梁廷波[1]2002年在《大鼠小体积肝移植模型的建立,移植物早期损伤机理及FK409的移植物保护作用研究》文中进行了进一步梳理第一部分 大鼠小体积肝移植模型的建立及不同体积肝移植的疗效 肝移植的发展至今已有40年的历史。从早年的动物实验到目前临床上成为终末期肝病的常规性手术，期间经历了对许多相关基础理论和技术上的认识和突破，其中包括移植免疫，器官保存和手术技术等方面。每一次的突破和进步几乎都是建立在动物实验的基础上，而大小动物全肝移植模型的成功建立止是这一基础的反应。然而，随着临床上受体数量的不断增加，供体短缺的问题越来越严重。许多受体在等待供肝期间死亡。为了缓解供体不足这一状况，减体积肝移植、劈裂式肝移植和活体肝移植等技术也随之出现并得到了发展，这在一定程度上增加了供肝的数量。就活体肝移植而言，从早期的成人—儿童间移植发展到目前成人—成人间移植，使这一技术应用范围得到了进一步扩大。但是，成人—成人活体肝移植经常会碰到供肝体积过小的问题，对受体而言，属于小体积肝移植的范畴。临床上发现：小体积肝移植术后有较高的并发症利死亡率。其原因除与供肝有功能肝细胞体积过少，不足满足于受体正常代谢的需要外，移植物植入后的缺血再灌注损伤也是导致有功能肝细胞数量进一步减少的重要原因，但有关确切的分子机制尚不清楚。正确了解这一机制是开展小体积肝移植移植物损伤保护治疗的前提，而建立小体积肝移植动物模型又是这一系列研究的第一步。大鼠小体积肝移植模型的建立目前研究的不多，也缺乏一可靠和标准的手术方法；另外，正常人鼠接受多少大小比例的肝脏移植物属于小体积肝移植也尚未定论。本实 浙江大学博十学位论文．中文摘要 梁廷波，2002 验拟通过对两种不同的供肝获取方法比较，探讨建立一简单、稳定、可靠的不同小体 积的人鼠肝移植模型。 材料牙方法 选川体重160—380克雄性SD人鼠作为实验动物，共分为六组：解剖观察组（组 ！）X 12只，全肝移植组（组＊）6只，50％小体积肝移植生存率观察组（组＊）8只， 30％小体积肝移植生存率观察组（组IV）27只，体外肝叶切除减体积组（组V）16 只和体内肝st切除减体积组（组VI）78只。所有动物均采用苯巴比妥腹腔内注射麻 醉门—50mg／kg），清洁环境下手术。组！只解剖SD大鼠各肝叶结构并计算各叶占全 f 肝重的比例，选取供受体及不同的肝叶保留组合方式，拟出 50％和 30％小体积肝移 植的肝叶选抒方法。全肝移植按 Kamada的二套管方法。50％和 30％小体积肝移植采 取先切除部分肝叱 包括左叶、郴1、二角叶、尾状叶，然后再按原位全肝移植的方 法植入。按肝叶切除的方式不同分为体外肝叶切除法（组V）和体内肝切除法（组VI）。 观察组！！一组＊动物7大生存率及组V组IV两种小体积移植物创建方法的优劣（包括 手术时问、冷缺血时间、术后并发症等）；比较全肝与小体积肝移植后动物体重的变 化。 结 果 人鼠5口I解剖中各叫·基本上均有白己独立的血．管供应，其体积大小依次为肝中卜I回 ＞左川、心川、尾状叶＞二角叶，分别；‘．全肝的36％，33％，16％，8％，和7％左右。 对丁50％左心体积肝移植模型的建立可选取供体体重略轻丁受体体重（一般相差20 一40 A左毛）的肝中叶和右n【·作为移植物；对丁30％左心体积的模地则保留肝中叶 即可。体外肝叶切除小体积移植物获取法较体内肝n－I切除小体积移植物获取法有更多 的手术并发症，如肝切除断面出血，卜空静脉扭曲和相邻肝叶血供障碍等（分别为 37．5％和5％p＜0刀川）；而两组在手术时间、移植物冷缺血时间方面无差异（分别 1！omsn＊S 92mln gomZn＊S somsn p＞0刀5）。全肝移植、50％小体积肝移植和3o ％小体积肝移植动物的生存率分别为 100％，62．5％和 22．2％。30％比例组与其它两 组比较有统计学上的显着性差异（卜＜O．000 和P—0刀3）；其中＜30％肝比例的移植 动物几乎均在术后48小时内死亡。各组肝移植动物术后l—2周均有一个体重显着下 降的过程，以术后2周为高峰。全肝移植组于手术后3—4周体重基本恢复到术前水 2 浙江大学博土学位论文－中文摘要 梁廷波，2002 平；而小体积肝移植术后4周受体体重仍较术前下降5％一6％。小体积肝移植尤其是 30％比例组术后动物清醒慢，精神差，有黄疽和腹水出现。 讨 论 日前常见的小体积肝移植模型建立方法有以卜叁种：l）选取体重相差悬殊的供 受体
汤黎明[2]2007年在《腺苷A_（2A）受体对大鼠小体积肝移植缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究》文中研究表明第一部分大鼠小体积肝移植模型的建立及其缺血再灌注损伤的初步研究目的建立稳定实用的大鼠小体积肝移植模型，并通过检测一些缺血再灌注损伤的指标，观察大鼠小体积肝移植术后缺血再灌注损伤的程度。方法健康雄性SD大鼠，体重为250g～330g，随机化分为供体组和受体组，取供体大鼠肝脏右中叶和右上、下侧叶为移植物，占受体大鼠肝重的36％～46％。门静脉、肝下下腔静脉采用改良的二袖套法吻合。观察受体大鼠移植术后24小时和7天生存率，死亡后解剖，分析死亡原因。以术前正常大鼠作为对照组，使用AST测定试剂盒检测受体大鼠术后24小时内血清AST的变化；酶促反应法测定移植术后6小时肝组织丙二醛(MDA)含量；观察移植术后6小时小体积供肝光镜和电镜下组织学变化；TUNEL法检测小体积供肝移植术后6小时肝细胞凋亡情况。结果1．大鼠小体积肝移植24小时生存率达66.67％(8／12)，7天生存率33.33％(4／12)。2．大鼠小体积肝移植术后受体血清AST含量较术前明显增高，术后6～12小时达到高峰。3．移植肝术后6小时过氧化产物MDA含量(1.34±0.38 nmol／mg prot)较正常大鼠对照组(0.60±0.14 nmol／mg prot)明显增加(P＜0.05)。4．小体积移植肝术后6小时表现出严重的小梁结构的破坏、门静脉周围的水肿以及空泡样变性。电镜检测也发现肝细胞内有大量的空泡以及线粒体严重肿胀的现象。5．小体积供肝移植术后6小时肝细胞凋亡指数(19.1±4.9)较正常大鼠对照组(1.2±0.7)也明显增加(P＜0.01)。结论建立了稳定的大鼠小体积肝移植模型，可用于小体积肝移植的实验研究；大鼠小体积供肝移植术后表现出严重的缺血再灌注损伤。第二部分A_(2A)R对大鼠小体积肝移植缺血再灌注后氧化应激反应的作用研究目的通过选择性激活腺苷A_(2A)受体(A_(2A)R)，观察大鼠小体积肝移植术后氧化应激反应的变化，探讨A_(2A)R激活对减轻大鼠小体积肝移植缺血再灌注后氧化应激反应的作用及机制。方法供肝获取后置于4℃冰冷生理盐水中修整保存80分钟，然后移植给同种受体大鼠。受体大鼠右侧颈外静脉置管，CGS组(n=15)于门静脉血流再开放的同时使用微量泵以0.5μg／kg／min速度持续静脉输入选择性A_(2A)R激动剂CGS21680 3小时；CGS+ZM组(n=15)使用CGS21680的同时，微量泵以0.5μg／kg／min速度持续输入A_(2A)R的特异性抑制剂ZM241385 3小时；对照组(n=15)处理同实验组，但在移植肝门静脉血流再开放时仅给予与实验组相同剂量和速度的生理盐水(25μl／kg／min)。各组随机抽取9只用于生存率研究；余6只移植后6小时分别取材进行相关检测，比较抗氧化剂(GSH，TOC，AA)的含量、抗氧化酶(SOD，CAT，GSH-Px)的活性以及脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量。结果1．CGS组大鼠7天生存率66.67％(6／9)，明显高于对照组33.33％(3／9)和CGS+ZM组33.33％(3／9)。2．CGS组大鼠肝脏血清AST含量(3578±597 U／L)明显低于对照组(8110±699 U／L，P＜0.01)和CGS+ZM组(7690±814 U／L，P＜0.01)，对照组与CGS+ZM组间差异无统计学意义。3．CGS组大鼠肝脏GSH含量(36.9±3.5 ng／mg prot)明显高于对照组(28.4±2.2 ng／mg prot，P＜0.01)和CGS+ZM组(30.6±2.2 ng／mgprot，P＜0.01)，对照组与CGS+ZM组间差异无统计学意义。4．CGS组大鼠肝脏TOC含量(0.32±0.05 ug／mg prot)明显高于对照组(0.24±0.04 ug／mg prot，P＜0.01)及CGS+ZM组(0.25±0.05 ug／mgprot，P＜0.05)，对照组与CGS+ZM组间差异无统计学意义。5．CGS组大鼠肝脏AA含量(3.06±0.65 ug／mg prot)明显高于对照组(1.89±0.45 ug／mg prot，P＜0.01)和CGS+ZM组(1.67±0.43 ug／mgprot，P＜0.01)，对照组与CGS+ZM组间差异无统计学意义。6．CGS组大鼠肝脏GSH-Px的活性(56.5±7.4U／mg prot)明显高于对照组(38.1±5.3U／mg prot，P＜0.01)和CGS+ZM组(40.7±7.0U／mgprot，P＜0.01)，对照组与CGS+ZM组间差异无统计学意义。7．CGS组大鼠肝脏CAT的活性(17.0±3.2 U／mg prot)和对照组(14.3±2.7 U／mg prot)及CGS+ZM组(15.0±2.5 U／mg prot)比较无明显差异。8．CGS组大鼠肝脏SOD的活性(601±59 U／mg prot)明显高于对照组(450±64 U／mg prot，P＜0.01)和CGS+ZM组(408±54 U／mg prot，P＜0.01)，对照组与CGs+ZM组间差异无统计学意义。9．CGS组大鼠肝脏MDA含量(0.83±0.15 nmol／mg prot)明显低于对照组(1.34±0.38 nmol／mg prot，P＜0.01)和CGS+ZM组(1.21±0.24nmol／mg prot，P＜0.05)，对照组与CGS+ZM组间差异无统计学意义。结论大鼠小体积肝移植缺血再灌注后产生大量氧自由基导致肝脏氧化损伤。A_(2A)R的激活可提高抗氧化酶活性，促进抗氧化物质的产生，增强机体抵御氧化应激的能力，缓解脂质过氧化状态，从而减轻小体积肝移植缺血再灌注后氧化应激反应，提高了小体积肝移植术后受体大鼠的生存率。第叁部分A_(2A)R对大鼠小体积肝移植缺血再灌注后炎性反应的作用研究目的通过选择性激活A_(2A)R，观察大鼠小体积肝移植术后炎性反应的变化，探讨A_(2A)R激活对减轻大鼠小体积肝移植缺血再灌注后炎性反应的作用及机制。方法实验分组、动物模型的建立及给药方法同第二部分。于门静脉血流开放的同时分别予CGS21680(0.5μg／kg／min，CGS组)(n=6)、CGS21680(0.5μg／kg／min)+ZM241385(0.5μg／kg／min)(CGS+ZM组)(n=6)或生理盐水(25μl／kg／min，对照组)(n=6)持续输入3小时。各组移植后6小时分别取材，采用RT-PCR及ELISA方法比较炎性因子TNF-α、IL一1β、IL-6和抗炎因子IL-10的基因及蛋白表达水平；通过检测髓性过氧化物酶(MPO)活性以反映中性粒细胞浸润情况；同时对肝脏组织进行HE染色及电镜观察。结果1．CGS组大鼠肝脏TNF-αmRNA表达较对照组和CGS+ZM组明显降低，TNF-α蛋白含量(140±27 pg／g)明显低于对照组(626±108pg／g，P＜0.01)和CGS+ZM组(723±133 pg／g，P＜0.01)；对照组与CGS+ZM组TNF-αmRNA表达及蛋白水平均无明显差异。2．CGS组大鼠肝脏IL-1βmRNA表达较对照组和CGS+ZM组明显降低，IL-1β蛋白含量(73±17 pg／g)明显低于对照组(273±57 pg／g，P＜0.01)和CGS+ZM组(253±53 pg／g，P＜0.01)；对照组与CGS+ZM组IL-1βmRNA表达及蛋白水平均无明显差异。3．CGS组大鼠肝脏IL-6 mRNA表达较对照组和CGS+ZM组明显降低，IL-6蛋白含量(2.27±0.41 ng／g)明显低于对照组(7.16±0.94ng／g，P＜0.01)和CGS+ZM组(6.28±1.36 ng／g，P＜0.01)；对照组与CGS+ZM组IL-6 mRNA表达及蛋白水平均无明显差异。4．各组IL-10 mRNA表达及蛋白水平均无明显差异。5．CGS组大鼠肝脏MPO活性(1.48±0.56 U／g prot)明显低于对照组(6.32±0.83 U／g prot，P＜0.01)和CGS+ZM组(5.70±0.81 U／g prot，P＜0.01)；对照组与CGS+ZM组间差异无统计学意义。6．HE染色显示：与对照组及CGS+ZM组相比，CGS组肝小叶结构完整，中央静脉充血较轻，中性粒细胞浸润较少。7．电镜结果显示：对照组及CGS+ZM组肝细胞结构完整性破坏，线粒体明显肿胀，微绒毛丧失；而CGS组肝细胞结构完整性尚可，线粒体及内质网轻度肿胀。结论大鼠小体积肝移植缺血再灌注后释放大量炎性因子，产生强烈的炎性反应。A_(2A)N的激活可降低小体积肝移植后大鼠肝脏内炎性因子TNF-α、IL-1β以及IL-6的蛋白和基因水平的表达，从而减轻其炎性反应，在小体积肝移植缺血再灌注损伤中起保护作用。第四部分A2AR对大鼠小体积肝移植缺血再灌注后细胞凋亡的作用研究目的通过选择性激活A_(2A)R，观察大鼠小体积肝移植术后细胞凋亡的变化，探讨A_(2A)R激活对减轻大鼠小体积肝移植缺血再灌注后细胞凋亡的作用及机制。方法实验分组、动物模型的建立及给药方法同第二、叁部分。于门静脉血流开放的同时分别予CGS21680(0.5μg／kg／min，CGS组)(n=6)、CGS21680(0.5μg／kg／min)+ZM241385(0.5μg／kg／min)(CGS+ZM组)(n=6)或生理盐水(25μl／kg／min，对照组)(n=6)持续输入3小时。各组移植后6小时分别取材，Western Blot法检测凋亡抑制蛋白Bcl-2和凋亡促进蛋白Bax、Caspase-3的表达；TUNEL法检测细胞凋亡指数的改变。结果1．CGS组大鼠肝脏Bcl-2表达较对照组和CGS+ZM组明显升高，对照组与CGS+ZM组间无明显差异。2．CGS组大鼠肝脏Bax表达较对照组和CGS+ZM组明显降低，对照组与CGS+ZM组间无明显差异。3．CGS组大鼠肝脏Caspase-3表达较对照组和CGS+ZM组明显降低，对照组与CGS+ZM组间无明显差异。4．TUNEL结果显示：CGS组大鼠肝脏细胞凋亡指数(7.6±2.8)明显低于对照组(20.0±4.8，P＜0.01)和CGS+ZM组(18.2±4.0，P＜0.01)，对照组与CGS+ZM组间差异无统计学意义。结论大鼠小体积肝移植缺血再灌注后引发细胞凋亡。A_(2A)R的激活可增强凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达，抑制凋亡促进蛋白Bax表达和Caspase-3的激活，从而减少细胞凋亡，减轻大鼠小体积肝移植术后缺血再灌注损伤。
徐世国[3]2005年在《大鼠小体积肝移植早期移植物损伤的信号转导通路和肺损伤机理的研究》文中研究指明第一部分:大鼠小体积肝移植术后早期移植物损伤的信号转导通路研究 前言 目前,肝脏移植已成为终末期肝病的唯一有效的治疗手段并得到广泛应用。然而,供体的短缺极大的限制了肝移植的发展。因此,为了缓解供体不足这一状况,劈裂式肝移植(SLT),减体积肝移植(RSLT)和活体肝移植(LDLT)等技术也应运而生并得到了较快的发展,这在一定程度上增加了供肝的数量。LDLT起源于上世纪九十年代初,最初应用于儿童肝移植,随着技术进步,逐渐扩大到成人一成人肝移植,使这一技术应用范围进一步扩大。与全肝移植相比,LDLT往往存在移植物体积过小的问题。供肝体积过小会引起术后诸如肝功能恢复不良或恢复延迟、腹水、黄疸、凝血功能障碍等问题,临床上称为小体积综合症(Small-for-size Syndrome,SFSS)。 肝功能不全或衰竭是肝移植术后经常遇到的问题,小体积肝移植尤为如此。与全肝移植相比,除了遭受共同的1/R损伤外,小体积肝移植还要遭受由于一过性门脉高压等血流动力学改变而引起的机械性损伤。然而有关小体积肝移植后移植物损伤的分子机制目前仍不清楚。Man等人研究表明小体积肝移植早期移植物内血管收缩基因的表达上调,伴随着黏附分子、凋亡信号的过度表达,同时移植物内保护性基因热休克蛋白-70(Hsp-70)和HO-1的表达下调与肝窦损伤程度相关,进而导致移植物损伤。Liang等的研究也表明,小体积移植物损伤与早期移植物内Egr-1的过度表达有关,同时伴随血管收缩基因ET-1上调
马涛[4]2012年在《脂肪间充质干细胞移植对大鼠小体积肝移植术后肝损伤的治疗作用及机制研究》文中认为实验目的：小体积肝移植术后移植物损伤可严重影响供肝功能,甚至诱发小体积综合征,危及受体生命。文献报道脂肪间充质干细胞(ADSC)移植可缓解局部组织微循环障碍,改善肝损伤,促进肝再生,但其能否保护小体积肝移植物未见报道。本研究拟探索ADSC移植对小体积肝移植物的保护作用及相应机制。材料与方法：无菌提取大鼠腹股沟脂肪带的ADSC,体外培养扩增,并进行诱导分化实验及表面标记物鉴定。通过RNA干扰技术构建包含GFP及抑制大鼠VEGF表达的短发夹RNA (shRNA)或阴性对照shRNA的质粒,经慢病毒载体包装后转染ADSC,特异性阻断ADSC表达VEGF。提取大鼠肝窦内皮细胞(LSEC),与不同浓度的转染阴性对照shRNA的ADSC (NC-shRNA ADSC)及转染干扰VEGF shRNA的ADSC (VEGFi-shRNA ADSC)共培养,24小时后采用Annexin V/PI试剂盒流式检测LSEC的凋亡比例。建立35%的大鼠小体积肝移植模型,术中经门静脉移植2×106NC-shRNA ADSC或VEGFi-shRNA ADSC,对照组经门脉输注等体积的Hanks缓冲液。观察各组大鼠术后100天生存情况,进行血清肝功能及病理学检测(H&E、透射电子显微镜),采用荧光显微镜进行活体肝脏灌注检测,通过实时荧光定量PCR、免疫蛋白印迹检测SFSLT术后各组肝脏内皮素-1(ET-1)、内皮素受体A (ETAR)、Bcl-2、Bax、Bad、p-bad的表达,采用免疫组织化学方法检测肝脏标本PCNA、Ⅷ因子的表达,并检测肝脏那个冰冻标本的GFP荧光,示踪移植入的ADSC。结果：(1)体外共培养实验表明：与相同数量的VEGFi-shRN ADSC相比,3×105NC-shRNA ADSC与LSEC共培养可明显降低LSEC的凋亡水平。(2) NC-shRNA ADSC移植组大鼠的肝功能(ALT. AST)及生存率显着高于对照组及VEGFi-shRNA ADSC移植组。(3)肝脏切片H&E染色显示NC-shRNA ADSC移植组大鼠的肝脏微结构基本正常；与之相比,对照组及VEGFi-shRNA ADSC移植组大鼠的肝脏结构明显破坏,表现为肝窦结构紊乱、局灶性肝细胞坏死及汇管区炎症细胞浸润等。透射电子显微镜下观察NC-shRNA ADSC移植组的肝窦超微结构基本正常,而对照组及VEGFi-shRNA ADSC移植组的肝窦内皮细胞线性结构破坏,可见细胞核皱缩等凋亡表现。(4)活体肝脏灌注检测显示NC-shRNA ADSC移植组的肝窦微循环状态明显优于对照组及VEGFi-shRNA ADSC移植组,表现为肝窦灌注指数高、肝窦直径小。(5)实时荧光定量PCR结果显示NC-shRNA ADSC移植组的ETAR表达水平明显低于其他两组,且该组的Bcl-2/Bax比值明显高于对照组,Bad表达水平明显低于对照组及VEGFi-shRNA ADSC移植组；免疫蛋白印迹结果与PCR结果一致,并表明NC-shRNA ADSC移植组的p-Bad表达明显高于其他两组。(6)NC-shRNA ADSC移植组的Ⅷ因子及PCNA免疫组化染色阳性的细胞比率均明显高于对照组及VEGFi-shRNA ADSC移植组。(7)术后第1天及第7天的大鼠肝内可见GFP阳性细胞,术后第14天及第30天的大鼠肝内未发现GFP阳性细胞。结论：小体积肝移植术后脂肪间充质干细胞移植可显着改善小体积肝移植物的肝功能、肝脏血流灌注状态,减少肝脏细胞凋亡,并促进肝细胞及肝脏微血管再生。脂肪间充质干细胞的这些作用主要是通过分泌血管内皮生长因子来实现的。
宋军[5]2008年在《大鼠小体积肝移植术后早期缺血再灌注损伤机制及腺病毒介导心肌营养素-1转染对其保护的实验研究》文中提出第一部分大鼠小体积肝移植模型的建立及其早期缺血再灌注损伤特点及机制的初步研究目的建立稳定可靠的大鼠小体积肝移植模型,比较小体积和全肝移植术后早期缺血再灌注损伤程度并初步探讨其可能的损伤机制,为探寻小体积肝移植新的治疗策略提供理论和实验依据。方法健康雄性Lewis大鼠,随机分为叁组:Ⅰ组sham组Ⅱ组100%肝移植组Ⅲ组40%小体积肝移植组。以Kamada的“二袖套法”非动脉化大鼠原位肝移植模型为基础,经过前期的熟练训练,采用体外肝叶切除的方法,以中叶作为供肝,建立理想的40%小体积肝移植模型。观察各组术后生存率和术后早期肝功能(AST和ALT)的变化;观察各组术后6小时肝脏光镜和电镜下组织学变化;酶促反应法测定各组术后6小时肝组织丙二醛(MDA)含量;酶联免疫吸附方法(ELISA)检测各组术后6小时肝组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;检测叁组术后6小时肝组织中髓性过氧化物酶(MPO)活性以反映肝组织中中性粒细胞浸润情况;TUNEL法检测叁组肝术后6小时肝细胞凋亡情况。结果1.与全肝移植组相比,小体积肝移植组术后生存率明显下降(pp＜0.05),小体积肝移植组7天生存率为33.3%(4/12),全肝移植组和假手术组大鼠术后7天生存率分别为83.3%(10/12)和100%(10/10)。2.大鼠小体积肝移植术后血清AST和ALT水平明显增高,术后早期肝功能损害严重。与全肝移植相比,小体积肝移植组术后早期2、6和24小时血清AST和ALT水平增高更加显着(p＜0.05)。3.小体积肝移植术后6小时表现为肝小叶结构破坏、明显的肝细胞空泡样变性,局灶性肝细胞坏死。电镜下观察发现线粒体严重肿胀,肝窦内皮细胞间隙扩大,部分内皮细胞脱落,微绒毛减少或消失。与小肝移植组相比,全肝移植组肝组织光镜和电镜下损伤表现相对轻微。4.小体积肝移植术后6小时肝组织MDA含量(1.83±0.32)较全肝移植组(1.19±0.23)明显增加(p＜0.01)。5.小体积和全肝移植术后6小时TNF-α水平和MPO含量明显高于假手术组,且小肝移植组较全肝移植组增高更加明显。40%小肝组VS全肝组,TNF-α(7.91±1.07 vs 4.56±0.73 p＜0.01);MPO(6.79±0.74 Vs 4.15±0.62 p＜0.01)。6.小体积肝移植术后6小时肝细胞凋亡指数(20.4±4.3)较全肝移植组(11.2±2.1)明显增加(p＜0.05)。结论建立了稳定可靠的大鼠小体积肝移植模型,为后续的实验研究奠定了基础。初步观察了小体积肝移植早期再灌注损伤的特点,发现小体积肝移植大鼠术后早期表现为较全肝移植更为严重的再灌注损伤。严重的氧化应激、加重的急性炎症反应和肝细胞凋亡是小体积肝移植物早期损伤加重的重要原因。第二部分:心肌营养素-1重组腺病毒载体的构建及鉴定、病毒的生产、扩增和纯化目的构建含小鼠CT-1基因的重组腺病毒载体pAd-CT-1,经鉴定成功后,293细胞包装同源重组产生腺病毒液。方法将编码小鼠CT-1cDNA基因通过PGEX4T-3-CT-1质粒SalI-NotI酶切位点克隆后再经相同的酶切位点亚克隆入pAdTrack-CMV穿梭质粒载体,建立含mCT-1基因的腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-CT-1。pAdTrack-CMV穿梭载体在(CMV)启动子调控下编码EGFP作为转染的标记。这个质粒通过PmeI限制性消化成线性并与pAdEasy-1共转入E.coli BJ5183细胞。重组子可以通过对卡那霉素耐药性筛选并通过限制性酶切分析确认。线性化的重组质粒应用Lipofectamine转染试剂在细胞株AD293内包装成病毒体。转染和病毒生产通过GFP的表达监测。采用CsC1密度梯度超离心法纯化捕?用空斑形成试验进行病毒滴度测定。结果经酶切、PCR及测序鉴定后,显示构建的腺病毒载体中含有mCT-1基因;目的基因片段结果与Gene bank中mCT-1 cDNA序列一致。经293细胞包装产生的病毒Ad-CT-1,纯化后滴度可以达到10~(12)pfu/ml。结论采用DNA重组技术,成功构建重组腺病毒载体pAd-CT-1,重组腺病毒液滴度高,为下一部的体内实验研究奠定了物质基础。第叁部分腺病毒介导心肌营养素-1转染对大鼠小体积肝移植缺血再灌注损伤保护及机制的实验研究目的探讨供肝腺病毒心肌营养素-1基因转染对大鼠小体积肝移植术后早期缺血再灌注损伤是否有保护作用及其可能的相关机制。方法采用健康雄性Lewis大鼠,体重为250-320g,采用随机化分组,实验分为叁组:(ⅰ)AdCT-1治疗组(ⅱ)AdEGFP对照组(ⅲ)生理盐水对照组。供体大鼠静脉预输注3×10~9 pfuAdCT-1病毒液,对照组则分别输注相同体积的生理盐水或3×10~9 pfuAdEGFP(以上均定容至1mL)。4天后处死供体大鼠,获取供肝,参照第一部分建立40%小体积肝移植模型,Westernblot检测和冰冻切片观察EGFP表达证实移植物中是否有外源性CT-1过表达;术后采血检测2、6、24小时血清AST和ALT水平变化;观察移植术后受体大鼠生存情况;光镜和电镜下观察术后6和24小时肝脏组织形态学变化;TUNEL法检测肝组织中细胞凋亡水平;Westernblot检测术后生存信号通道蛋白(Akt和磷酸化Akt;ERK和磷酸化ERK;Stat-3和磷酸化Stat-3)和凋亡相关蛋白(bcl-2和cleaved caspase-3)表达情况。结果1.供肝AdCT-1基因预转染能明显提高移植肝中外源性CT-1的表达。2.AdCT-1基因预处理能明显改善小体积肝移植术后肝脏功能,提高移植物生存率。生理盐水和AdEGFP对照组术后7天生存率分别为33.3%(5/15)和40%(6/15),而AdCT-1治疗组大鼠的生存率为73.3%(11/15)(p＜0.05);AdCT-1治疗组大鼠术后2、6和24小时的血清AST和ALT水平较生理盐水和AdEGFP对照组明显降低(p＜0.05 or＜0.01)。生理盐水和AdEGFP对照组术后生存率和肝功能变化无统计学差异。3.组织学分析:HE染色显示:移植术后6小时,AdEGFP和生理盐水对照组肝细胞明显空泡样变性伴局部坏死,肝小叶结构破坏;24小时后,肝细胞变性、坏死更加明显;门静脉周围水肿、充血,小叶结构破坏更加严重。与AdEGFP和生理盐水对照组相比,AdCT-1组变性和坏死明显减轻。肝小叶结构完整。电镜结果显示:移植术后6小时AdEGFP和生理盐水对照组肝组织线粒体明显肿胀,微绒毛减少或消失,肝窦内皮细胞间隙不规则扩大。术后24小时上述改变更加明显,部分肝窦内皮细胞脱落、塌陷。而在AdCT-1组肝组织学结构得到明显的改善,线粒体轻度肿胀,肝窦内皮细胞较完整,有较多的微绒毛。4.TUNEL结果显示:AdCT-1组术后6小时和24小时移植肝组织中肝脏细胞凋亡指数明显低于AdEGFP和生理盐水对照组(p＜0.01),AdEGFP和生理盐水对照组间差异无统计学意义。5.Westernblot检测显示:AdCT-1治疗组、生理盐水和AdEGFP对照组再灌注6和24小时移植肝组织中总Akt、ERK和Stat-3水平无明显差异,而磷酸化Akt、ERK和Stat-3水平在AdCT-1治疗组移植肝中显着上调。6.Westernblot检测结果亦显示:与生理盐水和AdEGFP对照组相比,AdCT-1治疗组再灌注6和24小时肝组织中抗凋亡蛋白bcl-2水平明显上调,而促凋亡蛋白cleaved caspase-3水平显着下调。结论供肝腺病毒心肌营养素-1基因转染对小体积肝移植早期缺血再灌注损伤有明显的保护作用,能够显着改善移植物早期肝功能、保护肝组织学结构,提高受体生存率。其保护作用可能部分因为CT-1激活术后肝组织中生存信号通道、增强凋亡抑制蛋白bcl-2的表达,抑制凋亡促进蛋白cleaved caspase-3的表达,从而减少细胞凋亡,减轻大鼠小肝移植术后早期缺血再灌注损伤。
梁靓[6]2009年在《小体积肝移植术后肝窦微循环变化及肝星状细胞的调节作用》文中进行了进一步梳理实验目的:对小体积肝移植的基础研究发现移植术后存在门静脉高灌注状态并导致早期细胞内稳态改变从而引起移植物损伤加重,但术后晚期或长期移植物状态特别是肝窦内微循环特点仍未明确。本实验在建立大鼠小体积肝移植模型基础上研究长期移植物肝窦微循环状态及内在的细胞调节作用。材料与方法:根据供肝体积建立大鼠小体积肝移植组(实验组)及全肝移植组(对照组),观察7天生存情况;检测术中及术后1小时内的门静脉压力;利用活体荧光显微镜观察移植物微循环状态;通过实时定量PCR、免疫蛋白印记等方法检测肝内与肝星状细胞活化相关蛋白、内皮素-1及其受体表达情况并并在光镜及透射电镜下观察移植物病理变化。此外,建立20对大鼠小体积肝移植模型并分成2组:于受体门静脉吻合开放即刻于门静脉分支处分别注射BQ-123或BQ-788,于术后检测微循环并取血清标本行生化检测。结果:(1)实验组7天生存率为50%,明显低于对照组(100%);(2)实验组血清ALT、AST水平在术后1天达到高峰且高于对照组,尽管1天后有所回落但仍持续高于对照组;并在术后3天起血清TB水平高于对照组;(3)实验组受体术后1h内门静脉压力要显着高于对照组,但此后两组门静脉压力均恢复到基础水平,无明显差异;(4)实验组术后肝窦微循环状态明显恶化,包括肝窦红细胞流速持续升高;肝窦再灌注情况明显降低;肝窦出现一定程度的扩张;肝细胞凋亡增加;肝细胞的核间距增大;在电镜及光镜检查中出现不可逆的病理改变;(5)实验组术后HSC活化增强,表现为:自发荧光减少、活化相关蛋白表达上调、形态改变等;(6)实验组术后内皮素-1及其受体(尤其是A型受体)表达升高,且受体主要表达于活化的HSC内而其他肝内细胞如肝细胞或内皮细胞表达较少;(7)小体积肝移植术后加用BQ-123能改善肝窦微循环,而术后加用BQ-788对肝窦微循环的影响不明显。结论:在小体积肝移植术后虽然门静脉压力在1小时以后恢复正常,但肝窦微循环的恶化是持续存在,并可能是导致移植物晚期损伤的重要机制。肝星状细胞在小体积肝移植术后发生明显的活化,胞浆内产生大量与细胞收缩相关的平滑肌肌动蛋白等纤维束提示该细胞对于术后微循环的调节发挥了一定的作用。术后高内皮素水平及肝内A受体表达的升高提示HSC通过细胞表面的A型受体收缩临近肝窦,从而发挥术后对肝窦直径及血流的自身调节作用。BQ-123能选择性阻断内皮素与其A型的作用发挥改善移植物微循环状态的作用。BQ-788的作用不明显也提示在B型受体通路在移植物损伤中并非关键因素。
任祖海[7]2008年在《肝大部切除术后小体积肝脏的保护性治疗及其机制的初步研究》文中提出第一章肝脏大部切除术小体积肝动物模型的建立目的:探讨建立肝大部切除术(major hepatectomy)小体积肝脏(small-for-sizeliver,SFSL)动物模型的可能性及其方法,为实验研究小肝综合征提供理想的动物模型。方法:采用20只SD大鼠行全肝切除术,用于计算肝脏各肝叶重量的百分比;对20只大鼠行90%肝大部切除术,进行手术方法和技巧的练习;另外20只大鼠采用Higgins-Anderson法行定型90%肝脏大部切除术,并对术后存活率进行观察。结果:SD大鼠肝脏右叶、中叶、左侧叶和尾状叶重量占全肝重量比分别为23%,36%,32%和9%,右下叶和右上叶重量占全肝重量比分别为7%和16%,右中叶和左中叶重量占全肝重量比分别为24%和12%,尾状前叶和尾状后叶重量占全肝重量比分别为5%和4%。手术成功率为95%(19/20)。1例死亡的原因为麻醉过深所致。10日生存率为30%(6/20)。结论:采用Higgins-Anderson法建立的肝大部切除术动物模型稳定可靠,可为小肝综合征的基础实验研究提供较为理想的研究手段和方法。第二章Terlipressin对肝大部切除术后早期门脉高灌注综合征保护性治疗的研究目的:探讨Terlipressin对肝大部切除术后再灌注早期门脉高灌注综合征的保护性治疗作用。方法:将36只大鼠随机分为两组,用于门脉高灌注损伤的血流动力学研究:特利加压素治疗组(Terlipressin group for hemodynamics,Th组)18只及生理盐水组,即对照组(control group for hemodynamics,Ch组)18只。两组大鼠均分别在给药前及再灌注后30分钟、1小时、2小时这4个时间点进行血流动力学观察,共分为6个亚组,分别为:Th1/2、Th1、Th2及Ch1/2、Ch1、Ch2,每亚组6只大鼠。余20只大鼠用于存活率研究,随机分为特利加压素治疗组(Terlipressin group for survival,Ts组)10只及对照组(control group for survival,Cs组)10只两组。采用肝大部切除术(90%)加肝门阻断(30分钟)动物模型,将Th组及Ts组大鼠在肝门阻断前通过阴茎背静脉注射Terlipressin,Ch组及Cs组采用相同的方法在相同的时间给予同等体积的无菌生理盐水。观察Terlipressin对小体积肝大鼠生存率及血流动力学的影响。结果:所有大鼠存活均超过24小时;Ts组10日存活率(80%)明显高于Cs组(30%),P＜0.05。Th1/2亚组(13.21±0.32cmH2O)门脉压力明显低于Ch1/2亚组(16±1.03cmH2O),P＜0.05;Th1亚组门脉压力降到最低,达11.52±0.17cmH2O,明显低于对照组Ch1亚组(13.5±0.18cmH2O),P＜0.05;与相对应组基础门脉压力比较,Ch1/2亚组门脉压力显着性增加,P＜0.05。Th1/2亚组门脉血流(7.21±0.21ml/min)与Ch1/2亚组(9.50±0.35ml/min)之间比较,Th1亚组(6.11±0.28ml/min)与Ch1亚组(6.99±0.19ml/min)之间比较均有显着性差异。同时,与相对应基础门脉血流量比较,Ch1/2亚组门脉压力显着性增加,P＜0.05。Th组中的Th1/2(88.12±1.28mmHg)、Th1(80.83±1.79 mmHg)及Th2(76.29±0.89 mmHg)亚组平均动脉压与相对应的Ch1/2(57.97±2.01 mmHg)、Ch1(59.86±1.75 mmHg)及Ch2(63.71±1.37 mmHg)亚组比较明显增高,有显着性差异,其P值均小于0.05。同时,Th1/2、Th1及Th2亚组与相应的基础平均动脉压比较也有明显增高,有显着性差异,P值亦均小于0.05。两组各亚组之间及各组内每个亚组与基础中心静脉压比较没有显着性差异。结论:Terlipressin能显着提高肝大部切除术后小体积肝存活率。肝大部切除术术后小体积肝高灌注状态属再灌注后早期一过性改变,门脉高灌注多在再灌注1小时后自行缓解。Terlipressin能有效缓解门脉高灌注状态,达到降低门脉压力及血流量的治疗效果,进而减轻门脉高灌注损伤。第叁章Terlipressin对肝大部切除术后早期小体积肝脏功能保护机制的初步研究目的:初步探讨Terlipressin对大鼠肝大部切除术后再灌注早期残余肝脏功能的保护作用及其保护的机制。方法:采用肝大部切除(90%)术后小体积肝大鼠动物模型,将60只大鼠随机分为两组:特利加压素治疗组(Terlipressin group,T组)30只及生理盐水组,即对照组(control group,C组)30只。两组大鼠均分别在再灌注后30分钟、2小时、4小时、6小时及24小时这5个时间点进行观察,共分为10个亚组,分别为:T1/2、T2、T4、T6、T24及C1/2、C2、C4、C6、C24。每亚组6只大鼠。对各亚组所有时间点不同的标本进行采集。血清标本进行丙氨酸氨基转移酶(ALT,alanine transaminase)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST,aspartate transaminase)及总胆红素测定。活体肝组织冰冻标本用于半定量RT-PCR法检测mRNA水平残肝内A20及iNOS基因表达水平。肝组织石蜡切片用于HE染色观察光镜下形态学改变、免疫组织化学法检测ET-1、A20及iNOS的细胞内表达分析以及TUNEL法原位检测凋亡细胞。结果:两组大鼠ALT、AST及Tbil在再灌注后24小时达到高峰,其中T6及T24亚组所有上述3个指标检测值明显低于相对应的C6和C24亚组,具有显着性差异,P值均小于0.05。A20除再灌注后半小时时间点外,余时间点T组各亚组较相对应C组各亚组表达明显上调,尤其T2亚组表达明显上调;iNOS在T组各亚组表达极弱。C2、C4、C6及C24均有表达:其中C2表达明显上调。光学显微镜下观察T组肝组织在再灌注后各个时间点形态学改变都较C组轻微。C24亚组肝组织见血管上皮细胞脱落、片状坏死、汇管区淋巴细胞侵润,而T24亚组肝小叶结构保持尚完整,肝细胞及汇管区形态学特征基本正常。C6亚组凋亡指数明显高于T6亚组,两组之间比较有显着性差异,P＜0.05。免疫组织化学染色结果提示,再灌注后1/2小时T组各亚组A20表达即成强阳性;再灌注后2小时达到高峰;2小时、4小时、6小时叁个时间点T组A20表达均强于C组相对应各亚组;24小时时间点两个亚组A20表达强度差别不明显。再灌注后1/2小时开始T组及C组相对应两亚组ET-1均有过度表达;T24亚组ET-1表达明显低于C24亚组。再灌注后1/2小时T1/2亚组iNOS即有过度表达,与C1/2亚组比较表达有下调;再灌注后24小时T24亚组iNOS表达较C24亚组明显下调。结论:Terlipressin不仅对于肝大部切除术后小体积残肝肝功能具有保护作用,可以预防肝功能进行性损害,改善预后,还具有改善残肝再灌注后早期炎性反应作用,这与iNOS的下调表达有关;Terlipressin可以减轻肝细胞凋亡,与A20基因表达上调有关;通过减轻肝窦机械性损伤,Terlipressin还有利于维持微循环稳定,与ET-1下调表达有关。
参考文献：
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