关键词：温度；盐度；循环水养殖系统；生物膜；修复水质；氨氮；亚硝酸氮
近年来，因传统的养殖模式存在养殖产量低、环境不友好、养殖病害频发、水耗大、受气候影响大，以及养殖效益差等缺点，已越来越不适应当代环保和安全生产的发展需要[1-2]。封闭式循环水养殖模式以其高产高效、环境友好、节水节能、水质稳定、生长迅速快等优点受到了广大养殖企业的青睐[3]。在封闭式循环水养殖系统中水处理中，生物净化（生物过滤）对维持养殖系统中各种理化指标稳定起着关键作用，但生物膜对水质净化效果受水体环境因子影响很大，尤其是盐度、温度的影响。作者以生物膜去除氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮、化学需氧量、pH等指标为依据，探讨了不同水温和盐度对生物膜构建与水质净化效果的影响，为循环水养殖生产管理提供理论指导。
1材料与方法
1.1 实验用的小型循环水养殖系统的设计和制作
在直径1.5m，高1.2m，有效体积800L的圆柱形的蓝色玻璃钢水槽中央挂置1只白色圆形塑料桶（桶身直径45cm，高75cm），在桶壁上用直径10mm的钻头均匀打孔50个，桶内正中心安装1台流量3000L?h-1的潜水泵（森森），潜水泵周边间填满直径为26mm的生物球（约360个球），利用潜水泵的抽水作用，使玻璃钢水槽内的海水经白色圆形塑料桶壁上的小孔不断地穿梭于塑料桶内生物球及其内部的空隙，在玻璃钢水槽内造成一个内循环水流，构建了以白色塑料
桶内的生物球为水质净化区，塑料桶内、玻璃钢水槽内的水体为养殖区的小型循环水养殖系统，具体实验装置如图1。有关生物球的参数见表1。
图1温度试验实验装置示意图
Fig.1 Temperature test device schematic diagram
1.2 主要检测仪器和试剂
722型分光光度计（上海菁华），电热炉（闻宸），HY-5B回旋式振荡器（金坛），盐度计（LS10T，速为），温度计（SUNSUN），数显pH计（陆恒生物），加热棒（SUNSUN），可调移液器（LICHEN）及实验室一般常规仪器、药品。
1.3人工污水的配制
1.3.1 温度实验人工污水配制：向实验水槽内注海水（盐度19）800L（水深75cm），配制成氨氮浓度为3mg/L的污水，水中投入氯化铵（2.5g）、亚硝酸钠（0.4g）、氯化钠（0.3g）、葡萄糖（0.5g）。为了加快系统内生物膜的形成，在水槽中加入2%生物滤池水作为生态制剂。
1.3.2 盐度实验污水配制：向实验水槽内注海水800L（水深75cm），投入氯化铵（2.5g）、亚硝酸钠（0.4g）、葡萄糖（0.5g），海盐（将海盐曝气溶解调节水体盐度）。为了加快系统内生物膜的形成，在水槽中加入2%生物滤池水作为生态制剂。
1.4 实验设计
1.4.1 温度实验
考虑到实际养殖条件，本实验共设5个温度梯度，分别为18℃、22℃、26℃、30℃、34℃，每个梯度使用1只小型循环水水槽，水温用带控温的电热棒控制，保证水体温度相对稳定，运行1天稳定后开始实验，每天用烧杯取水样200mL，供检测水中氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮、化学需氧量（COD）以及pH等指标之用，实验直至水体中的NH4-N和NO2-N浓度均降低到0.02mg/L水体稳定后结束。
1.4.2 盐度实验
实验共设置5个盐度梯度，分别为12、19、26、33、40，每天校正水体盐度1次，按照温度实验组进行试验。
1.4.3 硝化细菌活性实验
用剪刀剪取洞头基地循环水养殖系统生物滤池生物膜附着基（毛刷）5g。分离培养后得到菌悬液备用。
1.5 水质指标检测方法与数据处理
1.5.1水质指标检测方法
主要水质指标检测按《海洋监测规范》（GB 12763.4-2007）执行。
1.5.2 建膜完成标准和数据处理
循环水系统建膜完成的判断标准为NH4-N浓度降低到0.02mg/L，NO2-N浓度降低到0.02mg/L。实验数据用SPSS 11.0或Microsoft Excel 2003统计和处理。
2 实验结果
2.1 水温对循环水养殖系统水体中NH3-N浓度的影响
图2-1不同温度实验水槽中氨氮浓度变化
Fig.2-1 Different temperature in the flume experiment of ammonia nitrogen
图2-1表明水温18℃实验水槽中NH4-N浓度变化曲线相对比较平滑，降低速度比较慢，直至实验结束（第33天），水中的氨氮浓度还没降低到养殖用水标准；水温22℃实验水槽中NH4-N浓度，在实验开始后第34天降到0.02mg/L，达到了养殖水质标准；水温26℃实验水槽中NH4-N浓度降低，在实验前期比较慢，到第26天开始明显加快，第32天达到了养殖水质标准；水温30℃实验水槽中NH4-N浓度，在实验开始后第10天开始迅速降低，第22天达到了养殖水质标准；水温34℃实验水槽中NH4-N浓度，在实验开始后第27天后开始明显降低，第29天达到了养殖水质标准。可见，实验开始后各组的氨氮浓度或早或迟开始明显降低，最后达到或接近海水养殖渔业用水标准，但不同水温组对实验水槽中的氨氮的吸收和转化速度和效率有所不同，其中以水温30℃ 组NH4-N浓度，开始降低早且降低迅速。
2.2 水温对循环水养殖系统水体中NO2-N浓度的影响
图2-2不同温度实验水槽中亚硝氮浓度变化
Fig.2-2 Variation of nitrite nitrogen concentration in a tank at different temperatures
如图2-2可见，实验开始后各实验水槽中的NO2-N浓度均呈逐渐上升，然后达到顶峰形成拐点，变为下降。但到达顶峰的时间和峰值有所不同。实验结束，除水温18℃组外，其他各组所需的时间基本接近。水温18℃组的NO2-N浓度，实验开始后一直缓慢升高，到第34天实验结束时，还在升高；水温22℃组的NO2-N浓度，实验开始后第25天达到顶峰，峰值为2.53mg/L，然后极速降低，35天为0.02mg/L，达到渔业用水标准；水温26℃组的NO2-N浓度，实验开始后第23天达到顶峰，峰值为2.31mg/L，然后极速降低，32天为0.03mg/L，达到渔业用水标准；水温30℃组的NO2-N浓度，实验开始后第18天达到顶峰，峰值为2.10mg/L，然后极速降低，34天为0.015mg/L，达到海水养殖渔业用水标准；水温34℃组的NO2-N浓度，实验开始后第21天达到顶峰，峰值为2.01mg/L，然后极速降低，33天为 0.028mg/L，达到海水养殖渔业用水标准。
2.3 水温对循环水养殖系统水体中NO3-N浓度的影响
图2-3不同温度实验水槽中硝酸氮浓度变化
Fig.2-3 Variation of nitrate nitrogen concentration in water tank at different temperatures
图2-3显示，循环水系统中NO3-N浓度基本上要在一周后才开始慢慢上升，其中上升相对较快的是水温30℃组，然后为水温34℃组、水温26℃组和水温24℃组，最慢的是水温18℃组。生物膜形成过程，是亚硝化细菌、硝化细菌及一些有益菌生长繁殖的过程，即随着硝化细菌群的建立，随着NH4-N和NO2-N不断去除，NO3-N浓度也在发生变化。因此，随着NO2-N的不断去除，NO3-N必将不断增加，当NO2-N逐渐转化去除完时，NO3-N浓度增加也相对缓慢，从图2中看出，不同温度组在30天后，NO3-N浓度变化曲线逐渐平滑，NO3-N浓度增加速度放缓。
2.4 水温对生循环水养殖系统水体中化学需要量（COD）的影响
图2-4不同温度实验水槽中COD浓度变化
Fig.2-4 Different temperature in the flume experiment COD concentration changes
随着循环系统中微生物不断地生长繁殖，各组中的COD均在实验开始后2周左右，开始下降。其中下降最快的是水温30℃组，然后为温34℃组、温26℃组和温24℃组，最慢的是温18℃组。水温30℃组的COD浓度，在实验开始后2周左右快速下降，到第34天，由原来的5.328mg/L 降低为2.296mg/L。
2.5 盐度对循环水养殖系统水体中NH4-N浓度的影响
图2-5 不同盐度实验水槽中氨氮浓度的变化
Fig.2-5 The change of the concentration of ammonia nitrogen in different salinity experiment flume
从图2-5看出，盐度19组在循环系统建立时就表现出明显的优势，随着实验的进行，水体氨氮不断减少，特别到17~19天时，氨氮降低十分迅速，当实验进行到21天时水体氨氮降到0.02mg/L以下，达到了养殖用水标准。盐度12组，水体氨氮一直处于一种持续下降的状态，相较盐度19组缓慢，当到达28天，基本达到养殖用水标准。盐度26组，相比于盐度12组实验的进程提前，但实验进行到20~22天时，氨氮浓度迅速降低，到24天时氨氮浓度降低到养殖用水标准。但从图表中看出盐度33和40两组，氨氮明显处于缓慢降低的状态，当其他组已经达到养殖用水标准时，两组氨氮依然处于一种较高的浓度。但实验进行到29天时，盐度33组基本完成，而盐度40组还依然进行。可见，随着实验的进行，5个盐度组都能够完成净化水体氨氮的任务。只是，不同盐度表现出了不同的效果，相比较在盐度为19的水体对氨氮去除效果比其他组要好。
2.6 盐度对循环水养殖系统水体中NO2-N浓度的影响
图2-6不同盐度实验水槽中亚硝氮浓度变化
Fig.2-6 The change of nitrite nitrogen concentration in water tank of different salinity
图2-6可见，实验开始稳定运行后，随着氨氮浓度不断降低，水体NO2-N浓度呈逐渐上升的趋势，随着实验的进程，NO2-N不断地积累，不同盐度组NO2-N浓度都会到达一个最高点，随后NO2-N浓度开始降低。盐度12组在实验开始第21天NO2-N浓度到达最高1.57mg/L，之后NO2-N浓度迅速降低，当到28天时，NO2-N浓度降低到0.012mg/L。而盐度19组，相比于12组NO2-N浓度累积的速度明显加快。不同时间段，NO2-N浓度一直处于较高的位子，峰值也处于最高的水平，在实验14天时，NO2-N浓度到达最高1.874mg/L，在第26天降低到0.021mg/L，基本达到养殖用水标准。盐度26和33两组，NO2-N浓度比较相近，峰值也比较接近，但依然低于盐度19组，两组分别28天和29天NO2-N浓度降到最低。对于盐度40组，NO2-N积累的速度相对过缓，当实验进行到第25天，到达它的最高点1.711mg/L，随后缓慢降低，当实验完成时NO2-N浓度依然没有降低到养殖用水标准。
2.7 盐度对循环水养殖系统水体中NO3-N浓度的影响
图2-7不同盐度实验水槽中硝酸盐氮浓度变化
Fig.2-7 Variation of nitrate concentration in water tank with different salinity
从图2-7中看出，不同盐度组，NO3-N浓度都呈现稳步上升的趋势。盐度19组NO3-N浓度一直处于最高点，当实验结束时NO3-N浓度为0.579mg/L。而盐度12和26两组，NO3-N浓度处于一种竞争的趋势，开始实验前几天盐度26组NO3-N浓度高于盐度12组，实验结束后盐度12组高于盐度26组，NO3-N浓度分别为0.498mg/L、0.47mg/L。对于盐度33和盐度40两组NO3-N浓度曲线则相对较缓，一直处于较低的水平。
2.8 盐度对循环水养殖系统水体中化学需要量（COD）的影响
图4-4不同盐度实验水槽中COD浓度变化
Fig.2-8 Variation of COD concentration in water tank with different salinity
从图表中看出，在实验开始进行前几天COD都处于较高的水平，去除的速率也十分缓慢。当实验进行到第5天时，盐度19组COD浓度则发生明显降低，实验进行到8~9天，其他各盐度组COD浓度也明显降低。实验结束时，各盐度组COD都降低到最低点，盐度12、19、26、33、40 COD浓度分别为2.879mg/L、3.078mg/L、3.371mg/L、3.409mg/L、3.755mg/L。
2.9 硝化实验结果
（1）将培养的亚硝化细菌菌株接种到富集培养基中，分离得到6个菌落标记为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6，进行格利斯试剂反应，得到以下实验结果。
表2 亚硝化细菌分离株的初筛结果
Tab.2 Preliminary screening results of the isolated strains of the sub-nitrification bacteria
分离株Y1Y2Y3Y4Y5Y6
反应颜色++++++++++++
注：+为无色；++为浅红色；+++为深红色。
从上表看出，亚硝化菌群富集培养分布是不均匀的，对格利斯试剂作用效果颜色也出现了明显的差异。对比6种不同菌株，Y2、Y4为无色，说明并未出现亚硝酸盐，Y1、Y4出现了浅红色，说明产生了少量亚硝酸盐，对于Y3、Y5菌株成深红色，说明产生了大量的亚硝酸盐，同时也说此菌株为亚硝化菌菌株。
（2）作者选择培养较好的Y3菌株继续分离纯化，通过电子显微镜观察发现，亚硝化菌落均匀的分布在固体培养基上，分布形状呈圆状和片状，继续分离纯化会呈现点状，最终得到纯化的菌株是呈黄色的小圆点。将分离纯化的菌落用无菌水稀释，革兰氏染色镜检观察，可以看出经过革兰氏染色后细菌呈红色，表明此菌为阴性菌，图中有明显的两种大小不一的菌体，由黄珏实验结果可知亚硝化菌为椭圆形球菌，体积较大，硝化菌体积较小。
图2-9 亚硝化菌镜检图
Fig.2-9 Microscopic examination of the nitrifying bacteria
图2-10 硝化菌镜检图
Fig.2-10 Microscopic examination of the nitrifying bacteria
（3）作者选用Y3、Y6菌株进行对比富集培养，在25℃的培养箱中培养7~10d后，接种到亚硝化细菌的富集培养基中，重复3个实验组，每个接种管接种量20%。在25℃、pH为7.5、130r/min的条件下摇床振荡培养，间隔12h在波长600nm处测其吸光度（A），同时测定培养液亚硝酸盐氮的含量结果如下。
图2-11亚硝化细菌的生长曲线
Fig.2-11 The nitrifying bacteria growth curve
图2-12亚硝酸盐氮生成质量浓度与培养时间的关系
Fig.2-12 Nitrite nitrogen generating mass concentration and incubation time
由上图可见，随着时间进行培养亚硝化细菌数量逐渐增加，Y3、Y6细菌数量先后到达最高点，之后逐渐减小，同时亚硝酸盐逐渐积累，质量浓度也越来越大。从培养结果来看，培养初期亚硝化细菌生长缓慢，随后才能快数繁殖。所以，Y3和Y6菌生长呈“S”生长，同时由于亚硝化细菌是化能自养菌，生长较缓慢，在48h左右才开始进入对数生长期。这和张辉对亚硝化细菌的生长曲线研究结果相一致[12]。从图可看出，Y3菌与Y6菌对生成亚硝酸盐氮的适应期和过渡期较长，为0~7d，在该时间内，亚硝酸盐氮质量浓度较低，在7~10d，亚硝酸盐氮质量浓度增加幅度较大，说明亚硝化细菌活性较大，推测可能是进入对数增长期。因此对菌种的生长周期认识是亚硝化细菌利用的依据，为提高利用率应选择对数生长期的菌体，以保持亚硝化细菌的相对较高活性。
3 讨论与分析
3.1 循环水养殖系统生物膜构建的最适水温
实验表明：海水循环水生物膜的构建与完成，与水温关系密切。在实验设定的水温范围内（18℃-34℃），30℃的水温，对构建海水生物膜最为有利，温度过高或降低都会延长生物膜的构建时间。海水生物膜对氨氮的吸收主要由硝化菌完成，有研究表明，温度对硝化细菌繁殖影响较大，最适合硝化细菌生长繁殖的温度为25~35℃[4]。也有研究表明，温度对建膜微生物体中酶活性以及细胞成分产生一定影响，如当细菌体内的温度过高或过低都会抑制酶的活性，进而影响生物膜的构建[5]。当温度过低时，细菌细胞膜呈现凝胶状态，此时所需的营养物质难以运输，细胞因此缺乏营养而停止生长，而温度过高不仅影响酶的活性，也可能会导致细胞中核酸或蛋白质变性，杀灭细菌，生物膜也难以形成[5-6]。可见，温度对细菌生长发育有着明显的作用，当硝化细菌处于合适的温度环境下，快速繁殖生长，水体内氨氮不断消耗降低，生物膜快速构建大大速度缩短了挂膜时间。本作者认为，温度对于硝化细菌的生长和硝化速率有着较大的影响，水温30℃是最适合此海水环境下的硝化菌生长和繁殖，所以生物膜形成也快，过高或过低的水温均会减缓或抑制硝化菌生物酶的活性，进而影响硝化菌的生长和繁殖速度，延长了海水循环养殖系统生物膜的构建时间。
3.2盐度对循环水养殖系统生物膜构建的影响
实验表明：海水循环水生物膜构建完成同样与海水盐度有着密切联系。将实验设定的5个盐度组（12-40），盐度为19组表现出对生物挂膜的有利条件，而对于盐度40组，则表现出明显的缓慢作用。但对于盐度12和26两组对生物膜构建各项指标分析看出，两组盐度在生物膜构建过程中表现出了一定的相似性。说明盐度在建膜过程中并不是越大越好也不是越小越好。本作者发现，氨氮在降低过程中不同阶段降低速率有明显不同，低盐度组如12、19两组在建膜初期氨氮率先降低，而盐度26组却表现出了一定的滞后性，随着实验不断进行，盐度26组氨氮下降的速率又会明显高于低盐度组。在高盐度33和40两组，则表现出先慢后快的氨氮下降率。有研究表明亚硝化菌和硝化菌对低盐度海水适应性更好，随着海水的驯化亚硝化细菌对高盐度海水产生一定的适应能力，大量繁殖硝化作用也随之加强，因此氨氮也降低的快[7]。所以，在盐度26组中，前15天，氨氮下降比较缓慢，之后迅速降低，说明硝化菌经过一段时间适应了盐度的变化开始正常的繁殖发育，与其他研究结果相一致。也有研究发现，亚硝化细菌和硝化细菌对盐度的适应力是不同的，亚硝化细菌对盐度的适应力弱于硝化细菌，硝化细菌经过驯化后可以适应高盐度，不会造成细胞活性受阻，活性下降[8]。此实验作者认为，硝化菌群对盐度需要有一段时间驯化，当硝化菌群适应此海水的盐度时，建膜过程则会快速进行。
3.3 循环水养殖系统生物膜构建过程中COD的变化特征
COD是用来反应水体中有机物含量重要指标。水体中有机物含量对硝化菌群也会有一些影响，有研究表明，水体中有机物含量较低时，有利于硝化细菌的生长，所以硝化细菌出现的滞后现象可能与此也有关系，随着亚硝化细菌群建立，有机物逐渐减少，硝化菌群才能快速得到繁殖。水体中的COD整体呈现下降状态，最终的COD为30℃<34℃<26℃<22℃<18℃，表明不同温度组对去除有机物也有不同效果。在盐度试验中作者发现，实验完成时，不同盐度COD也有所不同，从数据表看出，盐度越低COD越高，盐度12、19、26、33、40组COD分别为40.15%、36.0%、29.9%、28.9%、21.9%。而温度实验在26℃盐度21测得COD为32.08%。研究表明，随着盐度的升高，系统中微生物的种类和数量不断减少，存活的硝化菌数量和种类也越来越少，同时活性也大大降低，新陈代谢缓慢，故当盐度达到一定值后，对有机物的去除效果会明显下降[10]。又有研究指出，在增加含盐量的初期，由于盐度的冲击，微生物尚未适应新环境，所以去除率会有所下降，随着微生物对含盐环境的适应，去除率便逐渐开始升高[11]。所以，盐度对COD的影响十分明显，在不同的温度下，盐度对COD的影响表现出了相似性。
4 结论
4.1 研究发现，在不同的温度和盐度组，NH4-N、NO2-N、NO3-N及COD浓度变化趋势表现出一定的相似性。说明生物膜构建过程是相同的，硝化菌生长作用过程也是一样的，都是先硝化菌生长繁殖，NH4-N下降，NO2-N浓度增加，亚硝化菌增长，NO2-N降低，NO3-N升高分解，建膜完成。
4.2 从生物挂膜时间来看，不同温度对生物膜形成存在显著影响。一般来说，随着温度的升高，18℃到30℃，易于生物挂膜，温度越高，所需要的时间越短。当温度到达34℃，温度过高对生物挂膜减缓了挂膜时间。说明在进行生物挂膜过程中要控制好环境温度，将温度控制在合适的温度下有利于生物膜的形成，缩短挂膜时间。盐度挂膜过程中盐度12-40，盐度19组表现出明显的高效性，盐度过高会减缓挂膜时间，但随着硝化菌群的驯化，也能完成生物挂膜，体现了不同时期挂膜的差异性。所以，在进行生物挂膜过程时，既要掌握合适的温度也要注意当地硝化菌种所需要的盐度，当盐度不适宜时，需要将菌种进行筛选驯化，将大大提高建膜时间，提高工作进度。
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论文作者:刘志明1,吴洪喜2,吴亮3,陈婉晴2
论文发表刊物:《建筑学研究前沿》2018年第9期
论文发表时间:2018/8/23
标签：盐度论文; 浓度论文; 硝化细菌论文; 水体论文; 水温论文; 生物论文; 水槽论文; 《建筑学研究前沿》2018年第9期论文;