陆萍[1]2003年在《棉铃虫对转Bt基因棉的抗性等位基因频率及其监测方法研究》文中研究说明棉铃虫(Helicoverpa armigera(Hübner))是危害棉花的一种重要世界性害虫，在我国由于大量使用化学农药防治，棉铃虫已对常用的几类杀虫剂均产生抗性，1998年，河北省首先大面积种植转Bt基因棉，由于转Bt基因棉在整个生长季都表达Bt杀虫蛋白，因此与Bt生物制剂相比，棉铃虫对Bt棉存在更易产生抗性的风险。鉴于室内用Bt棉筛选的棉铃虫抗性品系的抗性基因遗传特性为不完全隐性(孟凤霞博士论文)，无法用常规方法监测Bt棉大田棉铃虫种群的早期抗性，因此采用单雌系F_2代法，从2000年至2002年，连续三年监测了从1998年开始大面积种植转Bt基因棉的河北省威县大田棉铃虫对对新棉33~B的抗性等位基因频率的变化，并初步建立了可快速、简便检测抗性等位基因频率的单雌系F_1代法，以便为抗性治理和延长Bt棉的应用寿命提供科学依据。 1999年，本实验室何丹军用单雌系F_2代法检测到种植Bt棉一年地区(河北邱县)棉铃虫种群对转Bt基因棉的起始抗性基因频率为0.58％，2000年，我们再次应用单雌系F_2代法监测到大面积种植转Bt基因棉三年地区的河北省(威县和成安)大田棉铃虫对对新棉33~B的抗性等位基因频率已上升到3.3％。继续用F_2代法检测河北威县棉铃虫种群对新棉33~B的抗性等位基因频率，2001年为6.9％，2002年二代幼虫、三代卵、三代幼虫这三个种群分别为6.9％、7.8％和9.4％。监测结果表明随着棉花种植年数和田间棉铃虫取食Bt棉代次的的增加，河北棉铃虫种群对Bt棉的抗性等位基因频率在快速上升。 初步建立用于检测田间棉铃虫Bt棉抗性等位基因频率的单雌系F1代法，采集田间幼虫或卵，饲养至羽化后与室内筛选的对转Bt基因棉有极高抗性水平的纯合的抗性品系单对交配，每对棉铃虫的所有F_1代幼虫作为一个单雌系用新棉33~B检测其中有无抗性个体，抗性等位基因频率估计方法参照Andow and Alstad(2000)描述的Bayesian统计方法。用此法其监测到2002年威县Bt棉田棉铃虫对新棉33~B的抗性等位基因频率分别为8.8％(二代幼虫)、8.9％(三代卵)、9.3％(三代幼虫)，经统计分析，与用单雌系F_2代法的检测频率无显著差异，表明单雌系F_1代法检测棉铃虫对转Bt基因棉的抗性等位基因频率的灵敏度与F_2代相同，该法可用于检测田间棉铃虫对Bt棉的低水平抗性等位基因频率，且比单雌系F_2代法快速、经济。 威县棉铃虫对MVPⅡ的抗性水平测定结果表明：参照孟凤霞测定的敏感基线，威县棉铃虫各种群对有效成分为Cry1Ac毒素的21％MVPⅡ可湿性粉剂的抗性 棉铃虫对转Bt基因棉的抗性等位基因频率及其监测方法研究倍数分别为7．2倍（2001年三代幼虫）、7．1倍（2002年二代幼虫）、6．9倍（2002年三代卵L10．9倍（2o02年三代幼虫），2O02年对各种群对20删w11胶悬剂抗性分别为15．3倍（2002年二代幼虫）、N．5倍（2m2年三代卵）和28．O倍（2002年三代幼虫），表明随着棉花种植年数和田间棉铃虫取食Bt棉代次的的增加，威县棉铃虫对Bt棉的杭性水平迅速上升，这一结果与应用单雌系F；代法和F；代法检测出田间抗性等位基因频率上升的趋势相一致。 根据对河北省威县棉铃虫的抗性监测的结果，我们认为，目前河北省采取的类似高剂量／庇护区的抗性治理对策对延缓棉铃虫对Bt棉的抗性发展存在不足，有必要及时调整策略，实施合理的抗性治理措施，否则将失去进行预防性抗性治理的最后机会；对转 B t基因棉种植二至三年以上的地方，应立即开展抗性监测工作，尽早设计和实施抗性治理对策。
须志平[2]2008年在《应用单雌系F_2代法监测田间棉铃虫种群对转Bt基因棉的抗性》文中研究指明表达CrylAc毒蛋白的转Bt基因棉花在中国北方地区种植多年,虽然Bt棉因其高效和对环境低风险迅速受到种植者的青睐,但是如此商业化大面积推广使用Bt棉将会增加靶标害虫对Bt棉产生抗性的风险,室内研究已经表明棉铃虫能对CrylAc毒素和Bt棉产生高抗性。在中国河北邱县地区,1998年开始推广种植Bt棉,1999年采用单雌系F_2代法检测到邱县地区田间棉铃虫野生种群对Bt棉初始抗性等位基因频率达到了0.0058。考虑到棉铃虫在如此高的抗性初始频率值和持续的田间选择压情况下,有可能对Bt棉产生抗性风险。2003-2007年在前人研究的基础上,我们采用单雌系F_2代法、剂量反应法、F_1代法和DNA分子生物学方法相结合的综合抗性监(检)测体系,研究长期大面积种植转Bt基因棉地区棉铃虫田间种群对Bt棉的抗性发展趋势,为设计制定合理有效的抗性治理策略提供及时、准确的科学依据,以延长转Bt基因棉在大田的使用。2003-2005年采用Bt棉株作为筛选媒介,对河北邱县(2003-2005年)和威县(2004年)地区田间棉铃虫种群进行单雌系F_2代法抗性监测。结果表明,这两个地区3年监测的340对单雌系中有20对被确定为携带有对Bt棉抗性的等位基因,棉铃虫种群的抗性等位基因频率(E(q))范围为0.0119-0.0297。其中邱县地区连续3年监测到的棉铃虫对Bt棉的平均抗性等位基因频率值(E(q))为0.0146(95%CI=0.0084-0.0225),明显高于1999年的监测结果(p=0.042);2003-2005年分别监测了105对、42对和131对单雌系,平均每个单雌系在Bt棉株上分别处理筛选了372.4±16.0头、328.1±9.5头和314.0±9.0头F_2代初孵幼虫,最终分别有4对、4对和7对单雌系被确定为田间亲本携带有抗性基因的阳性反应单雌系,每年的抗性等位基因频率值分别为0.0119(95%CI=0.0039-0.0243)、0.0297(95%CI=0.0099-0.0606)和0.0154(95%CI=0.0067-0.0277),监测处理单雌系的总抗性等位基因检出累计概率值(1-P_(NO))分别为96%、97%和94%;威县地区2004年共筛选了62对单雌系,平均每个单雌系筛选了334.7±8.6头F_2代初孵幼虫,最终有5个单雌系被确定田间亲本携带有抗性基因,抗性等位基因频率值为0.0243(95%CI=0.0091-0.0471),单雌系总的抗性等位基因检出累计概率值(1-P_(NO))为95%。结果表明威县地区棉铃虫野生种群对Bt棉的抗性等位基因频率值处在一个较高的阈值,并且超过了高剂量/庇护区策略的要求。采用Bt棉叶喂饲法处理室内敏感、抗性及两者杂交后代的初孵幼虫,通过四者在转基因棉花上5天生长发育速率的不同来加以区分。试验结果表明,敏感与抗性品系棉铃虫在Bt棉上5天的存活率与生长发育速率存在明显差异,敏感幼虫不能在转Bt基因棉叶上存活,抗性品系在转Bt基因棉叶上处理5天的存活率达到75%,正反交的幼虫存活率仅为2-6%.棉铃虫抗性品系存活幼虫中65%个体在Bt棉上发育到2龄中期、0.6mg以上;而杂合子和敏感纯合子存活幼虫均达不到此生长发育速率。因此可以确定棉铃虫幼虫在Bt棉上5天发育到2龄中期以上、体重≥0.6mg的个体为抗性个体。2006-2007年改进单雌系F_2代法,采用Bt棉叶作为筛选媒介进行邱县田间棉铃虫抗性监测。2006年和2007年共筛选了134对和137对单雌系,平均每个单雌系分别筛选了187.9±3.4头和105.1±1.5头F_2代初孵幼虫,抗性等位基因频率值分别为0.1135(95%CI=0.0862-0.1449)和0.0745(95%CI=0.0532-0.0995),2006年和2007年单雌系总的抗性等位基因检出累计概率值(1-P_(No))分别为95%和90%。2007年,采用大田雄虫与室内抗性雌虫杂交的F_1代法监测邱县棉铃虫抗性等位基因频率,共筛选了135对单雌系,平均每个单雌系筛选了165.2±5.2头F_1代初孵幼虫,经过F_2代核查后最终确定有29对单雌系的田间亲本携带有抗性基因,抗性等位基因频率值为0.107(95%CI=0.055-0.159)。2003-2007年,采用剂量反应法监测邱县、威县地区棉铃虫种群对CrylAc毒蛋白的抗性水平。5年的研究结果显示,田间棉铃虫对CrylAc毒蛋白的抗性倍数分别为15.3、12.9、12.5、6.7、16.5和11.5,基本达到了中等水平抗性。2006-2007年,将单雌系F_2代法确定为携带有对Bt棉抗性等位基因的田间亲本提取基因组DNA,利用根据室内抗性和敏感棉铃虫钙粘素受体基因序列设计的三个引物对田间抗性棉铃虫进行PASA分子检测,探索性的研究这三个引物在田间抗性检测中的应用。2006年共检测了50头田间亲本成虫,2007年共检测了44头田间亲本成虫。结果显示,根据室内抗、敏棉铃虫钙粘素受体基因设计的PASA引物无法有效的应用于田间棉铃虫Bt抗性检测,田间Bt抗性分子检测技术还有待进一步的改进。通过长达5年的田间抗性监测研究发现,邱县等大面积种植表达单一CrylAc毒蛋白Bt棉的地区,田间棉铃虫种群对Bt棉的抗性等位基因频率已经显著上升,证实了害虫抗药性发展模式中,在初始抗性等位基因频率值较高(＞0.005)地区的害虫,对Bt棉的抗性发展较快的这一推论。类似于邱县作物种植种类和结构的地区需要采取有效、灵敏的抗性检测与监测体系进行害虫的Bt抗性研究,同时结合田间生态环境,建立合理、有效的抗性管理策略,从而延长转Bt基因作物的应用。
杨亚军[3]2010年在《棉铃虫Cry1Ac抗性相关钙粘蛋白基因突变的鉴定与检测》文中进行了进一步梳理棉铃虫Helicoverpa armigera Hubner属鳞翅目夜蛾科,是一种重要的农业害虫。曾经在我国棉花上大面积暴发,造成严重的经济损失。20世纪80年代以来化学杀虫剂的广泛应用,使棉铃虫抗药性得到快速发展。棉铃虫对杀虫剂的抗性,特别是对拟除虫菊酯的抗性剧增是导致20世纪90年代初我国北方棉区棉铃虫大爆发的主要因素之一。随着Bt棉在我国的大面积种植,棉铃虫的发生量得到了有效地控制。但Bt棉在整个生长发育期内都表达Bt毒素,且在我国种植已超过10年。棉铃虫种群如此长时间处于Bt毒素筛选压力之下,对Bt毒素产生抗性的风险日益加大。目前已有多个棉铃虫品系经室内筛选对Bt毒素产生了抗性,如果田间棉铃虫对Bt毒素产生抗性将影响Bt棉的种植寿命。对棉铃虫抗性机理的研究将会为田间棉铃虫抗性治理提供重要依据。钙粘蛋白是Bt毒素作用过程中的一个重要受体,钙粘蛋白的变异将会导致害虫对Bt毒素产生抗性,目前至少已有3种害虫钙粘蛋白的变异被证实与其对Bt毒素的抗性有关。棉铃虫GYBT抗性品系钙粘蛋白基因缺失突变导致其氨基酸在429位提前终止,产生截短蛋白,使Bt毒素失去特异性结合受体。本文对棉铃虫室内抗性品系和田间种群Cry1Ac抗性相关的钙粘蛋白基因突变进行鉴定和检测,评价钙粘蛋白在抗性形成及Bt作用机理中的作用。研究结果不仅对于明确Cry1Ac毒杀棉铃虫的分子机理、进而预测棉铃虫潜在的抗性机理具有重要意义,还有利于了解田间棉铃虫的抗性基因的发展状况,为田间棉铃虫的抗性监测提供技术支持,为棉铃虫对Bt棉花的抗性治理提供重要理论依据。一、棉铃虫室内Cry1Ac抗性品系钙粘蛋白基因突变的鉴定和检测对室内棉铃虫Cry1Ac抗、感品系钙粘蛋白基因组DNA进行克隆和测序,结果显示室内敏感品系GY钙粘蛋白(cadherin, Ha_BtR)基因组DNA (GenBank登录号为DQ523166)全长全长16.4 kb,编码区含有34个外显子、33个内含子。棉铃虫抗性品系GYBT(对Cry1Ac的抗性>500倍)钙粘蛋白Ha_BtR r1等位基因(GenBank登录号为DQ523167)共有8.9 kb。与Ha_BtR野生型s相比在第8外显子和第25外显子之间缺失大约8.8 kb。5’剪切位点位于第8外显子末端,3’剪切位点位于第25外显子前的内含子处。融合区域由第8外显子大部分(88 bp)、第25外显子前内含子部分(120 bp)及第25外显子组成。这一缺失产生了提前终止密码子(TAA),使抗性品系中钙粘蛋白不能完整表达,从而导致抗性产生。针对r1等位基因建立了基于DNA的分子检测方法,这将有利于监测田间棉铃虫种群钙粘蛋白基因r1等位基因的频率。二、田间棉铃虫钙粘蛋白基因突变的鉴定与检测通过F1筛选法对2005年我国河南安阳田间棉铃虫种群及2009年河北廊坊田间种群与Cry1Ac抗性相关钙粘蛋白基因突变进行了筛选、鉴定。在采自2005年我国河南安阳田间棉铃虫种群中我们成功发现了与Cry1Ac抗性相关的钙粘蛋白新的等位基因r2和r3.r2和r3分别在Ha-BtR的第8外显子的相同位置插入了逆转座子(HaRT1)长末端重复(LTR)和完整的逆转座子HaRT1。这导致了钙粘蛋白截短,缺失跨膜区域和毒素结合区。这是首次在田间棉铃虫种群中发现与Cry1Ac抗性相关的钙粘蛋白基因突变,表明钙粘蛋白基因变异可能是田间棉铃虫抗性产生的重要途径。本研究还表明,含这两个抗性等位基因的棉铃虫幼虫在Bt棉上能完成发育过程。钙粘蛋白基因位点应成为田间棉铃虫抗性检测的重要靶标基因之一。同样,通过F1筛选法对2009年河北廊坊地区棉铃虫对Cry1Ac的抗性进行筛查,选出候选单对10对,可疑候选单对4个。对候选单对系F1代抗性个体中来自田间亲本的钙粘蛋白基因全长cDNA进行克隆、测序,发现了5个新的钙粘蛋白基因突变类型。与敏感品系钙粘蛋白基因相比：117#单对系田间亲本钙粘蛋白基因发生插入突变导致在氨基酸754-755间插入30个氨基酸或在氨基酸751处终止；239#在碱基4393-5097位缺失705 bp,导致EC11-CYT处235个氨基酸的缺失；234#发生可变剪接,在碱基1194-2752之间缺失1530 bp,导致EC2-6缺失；256#在碱基2403-1414位缺失导致4个氨基酸缺失(YTIT,802-805位)；124#在碱基4825-4989间缺失165bp,导致在氨基酸1609-1663位间55个氨基酸缺失(CYT部分)。这些突变体的发现表明,与Cry1Ac抗性相关的钙粘蛋白基因突变在田间种群中具有多样性,田间棉铃虫钙粘蛋白不同形式的变异均可能导致抗性的产生,这将增加分子检测钙粘蛋白变异基因频率进而预测抗性发展状况的难度。三、棉铃虫钙粘蛋白近等基因系的构建和交互抗性通过GYBT品系与SCD品系杂交后经多次回交并辅助分子标记筛选将等位基因r1植入SCD品系建立近等基因系SCD-r1.对棉铃虫钙粘蛋白近等基因系SCD与SCD-r1的正反交分析表明SCD-r1对Cry1Ac的抗性是完全隐性、常染色体遗传。抗性品系SCD-r1对Cry1Ac的抗性为高水平抗性(>430倍)；对Cry1Aa、Cry1Ab有中等水平的交互抗性,对Cry2Aa和Cry2Ab2没有交互抗性。原毒素Cry1AcPro和Cry1AbPro分别比胰蛋白酶活化毒素Cry1Ac和Cry1Ab对SCD-r1毒力效果好,SCD-r1品系对原毒素Cry1AcPro和Cry1AbPro的抗性明显低于对胰蛋白酶活化毒素Cry1Ac和Cry1Ab的抗性。修改毒素Cry1AcMod和Cry1AbMod分别比胰蛋白酶活化毒素Cry1Ac和Cry1Ab对SCD-r1毒力效果好,Cry1AcMod和Cry1AbMod都能显著克服棉铃虫对Cry1Ac和Cry1Ab的抗性。这表明钙粘蛋白在与不同毒素及同一毒素不同形式存在不同的相互作用,对Bt毒素进行人工修饰能够克服基于钙粘蛋白基因变异产生的抗性,修饰的Bt毒素基因可能成为转基因抗虫作物的候选基因。四、我国田间棉铃虫对Cry1Ac的敏感性监测用毒素涂表法对我国2006-2008年主要棉区的棉铃虫对Cry1Ac的敏感性进行了监测。2006-2008年监测的12个田间种群对Cry1Ac敏感性变异小于6倍。采自黄河流域棉区的10个棉铃虫田间种群对Cry1Ac活化毒素的敏感性(LC50:0.063～0.162μg cm-2)略低于采自新疆棉区的2个田间种群(LC50:0.027～0.049μg cm-2).尽管这几年我国主要棉区棉铃虫对Cry1Ac的敏感性没有发生明显变化,但是棉铃虫Bt抗性的检测工作必须加强,开发可靠的抗性基因频率检测技术尤为重要。
何丹军[4]2000年在《检测棉铃虫对Bt基因的抗性等位基因频率及建立新的检测方法》文中认为棉铃虫敏感品系SUS_2初孵幼虫在新棉33~B棉株主茎第3-14叶上喂饲5天后的平均死亡率为90.0～100.0％，存活幼虫均没达到3龄，Bt毒蛋白为高表达（即高毒），表现出极强的抗虫效果。而对照组平均死亡率为0.0～44.3％，存活幼虫以2龄和3龄为主，比处理组明显高出1-2个龄期，说明转Bt基因棉对幼虫的生长发育有明显抑制作用。 经对苏棉102、苏棉191及苏棉310三个江苏转Bt基因棉株系的抗虫性初步评估，发现其对棉铃虫敏感品系SUS_2初孵幼虫的抗虫效果次序为苏棉102（主茎第3、5、10及15叶5天处理效果为82.0％、91.0％、75.0％及52.0％）＞苏棉191（主茎第3、5、10及15叶5天处理效果为62.0％、86.0％、65.0％及36.0％）＞苏棉310（主茎第3、5、10及15叶5天处理效果为61.0％、61.0％、54.0％及36.0％），虽然抗虫性明显高于或稍高于对照苏棉12号，但远达不到新棉33~B的高表达水平，以上株系的抗虫效果还有待进一步改善和提高。 通过比较新棉33~B和苏棉12对敏感棉铃虫SUS_2、河北辛集新棉33~B大田棉铃虫和江苏丰县常规棉田棉铃虫的杀虫效果和幼虫生长抑制作用，初步提出了棉铃虫对转Bt基因棉抗性的检测指标，即棉铃虫初孵幼虫用转Bt基因棉主茎第8张以前各张叶片喂饲5天后，龄期达到2龄中期且体重达到0.8mg/头。建立了检测棉铃虫对转Bt基因棉抗性等位基因频率的新方法——单雌系F_2代遗传检测法。经对采自河北邱县新棉33~B大田的128个棉铃虫单雌系进行F_2代检测，发现转Bt基因棉新棉33~B在仅种植一年的情况下，大田棉铃虫对Bt棉抗性等位基因频率达5.8×10~(-3)以上，表明此法检测的灵敏度比传统的毒力回归线法（抗性倍数法）和区分剂量法至少高一个数量级，可适用于检测自然种群中抗性基因初始频率和早期抗性。鉴于该频率己达到躯略高于转Bt基因棉田庇护区加高剂量抗性治理对策的第二个假设条件（P司勺，因此应尽快制定和实施预防性抗性治理方案及措施。 用棉叶喂饲法对河北邱县棉铃虫120号单雌系进行了室内抗性选育，发现选育六代的棉铃虫初孵幼虫对新棉33B的敏感性己呈下降趋势，用转基因棉叶处理5天后，个别存活幼虫达到了抗性检测的揩标（二龄中期、体重为0．810二mg人 同对照组存在显著的差异，表明棉铃虫对转Bt基因棉新棉33”有产生抗性的风险。并发现被选育幼虫的历朔由原始种群的16．肚1．5天延长到18．5到．0《3．4L3．2天，因此我们认为应对转出基因棉田庇护区加高剂量抗性 一治理对策作进一步研究。 经测定河北邱县棉铃虫 120号单雌系各选育代次对 Bt生物农药的敏感性变化，发现 LC。。值门25－0．55mg／ml）和 LC。值爬．84－73石ling／ml）与原始群体的比。。值（0．07－0．09 ms／ml）和 LCgs值（0．69－0．82岭ml）相比均有所上升，抗性倍数在 2 8－7．8倍之间，抗性个体百分率也由原来的 0刀－4刀％上升到10刀刁2刀％，表明转 Bt基因棉和 Bt生物农药之间存在着一定程度的交互抗性。因此，在新棉33“种植区不宜使用Bt生物农药。
孙志新[5]2008年在《棉铃虫对双价（Bt+CpTI）抗虫棉抗性筛选及抗性机理的初步研究》文中研究指明棉铃虫Helicoverpa armigera(hübner)是世界性重要农业害虫,20世纪90年代以来,在我国连年暴发,对我国棉花生产的稳定发展构成极大威胁。转基因棉的大面积推广种植有效的控制了棉铃虫的暴发危害。由于转基因棉花在整个生育期都连续表达毒蛋白,从而使棉铃虫一直处于毒蛋白的持续选择压力下,棉铃虫对抗虫棉的抗性风险已经成为影响其使用寿命的关键因素。棉铃虫的室内抗性筛选,可以得到棉铃虫抗性种群,为抗性机理的研究打下基础。调查田间棉铃虫对转基因抗虫棉的敏感性水平,检测田间低水平的抗性基因频率,将为抗性治理策略的制定和实施提供可靠的依据。本文使用转基因棉花的种子粉作为毒蛋白来源对棉铃虫进行了室内筛选;研究了抗性棉铃虫体内酶系活力的变化;对2007年山东安丘、河北保定和河南安阳的田间棉铃虫种群对Cry1Ac的抗性基因频率进行了估算。1、棉铃虫室内抗性种群的筛选以双价(Bt+CpTI)抗虫棉(中棉所41)作为毒蛋白来源对2005年采自河南安阳的棉铃虫种群进行抗性筛选,以单价(Bt)抗虫棉(中棉所44)种子粉和常规棉(中棉所49)种子粉筛选的棉铃虫品系作为对照。用转双价基因棉筛选的棉铃虫品系为AYBC,用转单价基因棉筛选的品系为AYBT,饲喂常规棉的棉铃虫品系为AYCK。经14代筛选,AYBC品系和AYBT品系对Cry1Ac的抗性分别上升到4.0倍和4.6倍,AYBC品系和AYBT品系在毒饲料上生长5天后的发育进度为6.0-7.0,饲喂常规棉的棉铃虫AYCK品系发育进度为11.0左右,使用同一剂量对棉铃虫进行筛选,发育进度有上升趋势。本研究为研究棉铃虫抗性产生机理奠定了基础。2、转基因棉对棉铃虫几种主要酶系活性的影响研究了转双价基因棉(中41),转单价基因棉(中44)对棉铃虫幼虫中肠内解毒酶、保护酶和中肠蛋白酶的活性的影响,测定比较了12代连续取食含有转基因棉种子粉的人工饲料的棉铃虫中肠三种酶系的活性。研究表明,α-乙酸萘酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性在双价和单价品系中均有所下降,其中在双价品系中检测不到谷胱甘肽-S-转移酶活性。保护酶系的活性差异不显著。总蛋白酶的活性差异不显著,在双价和单价品系中强碱性类胰蛋白酶的活性高于对照品系,分别为对照品系的3.00倍和4.00倍,弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活性显著低于对照品系。3、不同地区棉铃虫种群对Cry1Ac制剂MVPⅡ粉剂的敏感性差异用毒蛋白涂表法测定了2006年和2007年山东安丘、河北保定和河南安阳的棉铃虫田间种群对Cry1Ac的敏感性水平,结果表明三个种群之间对Cry1Ac的敏感性差异不显著,相对敏感性指数均为敏感品系的1.1-1.7倍,说明三个地区棉铃虫田间种群对Cry1Ac还没有产生明显的抗性。4、棉铃虫田间种群对Cry1Ac抗性基因频率的估算对2007年山东安丘,河北保定和河南安阳的田间棉铃虫种群进行了抗性基因频率估计。经检测,2007年山东安丘种群的抗性基因频率为1.7×10~(-3),河北保定种群的抗性基因频率为2.0×10-3,河南安阳种群的抗性基因频率为0~2.9×10~(-3),由田间监测的结果可知,目前大田棉铃虫确实有一小部分个体对Cry1Ac的敏感性降低,但三个地区的种群对Cry1Ac还未产生明显抗性,抗性基因频率处于正常水平。棉铃虫对Bt抗虫棉的抗性风险依然存在,需要尽快启动全国性的早期抗性检测和预警工作。
潘利东[6]2013年在《棉铃虫对转Bt基因棉的抗性等位基因频率检测和对常用杀虫剂的抗性监测》文中认为本研究采用了F2代法和F1代法检测了河北邱县棉铃虫种群对转Bt棉的抗性等位基因频率变化,同时还用混毒饲料法测得Cry1Ac毒素对河北邱县等四地棉铃虫种群的毒力,并采用浸叶法监测转Bt基因棉田棉铃虫种群对甲维盐等六种杀虫剂的抗性变化,为转基因棉田的棉铃虫抗性治理提供依据。1、F2代法检测棉铃虫种群的抗性等位基因频率变化2010-2012年采用F2代法检测河北邱县棉铃虫种群对转Bt棉的抗性等位基因频率变化,结果显示所测基因频率值从2010年的0.0389(95%CI：0.0064～0.0714)、2011年的0.0372(95%CI：0.0036～0.0708)升高到2012年的0.0781(95%CI：0.0318-0.1244),已经远高于安全的初始抗性等位基因频率值0.005,需要尽快采取有效的抗性治理措施。2、Fl代法及毒饲料法监测田间棉铃虫的抗性2012年采用F1代法检测了河北省邱县棉铃虫田间种群对转Bt棉的抗性等位基因频率。结果表明,采集的124头田间雄虫中,检测出43头携带抗性基因,求得抗性等位基因频率为0.199(95%CI：0.124-0.274)。采用混毒饲料法测定河北邱县等四地转Bt棉田间棉铃虫对Cry1Ac的抗性。结果表明,河北邱县棉铃虫种群的抗性最高(RR为19.2倍),明显高于湖北荆州、湖北枣阳和安徽萧县三地种群的抗性(RR为4.9～9.3倍)3、转Bt棉田棉铃虫种群对6种杀虫剂的抗性监测为掌握转基因棉种植10多年后间棉铃虫的抗药性现状,2010-2012年本研究采用浸叶法监测了四省六地棉铃虫种群对三氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、辛硫磷、甲维盐、阿维菌素及多杀菌素的抗性,结果表明多地种群对三氟氯氰菊酯仍保持在高水平抗性(RR=41.8～107.8),对高效氯氰菊酯的抗性有所下降,为中等至高水平抗性(RR=10.4～82.6),对辛硫磷的抗性为敏感性下降至中等水平抗性(RR=4.8-23.7),其中安徽萧县2012年种群的抗性倍数最低为4.8倍,抗性倍数最高的为2011年河北邱县种群(23.7倍);对甲维盐、阿维菌素及多杀菌素三种抗生素类杀虫剂依旧保持敏感,抗性倍数在0.37-3.5倍之间,其LC50值因年份、种群不同而存在差异。因此当转Bt棉对棉铃虫的控制效果较差时,可选择甲维盐、阿维菌素或多杀菌素作为轮换药剂来防治田间棉铃虫。
魏秋学[7]2008年在《棉铃虫对转Bt基因棉抗性的分子检测方法研究》文中研究指明棉铃虫Helicoverpa armigera(H(u∣¨U)bner)是广泛分布于世界各大洲的重要农业害虫。上个世纪以来,棉铃虫对大多数的化学杀虫剂产生抗药性,使对其的防治愈加困难。Bt杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins,ICPs)因其具有对靶标昆虫的高度特异性和对人畜无害的安全性的优点,被人们应用于防治棉铃虫。但随着转Bt基因棉种植面积的不断扩大,转入的Bt毒蛋白在棉花的整个生长期内持续表达,使得棉铃虫在生长期间不断地受到转Bt基因棉的高选择压,存在着棉铃虫对转Bt基因棉产生抗性的风险。一旦棉铃虫对转Bt基因棉产生大范围或较大的抗性,那将是我国甚至世界的棉花生产毁灭性打击,因此,对棉铃虫对转Bt基因棉抗性的检测监测势在必行。检测田间棉铃虫对转Bt基因棉的抗性,可以对棉铃虫的田间种群的抗性发展作评估,对棉铃虫对Bt棉的抗性提供早期预警。棉铃虫对Bt棉的抗性基因频率的检测结果,将能直接指导棉花的种植。本研究的分子检测技术也可以为其他农业害虫的田间检测提供借鉴。传统的生物测定方法早已应用于监测害虫对Bt基因棉的抗性,但是传统的生物测定方法有其制约性,如:无法区分杂合子(sr)和敏感纯合子(ss)、采样量大、需饲养昆虫、费时、费力、灵敏度不够高等。以DNA为基础的抗性检测方法能直接检测到杂合子的抗性等位基因(r),可明显提高抗性检测的灵敏度和效率。基于DNA分子技术的检测技术与传统的需要活虫的生物测定技术相比,拥有很多的优点,如:(1)不管是显性特征还是隐性特征,DNA分子检测技术都可以区分个体是杂合子(sr)还是敏感纯合子(ss);(2)DNA分子检测技术直接检测基因的不同,而不是依赖于观察表型的不同;(3)DNA分子检测技术在害虫的各个生长发育期都可以应用,甚至是死虫也可以应用;(4)在抗性纯合子数量稀少的情况下,DNA分子检测技术比传统的检测方法更有效、更灵敏。本论文通过对比分析了对转Bt基因棉抗性的棉铃虫钙粘素mRNA序列(AY714874)和敏感mRNA序列(AY351904),以及抗性棉铃虫钙粘素基因组DNA序列(AY714875)和敏感棉铃虫钙粘素基因组DNA序列(AY714876)。选择保守的外显子序列区域,设计了5套引物用于检测抗性基因,并进行筛选。利用设计并筛选过的2套引物检测田间棉铃虫因钙粘素突变引起的对转Bt基因棉的抗性。结果表明,所设计的五套引物均能百分百地在棉铃虫室内品系DNA中扩增出清晰的特异性目标条带,但第二套引物的抗性条带和敏感条带,不易区分,不适合做田间检测;第一套引物和第四套引物虽然在棉铃虫室内品系DNA中的扩出率为100%,但是在扩增田间棉铃虫DNA时,有一部分田间棉铃虫DNA能扩增出条带,不适合做田间检测;第三套引物和第五套引物在棉铃虫室内品系DNA中以及田间棉铃虫DNA中的扩出率均为100%,适合于做田间检测。应用第三套引物和第五套引物对采集自河北邱县转Bt基因棉区的1585头棉铃虫进行检测,未发现与室内棉铃虫抗性一致的因钙粘素突变引起的对转Bt基因棉产生抗性的突变类型。
陈庆园[8]2005年在《棉铃虫对Bt棉的抗性个体检测标准与单雌系F_1代检测方法的研究》文中认为采用Bt棉叶片喂饲法对棉铃虫抗性品系(YCR)进行抗性筛选和保持,室内筛选YCR从第61代到72代。利用饲料感染法测定棉铃虫抗性品系的抗性倍数,结果表明:经室内12代筛选,YCR对21%MVP Ⅱ粉剂的抗性倍数稳定在2000倍左右。棉铃虫抗性品系得到保持和进一步的纯化,为研究棉铃虫对转Bt基因棉的抗性分子遗传机理提供了保证。 采用Bt棉叶片喂饲法和含Cry1Ac18.75μg/ml的饲料感染法,通过抗性、敏感亲本及其正、反交试验检测,建立了棉铃虫对转Bt基因棉抗性个体(rr)的检测标准。喂饲抗性品系(YCR)和敏感品系(HZS)亲本及正交F_1(YCR♀×HZS♂)、反交F_1′(YCR♂×HZS♀)后代的初孵幼虫。处理5天后的结果表明:喂饲Bt棉叶5天,F_1和F_1′存活幼虫的发育龄期为1龄到2龄初期,体重在0.1-0.7mg/头;HZS只有2头存活幼虫,龄期为1龄,体重均为0.1mg;YCR存活幼虫的80.9%发育龄期为2龄中期到3龄,体重≥0.8mg/头。喂饲含Cry1Ac 18.75μg/mL的饲料5天,F_1、F_1、HZS的存活幼虫体重均没有达到0.8mg/头,YCR存活幼虫体重≥0.8mg/头的个数(40头)占总处理虫数(50头)的80.0%,YCR、F_1、F_1′和HZS死亡率分别为(8.0±13.0)%、(66.0±11.4)%、(66.0±20.7)%和(88.0±10.6)%,YCR与F_1、F_1、HZS的死亡率差异极显著(p<0.01).棉铃虫对转Bt基因棉的抗性个体(rr)检测标准为发育龄期达2龄中期,体重≥0.8mg/头。上述结果通过回交试验得到进一步验证。 在室内通过用Bt棉选育棉铃虫抗性品系的基础上,采用单雌系F_1代检测法检测了2004年河北邱县棉铃虫对Bt棉的抗性等位基因频率。结果表明:检测的131个单雌系中,有32个单雌系的存活幼虫达到抗性检测标准(即龄期达到2龄中期,体重≥0.8mg/头),其河北邱县大田棉铃虫种群的抗性等位基因频率E(q)及方差Var(q)分别为12.4×10~(-2)和8.17×10~(-4),95%的置信区间为(0.1526～0.0954)。 采用等位基因特异性PCR扩增技术对32个单雌系的达标幼虫进行检测。结果表明:9个单雌系为阳性,即河北邱县Bt棉棉铃虫大田种群中携带钙粘素cDNA大片断缺失的抗性等位基因频率E(q)及方差Var(q),分别为3.76×10~(-2)和2.70×10~(-4),95%的置信区间为(0.0054～0.0698)。
苏建亚[9]2004年在《棉铃虫对转Bt基因棉抗性的分子机理及抗性基因分子检测技术》文中指出通过克隆棉铃虫敏感品系(YCS)和抗性品系(YCR)幼虫中肠Bt毒素受体基因，我们克隆到了棉铃虫幼虫中肠氨肽酶N基因家族4个成员的cDNA：APN1(AY358034)、APN2(AY346383)、APN3(AY279537)和APN4(AY279534)。其cDNA序列分别具有3220、3209、3053及2862个核苷酸，含有3042、3096、3045及2853bp的开放阅读框，编码产生1014、1032、1014和951个氨基酸的蛋白质。这4个氨肽酶均具有锌离子结合模体(HEXXHX_(18)E)和GAMEN结构域，为典型的锌金属蛋白酶。在N’末端均有疏水性信号肽用于引导该蛋白穿过胞膜到胞外，在APN2、APN3、APN4的C’末端还有糖基磷酯酰肌醇(GPI)锚添加信号序列，它是该蛋白质是否添加GPI锚的标志，但在APN1中未发现这一信号序列。 将棉铃虫的这4个氨肽酶的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫的氨肽酶氨基酸序列比对，根据同源性程度，鳞翅目昆虫的氨肽酶可归为5个组，组内各氨肽酶的同源性为55％～90％，组间的同源性为30％～45％。这4个氨肽酶分属其中4组，其中第2组还仅有棉铃虫的APN2(AY346383)和小菜蛾的APN2(AJ222699)，其它组内分别有5～9种昆虫的氨肽酶，预示着在第5组中还会有1个氨肽酶未克隆到。 比较抗性品系(YCR)品系与敏感品系(YCS)间各氨肽酶N成员的序列差异，抗性品系与敏感品系间APN1的氨基酸序列中只有2个氨基酸不同，而且均不在毒素结合部位，初步认为抗性品系APN1的2个氨基酸突变与毒素在结合部位的抗性无关；APN2有15个氨基酸的变化，其中有2个突变(谷氨酰胺~(137)→谷氨酸和缬氨酸~(173)→苏氨酸)位于Cry1A毒素结合区域；APN3有9个氨基酸的替代，其中苏氨酸~(183)→天冬酰胺位于毒素结合区域内；APN4有7个氨基酸的变化，其中有2个突变(组氨酸~(162)→酪氨酸和脯氨酸~(185)→丝氨酸)位于毒素结合区域内。抗性品系APN2、APN3及APN4位于毒素结合部位的这些突变氨基酸是否与抗性有关还不能排除，尚有待进一步试验研究来验证。 棉铃虫钙粘素基因的cDNA全长为5541bp(登录号：AY351904)，具有5190bp的开放阅读框，编码1730个氨基酸的多肽。推定的氨基酸序列为典型的跨膜蛋白，由含12个钙粘素胞外重复结构域(EC1～12)、一个由22个氨基酸组成的跨膜区(TM)以及126个氨基酸的胞质区(CP)组成，胞外区的N末端还有22个氨基酸的信号棉铃虫对转Bt基因棉抗性的分子机理及抗性基因分子检测技术肤.棉铃虫钙粘素氨基酸序列与蜂翅目其它昆虫的钙粘素具较高同源性50%~80%，与人的E一型钙粘素同源性仅为22%。编码棉铃虫钙粘素mRNA的基因组DNA序列(AY714876)至少由33个外显子构成，最长的外显子为308bp，最短的外显子仅1 sbp.每个结构域的外显子均被1一2个内含子所间隔，最大的单个内含子长度为1731bP。在棉铃虫中编码Ecs一ECll的DNA序列内含子变异很大，具较高的多态性。 在棉铃虫抗性品系YCR中，钙粘素基因缺失了4911一14吕70之间的核普酸近10kb(9959bP).从编码EC4的外显子后半部缺失到EClo与ECll相接部分，这区间的外显子和内含子全部缺失.并造成在成熟mRNA分子中缺失片段后面的序列被剪切掉，转录形成的mRNA分子仅1581bP，远小于敏感品系棉铃虫中肠的m只NA分子(554lbP)，其翻译产物仅剩428个氨基酸，也远小于正常钙粘素蛋白的1730个氛基酸，缺失了C末端的胞质区、跨膜区、胞外重复结构域的ECS一EC12及部分EC4.该突变钙粘素分子在被其N末端信号肤引导穿过细胞膜后，不能固定在细胞膜上，而成为胞外游离蛋白，无法促进cry1A。毒素与细胞膜间的相互作用，由此推断杭性品系中钙粘素基因的大片段缺失突变是引起杭性的一个重要分子机理.室内用杭性和敏感亲本及正交杂合子检测的结果验证了上述推测. 根据棉铃虫抗性品系钙粘素基因缺失突变的特点，选择确定了用等位基因特异性PCR技术(PASA)检测棉铃虫杭性基因的引物，敏感正向引物为Cad一sF3，杭性正向引物为Cad一RFI，反向引物为Cad一Rev2.该引物组合扩增的产物条带敏感品系为900b卜1 .1 kb，杭性品系为338bP，杂合子具有Ikb和338bP的两条带.PcR扩增的条件是:95℃预变性3min:94℃变性305，62℃退火305，72℃延伸lmin，35个循环.用上述引物组合，检测了从河北威县采集到的棉铃虫，在采集到的136个单雌系中，19个单雌系经F;法检测为杭性个体，用PASA法检测到其中有一个个体为携带有钙粘素突变杭性等位基因的杂合子.关键词:棉铃虫;杭药性;受体蛋白;钙粘素;氨肤酶
唐铭一[10]2015年在《新型转基因棉花对棉田节肢动物群落的影响及棉铃虫田间种群Cry2Ab抗性等位基因的F_2检测》文中研究表明棉花是一种重要的经济作物,我国是世界级产棉大国,棉花产量多年稳居世界第一,因此棉花在我国种植业中具有很重要的地位。但是一直以来棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)的为害是棉花生产的主要威胁,化学防治是控制其为害的主要方法。此种方法虽然见效快,但是对环境污染严重,而且更重要的是棉铃虫由于自身的生物学特性导致其极易对各类杀虫剂产生抗性。上个世纪80年代末到90年代初棉铃虫对化学杀虫剂的抗性大暴发,给棉花生产造成了重大损失。随着科学技术的发展和农业生物技术的进步,我国在1997年开始推广种植转Bt基因抗虫棉(即第一代转Cry1Ac毒素基因抗虫棉),由于其对靶标害虫棉铃虫良好的控制作用,种植范围迅速扩大,到2014年全国转Bt基因抗虫棉的种植面积已达到390万公顷,占全国棉花种植面积的93%。随着转Bt基因抗虫棉的广泛推广应用,棉田主要害虫棉铃虫的数量得到了有效控制,同时也减少了化学杀虫剂的使用,有效保护了天敌,改进了农田生态系统,表现出了明显的经济效益、社会效益和环境效益。为了克服棉铃虫可能对转Bt基因抗虫棉产生抗性,在抗虫棉推广的伊始就提出了抗性治理的高剂量避护所策略,后来又引入基因叠加策略即转双价Bt基因抗虫棉的应用。虽然有抗性治理的预案,但随着转Bt棉花在各国的广泛种植,长期的选择压力导致的棉铃虫对转Bt基因抗虫棉的抗性,仍然是棉花生产中的重大问题。因此寻找新的抗虫策略极为必要,利用植物表达与昆虫特定基因匹配的dsRNA的RNAi技术控制害虫成为了最新的选择。本研究对转入棉铃虫激素合成代谢途径中起关键作用基因的dsRNA的棉花进行了对棉田节肢动物群落影响的调查,以全面评价这类新型转基因棉花的生物安全性。另外采用F_2检测方法对我国各大棉区的棉铃虫对Cry2Ab毒素抗性基因的频率进行了调查。本文的研究结果对于指导转基因抗虫棉的未来发展以及棉铃虫Bt抗性的治理具有重要意义。1.新型转基因棉花对棉田节肢动物群落的影响具有全新抗虫策略的转dsRNA棉花是一种理论上有效的控制棉铃虫为害的新型转基因棉花,对其开展对棉田靶标害虫棉铃虫、非靶标害虫及天敌影响的调查,是转基因作物生物安全评价的一项重要内容,也是考量这类新型转基因棉花未来应用前景的一个重要方面。本研究以两种表达与昆虫激素相关基因的dsRNA的转基因棉花(新型转基因棉花)、转单价和双价Bt基因抗虫棉以及常规棉为对象,系统调查了在棉花生长季中棉田棉铃虫、其它非靶标害虫和蜘蛛、瓢虫、草蛉等天敌的数量变化,分析了棉田节肢动物群落组成并采用群落多样性指数、优势度指数和丰富度指数等参数评价了不同类型棉田节肢动物的情况等。结果显示除了常规非抗虫棉的咀嚼式口器害虫数量明显高于其它类型棉田外,余下各种类型棉田群落组成没有差异,各个生物学参数间也没有发现差异。因此,新型转基因棉花对棉田的非靶标害虫和天敌无不利影响,但从棉铃虫的数量及为害情况看,新型转基因棉花比转Bt基因棉花对靶标害虫棉铃虫的效果要差,要想将此类棉花应用于生产实际可能还需要更多的工作。2.各地区棉铃虫田间种群Cry2Ab抗性等位基因的F_2检测2014年对河南安阳、山东夏津、河北廊坊、新疆沙湾4个地区的田间棉铃虫种群对Cry2Ab毒素的抗性等位基因频率进行了F_2检测。河南安阳的田间棉铃虫种群,建立了 251个单雌系,检测了其中109个,检测出抗性单雌系数量11个,抗性等位基因数量11个,抗性等位基因频率为0.025;山东夏津的田间棉铃虫种群,建立的单雌系数量为176个,检测了其中63个,检测出抗性单雌系数量6个,抗性等位基因数量7个,抗性等位基因频率为0.028;河北廊坊的田间棉铃虫种群建立单雌系350个,检测了其中58个,检测出抗性单雌系数量14个,抗性等位基因数量14个,抗性等位基因频率为0.060;新疆沙湾田间棉铃虫种群建立单雌系150个,检测其中77个,检测出抗性单雌系数量为0,抗性等位基因数量0,抗性等位基因频率为0.000。本实验的研究结果可以看出,虽然我国还没种植转双价Bt基因抗虫棉,但种植Cry1Ac棉花历史比较长的地区,Cry2Ab毒素蛋白抗性基因频率明显较高,因此是否种植双价Bt棉花时应保持谨慎态度。
参考文献：
[1]. 棉铃虫对转Bt基因棉的抗性等位基因频率及其监测方法研究[D]. 陆萍. 南京农业大学. 2003
[2]. 应用单雌系F_2代法监测田间棉铃虫种群对转Bt基因棉的抗性[D]. 须志平. 南京农业大学. 2008
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