挥有效的抗凋亡作用。5、EGCG通过促进APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马内的Trka及CREB蛋白水平,对神经细胞发挥一定的保护作用。6、EGCG通过提高APP/PS1转基因小鼠脑内内Phospho-c-raf、Phospho-MEK1/2、Phospho-ERK1/2、Phospho-p90RSK、Phospho-MSK1抗凋亡通路相关蛋白表达水平,对神经细胞发挥有效的抑制凋亡的作用。
韩克[10]2013年在《甲状腺激素和神经生长因子联合应用对大鼠坐骨神经再生和功能恢复的影响》文中提出背景与目的周围神经损伤后神经再生和功能恢复问题一直是临床研究的热点。神经断裂后神经吻合技术日臻完善,但在功能恢复方面仍然未获得较为理想的效果,无数的科研工作者和临床工作者前仆后继的不懈努力寻找一种行之有效的方法。要想解决功能问题,首先要解决神经再生问题。不可否认的是神经再生过程与轴突的延长和髓鞘化关系密切。而轴突延长与生长锥内细胞骨架的重构密切相关,细胞骨架的主要成份是微管,微丝和神经丝蛋白。这些蛋白的含量及再生轴突的髓鞘化,与再生神经所处的微环境中的各种神经营养因子、激素、雪旺细胞、巨噬细胞、细胞基质和黏附分子等密切相关。神经生长因子为神经再生提供营养支持和促进轴突延长,临床效果较为肯定,而甲状腺激素一般认为对神经再生有一种综合持久的促进效应。最近研究表明,神经生长因子和甲状腺激素对神经再生过程中某些蛋白的表达有协同作用。有研究人员制作大鼠坐骨神经损伤模型时硅胶管套接神经断端,硅胶管内事先注药或实验中定期注药,硅胶管在体内是异物,一方面对神经再生本身有影响,另一方面需再次手术取出。也有人利用组织化工程神经制作大鼠坐骨神经损伤模型。部分研究虽在实验中获得良好效果,但真正可用于临床中的寥寥无几。因此,实验中选择了最为简单可靠有实用价值的大鼠坐骨神经离断后原位吻合模型。本实验旨在利用该模型,探讨甲状腺激素和神经生长因子联合应用对周围神经再生和功能恢复的影响。方法成年健康雄性SD大鼠64只,清洁级,体重240g-260g,平均体重250±15g。大鼠称重后,用2%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉,双后肢外展,四肢橡皮筋固定于手术台,剪去右髋部鼠毛,常规右后肢消毒铺无菌洞巾,右股后部纵行切口约2cm,钝性分离股二头肌和股外侧肌,游离右侧坐骨神经,于梨状肌下缘5mm,锐性离断坐骨神经,手术显微镜下以神经血管为解剖标志对位,断端对合整齐,用10-0无创伤缝线缝合神经外膜4针打结松紧适度且一致,创面止血,0号缝合线缝合大鼠皮肤切口。随机将实验动物分为A,B,C,D共4组,每组16只并按组标记。A组(T3+NGF组)：术侧腓肠肌注射T35μg/d,术侧腓肠肌注射NGF0.6μg/d; B组(NGF组)：术侧腓肠肌注射5μ/d的生理盐水,术侧腓肠肌注射NGF0.6μg/d; C组(T3组)：术侧腓肠肌注射T35μ/d,术侧腓肠肌注射0.6gg/d生理盐水；D组(NS组)：术侧腓肠肌注射5.6g/d生理盐水。共注射4周。术后12周内进行：大体观察、坐骨神经功能指数测定、神经电生理测定、NF-H免疫组化染色和轴突计数、Western Blotting分析NF-H蛋白含量、电镜下观察轴突再生情况。结果联合用药组与余组相比：(1)在大体观察中：大鼠足底溃疡出现较迟愈合较好,展爪反射出现最早；(2)神经再生的组织学评价中：NF-H阳性轴突数较多；NF-H含量较高,灰度对比差异显着,P<0.05;电镜下轴突再生恢复较好；(3)神经功能恢复的评价中：坐骨神经功能指数和神经电生理测定结果均优于其他各组,各项数据分析中P<0.05,差异有统计学意义。结论1.甲状腺激素和神经生长因子均对大鼠坐骨神经再生和功能恢复有促进作用；2.甲状腺激素和神经生长因子联合应用促进大鼠坐骨神经再生和功能恢复效果优于甲状腺激素或神经生长因子单独应用；3.两者联用的效果可能是通过某种协同机制促进NF-H等的表达而实现的。
参考文献：
[1]. 神经营养素低亲和力受体p75NTR信号传导及诱导细胞凋亡的相关基因的功能研究[D]. 白氡. 中国协和医科大学. 2003
[2]. p75NTR、sortilin在黑质多巴胺能神经元的表达及其参与细胞变性的病理作用研究[D]. 王艳芹. 第四军医大学. 2009
[3]. 神经营养素及其受体在老年性大鼠耳蜗及下丘中表达规律的研究[D]. 李玉茹. 吉林大学. 2005
[4]. NGF在绒山羊皮肤组织中的表达及其对次级毛囊外根鞘细胞增殖作用的研究[D]. 马巍. 吉林农业大学. 2017
[5]. 神经生长因子及其受体在形觉剥夺性近视中作用的实验研究[D]. 陈悦. 郑州大学. 2007
[6]. PVL新生大鼠脑组织P75NTR蛋白RhoAmRNA表达及意义[D]. 李德渊. 四川大学. 2006
[7]. NF-κB转录活性变化对大鼠脊髓神经细胞凋亡的影响及其与p75NTR关系的实验研究[D]. 杨晨. 吉林大学. 2004
[8]. proNGF及其受体p75、sortilin在人胚胎脊髓发育不同时期的表达变化[D]. 郭小兵. 昆明医学院. 2011
[9]. EGCG对APP/PS1转基因鼠保护作用及可能机制[D]. 陈福军. 中国医科大学. 2010
[10]. 甲状腺激素和神经生长因子联合应用对大鼠坐骨神经再生和功能恢复的影响[D]. 韩克. 郑州大学. 2013
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