周英杰[1]2001年在《大鼠海马CA1锥体细胞K_ATP通道的特性及在缺血所致神经元损伤中的作用》文中研究指明K_(ATP)通道在细胞的新陈代谢与膜兴奋性的耦联中起重要作用。神经元上的K_(ATP)通道在正常生理情况下是否活动尚不确定，但在缺血缺氧等代谢障碍时K_(ATP)通道由于胞内ATP浓度的下降激活，参与了受损细胞的膜兴奋性和电活动的变化从而起到一定的保护作用。迄今为止对海马K_(ATP)通道的单通道研究很少，对其特性的研究结果也并不一致，而且均是在培养的神经元上进行的，对成年动物海马CA1区锥体神经元K_(ATP)通道的单通道特性尚未见报道。海马CA1锥体细胞在短暂全脑缺血后发生迟发性神经元死亡，其机制尚不清楚，有研究认为缺血后海马CA1神经元兴奋性的持续降低可能是触发神经元迟发性死亡的一个重要因素，其机制可能与钾通道活动的增强有关；又有研究表明长时间暴露于含K_(ATP)通道激动剂的溶液中能诱导培养神经元的凋亡；提示缺血导致的迟发性神经元死亡可能与K_(ATP)通道活动的改变有关。因此本实验用膜片钳技术的内面向外式记录方法对成年大鼠海马CA1锥体细胞的K_(ATP)通道的特性进行了系统的研究，并用四血管闭塞法制作全脑缺血模型，研究了短暂全脑缺血再灌流后大鼠海马CA1锥体细胞K_(ATP)通道活动的变化，进一步观察了缺血后侧脑室给予K_(ATP)通道阻断剂tolbutamide对CA1锥体细胞缺血损伤的影响。主要结果和结论如下：一、成年大鼠海马CA1锥体细胞K_(ATP)通道的特性 在成年大鼠海马CA1锥体细胞上记录到两种类型的被胞浆侧ATP抑制的K~+通道电流。其中一种类型的K~+通道属“经典的”K_(ATP)通道，当细胞膜内外两侧的 K＋浓度均为 140mmol几时，通道的电导为 63ps，翻转电位为 1．71 mV，通道呈弱内向整流性。在负钳制电位时，通道开放时常被短时程的关闭所打断，而正钳制电位时，这种短时程的关闭状态明显少于负钳制电位时的。但通道开放概率未见明显的电压依赖性。ATP对通道活动的抑制作用呈浓度依赖性，抑制通道活动50％的ATP浓度为 0二mmol／L。KATp通道的特异性阻断剂tolbutamide（甲糖宁，lmmol／L）可完全阻断通道的活动，而 KAT，通道开放剂 diazoxide（二氮噎，lmmol／L）则不增强通道的活动。膜外侧的 Zmmol／LTEA能降低KATP通道电流的幅度、减少通道的开放概率，但不能完全阻断KATP通道的活动。当胞内 pH值由 7．3 5降到 6．7时，通道的电流幅度下降到原来的72％，但通道的开放概率却增加到原来的505％。 在成年大鼠海马 CA区锥体细胞上还记录到一种被胞浆侧 ATP和甲糖宁O K。，通道阻断剂）抑制的“非经典的” K。，通道。通道活动只有在胞浆侧有一定浓度的Ca》存在的情况下才能被记录到，在细胞膜内外的 K＋浓度均为 140mmol／L时，通道的电导为 204土Zips，翻转电位为 3．57土 1．13mV，通道无整流性。通道开放概率及 ATP对通道的抑制作用均呈现电压依赖性。这种类型的KATP通道与以往报道的“经典”K。P通道有显着不同，其活动受膜电位、胞内C／“和AT Pa重调节，表明这是一种新型的KATP通道。 本文结果首次证明了在成年哺乳动物海马 CA锥体神经元上 K。。通道的存在。并发现在成年大鼠海马 CA区锥体神经元上至少存在两种不同类型的K爪，通道。提示神经元通过不同的Karn通道感受细胞内的代谢状态，进而调节细胞膜的兴奋性。二、短暂脑缺血后大鼠海马CAI锥体细胞KAT，通道活动变化及tolbutamide对CAI锥体细胞迟发性神经元死亡的影响 短暂全脑缺血再灌流后48小时内海马CAI锥体神经元KATP通道的电导同缺血前相比没有差异。缺血后2’J＼时KATP通道的开放概率与缺血前相比没有差异，12小时和 24小时 K。，通道的开放概率与缺血前相比有所增加，48小时K。，通道的开放概率又恢复到缺血前水平。进一步研究缺血后通道开放概率增加的机制发现：（l）缺血后通道开放概率 一3一的增加是由于通道的开放频率增加，以及开放时间常数的长成分在总开放时间中所占比例增加所致；（）缺血后KATP通道的整流性和对ATP的敏感性与缺血前相比未发生变化，表明缺血后KATP通道的活动增强不是因其对ATP的敏感性降低所致。 缺血后侧脑室给予tolbutamide组CAI存活的锥体细胞数与生理盐水对照组相比没有差异，表明缺血后侧脑室给予KATP通道阻断剂tolbutamide对海马CAI锥体神经元的损伤没有保护作用。以上结果提示KATP通道活动的增强可能参与了缺血后CAI锥体细胞膜特性的改变，但其活动的变化不是迟发性神经元死亡的机制，而可能是脑缺血后神经元的一种自我补偿机制，但由于 CA神经元 KATp通道的密度较低，这种补偿作用不足以对抗缺血性损伤。
周英杰, 佟振清, 高天明[2]2003年在《成年大鼠海马CA1区锥体细胞K_(ATP)通道的特性及其在缺血所致神经元损伤中的作用》文中指出K_(ATP)通道在细胞的新陈代谢与膜兴奋性的耦联中起重要作用。神经元上的K_(ATP)通道在正常生理情况下是否活动尚不确定,但在缺血缺氧等代谢障碍时K_(ATP)通道由于胞内ATP浓度的下降激活,参与了受损细胞的膜兴奋性和电活动的变化从而起到一定的保护作用。迄今为止对海马K_(ATP)通道的单通道研究很少,对其特性的研究结果也并不一致,而且均是在培养的神经
刘亚君[3]2007年在《缺血预处理抗大鼠海马神经元缺血再灌注损伤的线粒体机制》文中研究指明缺血性脑血管病的发病率较高，是中老年人致死和致残的主要原因。因此，对缺血性脑血管病发病机制及其防治措施的研究仍是当前神经科学研究领域的一个热门课题。脑卒中的治疗方法是早期恢复血流再灌注，但当脑缺血超过一定时间后，恢复血流再灌注可造成缺血神经细胞损伤的进一步加重，即缺血再灌注损伤。近年来，在探讨脑缺血保护措施的同时，人们已开始注重调动脑的内源性保护机制以增强神经元对缺血性损伤抵抗能力的研究。1990年，Kitagawa等首先在沙土鼠脑缺血模型上观察到缺血预处理(ischemic preconditioning，IPC)的保护现象，即一次或多次短暂非致死性脑缺血再灌注能够诱导该缺血组织对以后较长时间的致死性缺血损伤产生显着的耐受性。然而，迄今为止有关缺血预处理的神经保护作用机制远未阐明。研究表明，缺血预处理能够通过调节凋亡相关基因Bc1-2和Bax的表达，减轻大鼠海马CA1区神经元缺血再灌注损伤，但IPC的神经保护作用是否与抑制线粒体途径凋亡有关，目前尚未见系统研究报道。本实验首次对缺血再灌注后线粒体途径凋亡上、下游基因的表达情况及IPC对其表达的影响进行了系统研究。线粒体解耦联蛋白-2(uncoupling protein 2，UCP2)广泛存在于组织细胞，是惟一一种在脑组织中(包括海马)表达的线粒体膜蛋白。在UCP2介导下，脂肪酸阴离子从线粒体内膜的内侧转运到外侧，与质子结合，破坏线粒体膜内外的质子电化学梯度，导致氧化和磷酸化解耦联，最终降低电子渗漏和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生。研究报道，UCP2对急性脑外伤和癫痫损伤具有保护作用，但其是否参与IPC的脑保护作用尚未见报道。本实验首次研究了IPC与UCP2表达的关系，探讨了UCP2在脑缺血预处理保护海马神经元缺血再灌注损伤中的作用。Ghrelin是近年来新发现的一种脑-肠肽，主要在胃合成，还可由海马、丘脑、垂体等组织分泌。Ghelin能促进生长激素的释放、调节能量代谢和胃肠道功能。有文献报道，ghrelin对心肌缺血再灌注损伤有保护作用。另有研究发现，在脑室内注射人工合成的生长素促分泌素(growth hormone secretagogues，GHSs)hexarelin能减轻新生大鼠大脑皮层、海马和丘脑的缺氧缺血损伤。Ghrelin对缺血再灌注损伤有无保护作用?IPC对ghrelin的产生和释放有无影响?目前均未见报道。本实验首次探讨了ghrelin在脑缺皿预处理保护海马神经元缺血再灌注损伤中所起的作用及其机制。研究目的1．探讨IPC是否通过抑制线粒体途径细胞凋亡减轻海马神经元缺血再灌注损伤。2．探讨UCP2在脑缺血预处理保护海马神经元缺血再灌注损伤中所起作用。3．探讨ghrelin在脑缺血预处理保护海马神经元缺血再灌注损伤中所起作用及其与线粒体UCP2表达的关系。通过这叁部分实验研究，以期为深入阐明缺血预处理神经保护作用的线粒体机制提供较新的分子生物学实验依据。材料与方法1．全脑缺血再灌注动物模型的建立选用健康成年雄性Wistar大鼠，参照Pulsinelli的四血管阻断法(4VO)建立全脑缺血模型。具体方法如下：大鼠在1％戊巴比妥钠(40mg／kg)腹腔麻醉下，电凝椎动脉，暴露并游离两侧颈总动脉备用。24h后，用相同的麻醉方法麻醉动物，再次暴露两侧颈总动脉，用无创性动脉夹夹闭两侧颈总动脉8min，松开动脉夹，恢复灌注，造成全脑缺血再灌注损伤。实验过程中动物肛温维持在37℃以上。2．动物分组动物随机分为以下几组：(1)对照组(CON组)：只进行假手术，暴露第一颈椎两侧翼孔及两侧颈总动脉，不电凝椎动脉，也不夹闭颈总动脉造成脑缺血。(2)缺血再灌注组(I／R组)：不接受缺血预处理，只在电凝椎动脉24h后接受一次8min的致死性缺血及72h再灌注。(3)缺血预处理组(PC组)：只给予一次3min的短暂缺血预处理及72h冉灌注，不进行第二次的致死性缺血。(4)缺血预处理+缺血再灌组(IPC+I／R组)：先给予一次3min的短暂缺血预处理，72h后，再给予致死性脑缺血8min及72h再灌注。(5)缺血预处理+SOD组(PC+S组)：PC组大鼠在3min短暂缺血前5min，给予过氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，10，000 U／kg)腹腔注射。(6)缺血预处理+生理盐水组(PC+N组)：PC组大鼠3min短暂缺血前5min，给予与SOD相同剂量的生理盐水腹腔注射。(7)缺血再灌注+ghrelin组(I／R+G组)：I／R组大鼠在8min致死性缺血后，立即给予ghrelin(0.4mg/kg)腹腔注射，1次／d，连续3d。(8)缺血再灌注+生理盐水组(I／R+N组)：I／R组大鼠在8min致死性缺血后，立即给予与ghrelin同剂量、同频率的生理盐水腹腔注射。(9)对照+生理盐水组(CON+N组)：只暴露第一颈椎两侧翼孔及两侧颈总动脉，不电凝椎动脉，也不夹闭颈总动脉，每天给予与ghrelin同剂量的生理盐水腹腔注射。3．检测指标与方法(1)采用HE、TUNEL和抗神经元抗体免疫组化染色检测缺血预处理及注射ghrelin后海马CA1区神经元病理组织学改变和细胞凋亡情况。(2)采用RT-PCR检测缺血预处理及注射ghrelin后海马组织UCP2 mRNA表达变化。(3)免疫组化方法检测缺血预处理后海马神经元Bc1-2、Bax、细胞色素C(cytochrome c，Cyt c)和UCP2的表达，以及注射ghrelin后Bc1-2表达变化。(4)Western blot方法检测缺血预处理后海马组织caspase-9表达变化。(5)ELISA法检测缺血预处理对大鼠血浆中ghrelin浓度的影响。4．统计学处理实验数据用均数±标准误((?)±SEM)表示，各组间比较采用单因素方差分析t检验或两因素方差分析t检验，p≤0.05表示差异有统计学意义。结果1．缺血预处理对缺血再灌注后海马CA1区神经元病理组织学和细胞凋亡的影响HE染色结果显示，I／R组海马CA1区神经元大量丢失，大部分细胞出现胞浆固缩，核固缩、碎裂。IPC+I／R组大部分细胞边界清楚，核形状规则，少数细胞出现核染色变深，胞浆部分消失等变性的表现。对照组、I／R组和IPC+I／R组海马CA1区神经元存活数分别为250.5±10.5、30.2±3.8和221.0±8.0／mm，IPC+I／R组较对照组明显降低(p＜0.001)，但明显高于I／R组(p＜0.001)。抗神经元抗体免疫组化染色结果显示，I／R组海马CA1区多数神经元胞浆固缩，染色质聚集。而对照组、IPC+I／R组及PC组同一区域的神经元形态规则，边界清楚。叁组海马CA1区存活细胞数分别为231.3±5.2、194.0±10和237.2±12.3／mm，叁组间比较无统计学差异；I／R组海马CA1区细胞大量丢失，存活细胞数为41.1±7.7／mm，较上述叁组明显减少(p＜0.001)。TUNEL染色结果显示，I／R组海马CA1区多数神经元表现核固缩或染色质边聚。IPC+I／R组只有少量神经元凋亡。对照组、I／R组和IPC+I／R组凋亡细胞数分别为6.8±0.6、137.4±4.5和33.3±6.0／mm。IPC+I／R组凋亡细胞数明显高于对照组(p＜0.01)，但明显低于I／R组(p＜0.001)。2．缺血预处理对海马CA1区神经元线粒体途径凋亡基因表达的影响免疫组化结果显示，与I／R组比较，IPC+I／R组海马CA1区神经元Bc1-2表达明显增强(p＜0.05)，而Bax和Cyt c表达明显减弱(p＜0.05)。Western blot方法检测结果显示，IPC+I／R组海马组织活化caspase-9的表达量明显少于I／R组(p＜0.001)。3．缺血预处理对海马CA1区神经元UCP2表达的影响RT-PCR结果显示，PC组海马组织有大量UCP2 mRNA表达，明显多于其他叁组(p＜0.001)；IPC+I／R组和I／R组UCP2 mRNA表达水平相似，并且均明显高于对照组(p＜0.05)。UCP2免疫组化结果显示，对照组、I／R组和IPC+I／R组海马CA1区锥体细胞UCP2表达水平较低，而PC组较其他叁组明显增多(p＜0.05)。PC+S组海马CA1区神经元只有少量UCP2表达，明显低于PC组(p＜0.001)和PC+N组(p＜0.01)。4．缺血预处理对血浆中ghrelin水平的影响ELISA法检测结果显示，致死性缺血再灌注24h后，IPC+I／R组血浆ghrelin水平较对照组和I／R组明显升高(p＜0.001)，并且持续72h(p＜0.001)。I／R组各个对应时间点血浆ghrelin水平恒定，与对照组比较无统计学差异。5．Ghrelin对缺血再灌注后海马CA1区神经元损伤的保护作用HE染色结果显示，注射ghrelin后，CON+N组、I／R+N组和I／R+G组海马CA1区神经元存活数分别为251.3±8.7、28.5±7.3和179.5±11.5／mm，I／R+G组明显多于I／R+N组(p＜0.001)，但较CON+N组明显减少(p＜0.001)。TUNEL染色结果显示，CON+N组、I／R+N组和I／R+G组海马CA1区凋亡细胞数分别为7.5±0.9、135.0±5.7和28.7±1.9／mm，I／R+G组凋亡细胞数明显低于I／R+N组(p＜0.001)，但明显高于CON+N组(p＜0.05)。6．Ghrelin对海马神经元UCP2和Bc1-2表达的影响免疫组化结果显示，CON+N组、I／R+N组和I／R+G组大鼠海马CA1区神经元Bc1-2蛋白表达均不明显。RT-PCR结果显示，I／R+G组海马组织有大量UCP2 mRNA表达，明显多于CON+N组、I／R+N组和IPC+I／R组(p＜0.001)，IPC+I／R组和I／R+N组UCP2 mRNA表达水平相似，并且均明显高于CON+N组(p＜0.05)。结论1．大鼠全脑缺血再灌注导致的海马CA1区神经元损伤包括坏死和凋亡。2．缺血预处理可明显减轻缺血再灌注后海马CA1区神经元的损伤。3．缺血预处理能下调Bax表达及上调Bc1-2表达，降低线粒体膜通透性，抑制Cyt c释放和caspase-9前体活化，从而经抑制线粒体途径细胞凋亡，起到减轻海马CA1区神经元缺血再灌注损伤的作用。4．缺血预处理能诱导海马CA1区神经元UCP2的表达，通过保护线粒体功能，减轻缺血再灌注损伤。5．缺血预处理能增加大鼠血浆中ghrelin水平，并通过ghrelin上调海马CA1区神经元UCP2表达，保护线粒体功能，减轻缺血再灌注损伤。6．缺血预处理抗海马神经元缺血再灌注损伤的机制是通过抑制线粒体途径凋亡，促进ghrelin释放，诱导UCP2表达，最终保护线粒体功能而实现的。
佚名[4]2002年在《国际神经递质及受体学术研讨会》文中提出Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｐａｃｋａｇｉｎｇｉｎｔｏｓｙｎａｐｔｉｃｖｅｓｉｃｌｅｓ ＷｕＪａｎｇｙｅｎ ,ＪｉｎＨｏｎｇ ,ＷｕＨｅｎｇ ,ＧｒｅｇＯｓｔｅｒｈａｕｓ ,ＫａｔｈｌｅｅｎＤａｖｉｓ
胡平[5]2002年在《缺血预处理保护严重脑缺血对大鼠海马CA1锥体细胞的损伤并抑制大电导钙依赖性钾通道活动》文中认为缺血预处理可以使脑组织对随后严重脑缺血具有耐受性(缺血耐受)。3分钟前脑缺血对大鼠海马CA1锥体细胞不产生明显损害，但是可以对随后更长时间的能引起CA1锥体细胞死亡的前脑缺血所致的脑损伤起保护作用。已有实验表明热休克蛋白(heat shock protein，HSP)、B细胞淋巴瘤／白血病-2蛋白(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2、活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)、核转录因子-кB(nuclear factor-kappaB，NFкB)的上调参与了预缺血处理调节的神经元保护，但是，确切的机制有待进一步阐明。 大鼠全脑缺血后海马CA1区锥体神经元发生延迟性死亡。兴奋性氨基酸学说即细胞外兴奋性氨基酸过度积累导致钙超载而引起细胞毒性一直被认为是缺血性脑损伤的重要机制。然而，近来运用在体和离体细胞细胞内记录发现，严重脑缺血后CA1锥体细胞的放电频率和兴奋性持续下降。钾通道在控制神经元膜的兴奋性方面发挥重要作用，脑缺血后神经元兴奋性的降低可能是由于钾通道活动的增强所致，最近用膜片钳单通道和全细胞记录确实发现短暂性脑缺血后大鼠CA1区锥体神经元的钾通道电流显着增强。而且在培养的皮层神经元上的研究发现，外向钾电流的增加可以触发细胞的程序性死亡；在体与离体的实验均证明钾通道的阻断剂可以抑制细胞的凋亡。上述结果表明钾通道活动增强可能是全脑缺血后大鼠海马 CA锥体细胞的迟发性死亡的机制之一。 我室最近的研究表明大电导钙依赖性钾通道＊K通道）活动的增加参与了前脑缺血后大鼠海马 CA锥体神经元的凋亡。因此我们推测 BK通道活动的抑制可能参与了脑缺血耐受。在本次研究中，大鼠四血管夹闭3分钟脑缺血为预缺血组，只给予手术而无缺血处理为假手术组，预缺血组3天后再给予四血管夹闭8分钟脑缺血处理分别为缺血耐受组，只给予四血管夹闭8分钟脑缺血处理为严重缺血组。再灌流7天后，预缺血组与假手术组组织学相比无改变。严重缺血组可导致海马 CA 区90％以上的锥体细胞死亡；但是，缺血耐受组海马CAI区89％以上的锥体细胞得以存活。我们运用内面向外式膜片钳技术研究预缺血组缺血后6小时，24小时，48小时以及严重缺血组和缺血耐受组缺血后24小时急性分离的大鼠海马CAI区锥体神经元BK通道活动的变化。实验结果发现预缺血组缺血后第一个24小时内BK通道的开放概率明显下降，而严重脑缺血组缺血后24小时BK通道的开放概率明显增加，经通道动力学分析，预缺血组BK通道开放概率的降低是由于关闭时间的延长，开放频率的降低所致，而与开放时间无关；严重缺血组BK通道开放概率增加是由于开放时间的延长、关闭时间的缩短、开放频率的增加所致；而对 CA区锥体神经元具有明显保护作用的缺血耐受组 BK通道的开放概率与正常对照组无明显变化。缺血前后通道的电导、反转电位无明显改变；因此，上述结果提示BK通道活动降低与脑缺血耐受有关。
参考文献：
[1]. 大鼠海马CA1锥体细胞K_ATP通道的特性及在缺血所致神经元损伤中的作用[D]. 周英杰. 第一军医大学. 2001
[2]. 成年大鼠海马CA1区锥体细胞K_(ATP)通道的特性及其在缺血所致神经元损伤中的作用[C]. 周英杰, 佟振清, 高天明. 中国生理学会张锡钧基金会第八届全国青年优秀生理学学术论文综合摘要. 2003
[3]. 缺血预处理抗大鼠海马神经元缺血再灌注损伤的线粒体机制[D]. 刘亚君. 山东大学. 2007
[4]. 国际神经递质及受体学术研讨会[J]. 佚名. 解剖学研究. 2002
[5]. 缺血预处理保护严重脑缺血对大鼠海马CA1锥体细胞的损伤并抑制大电导钙依赖性钾通道活动[D]. 胡平. 第一军医大学. 2002