王小东 聂明华 张强 (遵义市食品药品检验所 贵州遵义 563000)
【摘要】目的 建立高效液相色谱法测定肝乐欣胶囊中土大黄苷的含量测定的方法。方法 采用Eclise Plus C18 (250mmx4.6mm，3.5μm)为分析柱，流动相为乙腈-1%醋酸溶液(20：80)，检测波长326nm，流速为1.0ml·min-1，柱温30℃。结果 土大黄苷在2.076～20.76μg·ml-1范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9991)，平均回收率为99.7%，RSD为1.5%。结论 该方法操作简便、快速、准确、重复性好，可作为土大黄苷中土大黄苷的质量控制。
【关键词】HPLC 肝乐欣胶囊 土大黄苷 含量测定
【中图分类号】R927.2 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2013）35-0363-02
肝乐欣胶囊收载于国家药品标准(试行)：WS-10275(ZD-0275)- 2002，由土大黄、栀子、青鱼胆草、黄柏、茵陈、马蹄金、郁金、冰片8味中药组成[1]。具有清热解毒，利胆退黄，用于肝胆湿热所致的急慢性肝炎。土大黄苷是土大黄中的主要成分，具有抗菌、改善微循环、降血脂、降血糖、抑制过敏反应，调控机体免疫防御系统、抗血栓以及抗氧化等作用[2]。该制剂原质量标准中无土大黄苷含量测定方法[1]，因此建立肝乐欣胶囊中土大黄苷的含量测定方法加以控制质量具有实际意义，笔者建立HPLC法测定土大黄苷的含量，本方法操作简便、准确、重复性好。
1 仪器、试药
Agilent 1260高效液相色谱仪(二极管阵列检测器、四元泵、柱温箱、自动控温进样器)；梅特勒-托利多仪器公司ABS－204电子天平。土大黄苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110794-200803）。肝乐欣胶囊（贵州家诚药业有限责任公司提供，批号：20130101、20130102、20130103），阴性自制。乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：Eclise Plus C18 (250mmx4.6mm，3.5μm)，流动相为乙腈-1%醋酸溶液(20：80)，检测波长326nm，流速为1.0ml·min-1。柱温30℃。理论板数按土大黄苷峰计不低于3000。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液 精密称取土大黄苷对照品10.38mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品贮备液，再取5ml至50ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液 取肝乐欣胶囊装量差项下的内容物，混匀研细，取0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，称定重量，加热回流15分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3 阴性对照溶液制备
按处方量称取缺土大黄以外的其余药材，照制剂工艺及供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。
2.2.4 干扰试验 分别吸取阴性对照溶液，对照品溶液及供试品溶液各10μl，注入色谱仪中，供试品溶液中土大黄苷峰保留时间与对照品峰的保留时间一致，阴性无干扰。色谱图见图1。
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a.阴性对照b.土大黄苷对照品c.肝乐欣胶囊
图1 HPLC色谱图
2.3线性关系考察
精密吸取对照品溶液2、5、10、15、20μl,按“2.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，以对照品进样量浓度X(μg·ml-1)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：Y=18.729X+15.237 r=0.9991。结果表明：土大黄苷在2.076～20.76μg·ml-1范围内，呈良好线性关系。
2.4 精密度试验
取对照品溶液连续进样6次，每次10μl，测定土大黄苷的峰面积，计算峰面积平均值为214.6，RSD为1.3%（n=6），结果表明，仪器精密度良好。
2.5 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12h，测定其峰面积，计算峰面积平均值为195.7，结果土大黄苷峰面积的RSD为0.6%，表明供试品溶液在12h内稳定。
2.6 重复性试验
取同一批次样品(批号：)，照“2.2.2”项下的方法，平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。结果样品中土大黄苷的平均含量为9.35mg·g-1，RSD为2.0%。表明方法重复性良好。
2.7 加样回收率试验
取肝乐欣胶囊装量差项下的内容物，混匀研细，取0.1g（含量为9.35mg·g-1,批号：130303）共6份，精密分别加入土大黄苷对照品贮备溶液10ml，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，计算加样和回收率，表明回收率良好，结果见表1。
表1 回收率试验结果
肝乐欣胶囊土大黄苷的量 加入土大黄苷的量 测得土大黄苷的量 回收率 平均回收率 RSD
(mg) (mg) (mg) (%) (%) (%)
0.8957 1.038 1.9158 98.28 99.7 1.5
1.0238 1.038 2.0659 100.39 0.9818 1.038 2.0246 100.46 0.9238 1.038 1.9339 97.31 1.0210 1.038 2.0669 100.76 0.9902 1.038 2.0357 100.72
2.8 样品含量测定
取肝乐欣胶囊样品3批，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，按外标法以峰面积计算样品含量，结果见表2。
表2 样品测定结果(n=3)
批号 含量(mg/g) RSD%
20130101 9.35 0.1
20130102 8.78 0.9
20130103 9.68 1.6
3 讨论
3.1 波长的选择 在高效液相色谱仪中，在200－400nm范围内，对土大黄苷对照品溶液进行光谱扫描，结果土大黄苷最大吸收为波长326nm，故选择波长326nm。
3.2 流动相选择[3-4] 以考察了乙腈-水，甲醇-水，乙腈－1%醋酸溶液，甲醇－0.1%磷酸溶液等作为流动相色谱图。结果表明乙腈－1%醋酸溶液（20：80）为流动相，土大黄苷色谱峰峰形较好，与其它峰能完全达到分离效果。
3.3 提取方法的考察[3] 在试验过程中分别考察了以乙酯乙酯、甲醇作提取溶剂，超声提取15分钟和回流提取15分钟分别测定，结果表明，甲醇回流提取15分钟效果较好。同时考察了回流提取10分钟，15分钟、20分钟提取情况，结果表明，回流提取15分钟提取较完全，所以采用甲醇回流提取15分钟。
参考文献
[1] 国家药品标准(试行)：WS-10275(ZD-0275)-2002
[2] 陈志强，张文，张学良等。HPLC制备河套大黄中多羟基芪类化合物Rhaponti[J]，中成药，2004，26(11)：932-933
[3] 军事医学科学院院刊 2007年10月第31卷：498-499国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部 北京化学工业出版社.2010：130-131，525.
[4] 杨天展.高效液相色谱法测定胃得康散中土大黄苷的含量[J].时珍国医国药，2000，11(1)：31-32.
论文作者:王小东,聂明华,张强
论文发表刊物:《医药前沿》2013年第35期供稿
论文发表时间:2014-3-6
标签：大黄论文; 溶液论文; 色谱论文; 中土论文; 甲醇论文; 胶囊论文; 回收率论文; 《医药前沿》2013年第35期供稿论文;