胡永祥[1]2005年在《聚乙二醇修饰牛血红蛋白作为红细胞代用品的初步研究》文中认为由于血液的需求量迅速增长,而天然血液的来源不足,而且病毒污染严重,开发具有携氧能力的人工红细胞代用品成为国际关注的研究热点。采用聚乙二醇修饰牛血红蛋白,能够延长血红蛋白在体内的半衰期,减少肾毒性,降低牛血红蛋白的免疫原性,并且原料来源广泛,是一种很有潜力的红细胞代用品。本文在对聚乙二醇修饰牛血红蛋白的研究主要分为三个部分:首先采用了离心加热和CO饱和法两种方法来提取和纯化牛血红蛋白,经过试验比较,最终选择了离心加热法来提取牛血红蛋白。所提取牛血红蛋白的纯度在96%以上,高于Sigma公司生产的牛血红蛋白的标准品(90%),产率也达到75%左右;并且通过化学消解——磷钼酸比色法测定自提血红蛋白中的磷含量为0.606mg/ml。此外,本文采用比色法测量提取牛血红蛋白中高铁血红蛋白的浓度。第二本论文选择了一条较新的路线合成了SC-mPEG,所得产品经NMR检验,符合SC-mPEG的特征吸收。第三本论文考察了不同条件下,SC-mPEG与血红蛋白的反应的产率,并且建立了分析PEG-bHb混合物的方法。研究发现pH8-10左右SC-mPEG对牛血红蛋白有较高的产率;在不同比例(20-100:1)下,SC-mPEG与bHb的反应产物有明显不同,比例越高,高分子量的产物占的比重就越大,而在反应温度和时间上,相对影响不如前两者大。鉴于常规检测很难准确判断血红蛋白的修饰程度,本论文采用TNBS方法检测SC-mPEG对血红蛋白的平均修饰率,并用GPC对PEG-bHb产物进行分离,得到了不同分子量阶段的产物组成的定量分析。通过Native-PAGE图进一步对自然活性状态下PEG-bHb上进行定性分析。此外,通过GPC发现,牛血红蛋白在缓冲溶液中绝大部分仍然保持四聚体形态。本文工作主要建立了聚乙二醇修饰牛血红蛋白的研究路线和分析方法,为进一步改善产物性质创造条件。
徐宇红[2]2004年在《EGDE交联血红蛋白制备红细胞代用品》文中进行了进一步梳理研究将乙二醇二缩水甘油醚（EGDE）作为蛋白质交联剂, 用来交联血红蛋 白(Hb), 制备红细胞代用品。 探索了这一交联反应的可行性，优化了交联条件。本文还发展了一种活性基 团干扰法，间接测定出EGDE在pH7.5下，主要作用基团为血红蛋白的巯基, 在 pH8.7 和 9.5 的条件下，主要作用基团为血红蛋白的氨基。 采用 SDS-PAGE 电泳、高效液相色谱和多角度激光散射联用法检测交联反 应结果。实验表明，不同的反应条件下可得到不同的反应产物，在35℃、pH8.7、 较低的血红蛋白浓度（20mg/ml）和相对较高的修饰剂比例（摩尔比 EGDE:Hb=100:1）下反应 4 小时，主要产物为分子内部亚基之间交联的血红蛋白， 且分子内交联血红蛋白相对总蛋白含量90%以上；在pH7.5、较高的血红蛋白浓 度（200mg/ml）和相对较低的修饰剂比例（摩尔比 EGDE:Hb=25:1）下反应 12 小时，主要产物为分子间交联寡聚血红蛋白，分子量范围在140－380KD之间， 其中二聚体血红蛋白占总蛋白量的74.7%，三聚体血红蛋白18.9％，四到六聚血 红蛋白6.4％，几乎无高聚物生成，是红细胞代用品的最佳分子量。 小鼠的安全性实验表明产品无毒性，论证了其作为红细胞代用品的生物安全 性。进一步研究了 EGDE 分子内交联血红蛋白和分子间交联寡聚血红蛋白各种 性质，包括携氧特性、等电点、交联特性、全波长扫描分析、蛋白质二级结构分 析等，探讨了其作为红细胞代用品的可行性。
王琳丽[3]2015年在《聚乙二醇修饰牛血红蛋白的制备及其抗失血性休克的研究》文中研究说明血液代用品通常以过期人血中纯化的人血红蛋白为原料,但多数地区血源短缺,且人血红蛋白P50较正常生理状态人血的P50低,限制了其使用。牛血红蛋白作为聚乙二醇修饰的血红蛋白主要原料能够解决血液代用品的原料短缺和P50低的问题。因此本研究中以牛血为原料,明确其制备代用品的理化性质、结构及功能,为解决原料来源问题和开发高P50的血液代用品提供数据支持。聚乙二醇修饰的血红蛋白具有较大的水化体积、较高的胶体渗透压及粘度,是血液代用品优秀的品种之一。本研究中,以聚乙二醇修饰的血红蛋白为例,制备不同原料来源的血液代用品。主要工艺过程如下:首先,聚乙二醇修饰血红蛋白的β93位巯基及巯基化的氨基制备聚乙二醇修饰的人血红蛋白(EAF-PEG-h Hb)和聚乙二醇修饰的牛血红蛋白(EAF-PEG-b Hb);然后,表征两者的物理性质、化学性质及结构,以明确EAF-PEG-b Hb在P50上的优势;最后通过小鼠重度失血性休克模型比较两者生物学效应。体外实验结果表明EAF-PEG-b Hb的P50值、胶体渗透压高于EAF-PEG-h Hb,达到实验目的,但同时也发现其自氧化速率较快。动物实验结果表明EAF-PEG-b Hb和EAF-PEG-h Hb改善平均动脉压(MAP)效果相同,但在改善失血性休克引起的酸中毒方面,聚乙二醇修饰的牛血红蛋白表现出较好的优势。这可能与其高P50和高胶体渗透压相关。
白坚石[4]2000年在《聚乙二醇修饰血红蛋白制备红细胞代用品的研究》文中研究说明本项研究以无基质血红蛋白(Hb)的化学修饰作为红细胞代用品的研究途径,以聚乙二醇(PEG)修饰Hb作为研究模式,旨在解决Hb偶联相关问题。内容包括:以生物信息学和量子化学的方法确定血红蛋白的修饰方式与修饰部位,以生物化学方法完成血红蛋白的分离纯化及修饰产物的制备,在此基础上进行相关修饰产物的理化性质、结构与生物学功效的研究。 用结构分析和分子模拟方法对牛与猪血红蛋白(bHb/pHb)的结构与表面性质进行了分析,并模拟了聚乙二醇(PEG)通过选择性连接物与血红蛋白偶联后对其结构及携氧功能的影响。结果表明,bHb与pHb与二聚体中分别有12个和13个赖氨酸残基的氨基具有较高反应活性,可以作为进行修饰部位,与5KD的PEG-Linker形成的共轭物将大于64KD,但不影响血红蛋白的携氧功能。 确立了一个简便的血红蛋白纯化方法及其纯度检测方法,完成了牛、猪、人血红蛋白的分离纯化。电泳结果表明,纯化产物以32KD的二聚体形式存在,其均一性较高。纯度检测结果表明,纯化产物中未见明显磷脂与核酸,其红细胞标志酶的活性亦低于人血清。拉曼光谱和全波长扫描证实Hb纯化产物空间结构与标准Hb相似,携氧功能未受影响。 以一定比例的血红蛋白纯化产物与PEG(5000)-Linker组成反应体系,在特定条件下完成偶联反应。电泳和三硝基苯磺酸显色结果表明,相当数量的PEG分子能与血红蛋白二聚体特异偶联,且60%以上偶联产物大于64KD。以全波长扫描方法分析血红蛋白的光谱特性,发现偶联产物波形改变。确立了PEG-Hb共轭物分离纯化条件,即通过DEAE-Spbarodex可纯化成成单一组分。 利用失血性休克大鼠模型对偶联产物的毒性和携氧扩容功能进行了检测,结果表明偶联产物未表现出急毒性,并能使休克大鼠的血压和心率恢复到一定程度。
路秀玲[5]2006年在《修饰血红蛋白作为红细胞代用品的研究进展和挑战》文中研究表明血源紧缺和病毒污染问题推动了血液代用品的研究,以血红蛋白为代表的红细胞代用品成为研究的重点。为克服血红蛋白直接使用的毒副作用,各种修饰技术得到了迅速发展,其中包括双阿司匹林交联、戊二醛交联、棉子糖交联、聚乙二醇偶联、脂质体包埋、生物可降解高分子包埋等。其中一些技术已经形成规模化制备工艺,产品进入临床试验,有的已在个别国家上市。鉴于这项研究意义重大,我国有关研究已经起步并正在迅速发展,各国同行的研究有重要的参考价值,因此有必要对近年来血红蛋白作为红细胞的代用品研究状况进行分析,明确面临的挑战,这将有利于发展更全面和有效的研究方案,以期取得突破性进展。
白坚石, 卜凤荣, 李松, 胡远东[6]2002年在《聚乙二醇修饰牛血红蛋白制备红细胞代用品的初步研究》文中进行了进一步梳理目的 探讨mPEG名选择性修饰异源血红蛋白，制备红细胞代用品的可能性。方法 使用mPEG 修饰牛血红蛋白，分析其对牛血红蛋白理化性质的影响。结果 平均偶联程度达到30％，导致牛血红蛋白的电泳迁移率，吸收光谱、粘度和胶体渗透压改变。结论 尽管还有很多问题需要解决，mPEG修饰牛血红蛋白制备红细胞代用品具有深入研究的价值。
王梅[7]2002年在《人工修饰猪血红蛋白及其应用的初步研究》文中研究说明脱离红细胞后的血红蛋白四聚体结构不稳定、氧亲和力强、半衰期短，还会引起一定的肾毒性。化学修饰作为一种新兴技术，能有效地改善上述不良特性。无基质猪血红蛋白(SFH)由新鲜猪血溶血制得并经超速离心。0.45μm到0.22μm微孔滤膜过滤等步骤纯化，纯化产物与双(3，5-二溴水杨基)延胡索酸酯(简称DBBF)以1：2的摩尔比在脱氧、pH7.2、37℃环境中反应2小时，所得产物(DBBF-pHb)的氧亲和方大大下降，与天然蛋白质相比，DBBF-pHb具有明显的抗α_2β_2四聚体解聚的特性。经NHS活化酶活性mPEG以30：1的摩尔比与DBBF-pHb在脱氧室温条件下进一步反应，对所得产物的半饱和氧分压(P_(50))、希尔系数(Hill)等有关血红蛋白携氧能力参数以及修饰程度和分子量的测定表明，这样的偶联修饰获得了携氧能力好、分子量适宜、四聚体稳定的产物mPEG-DBBF-pHb。 研究了SFH、DBBF-pHb以及mPEG-DBBF-pHb对动物免疫系统的影响。SFH引起的抗体滴度为1：400，DBBF修饰的血红蛋白的免疫原性明显增加，抗体滴度为1：3200；mPEG修饰有效降低其免疫原性，抗体滴度仅为DBBF-pHb的1／4。 从细胞超微结构方面分析了DBBF-pHb、mPEG-DBBF-pHb保存心肌细胞的效果。在Krebs-Henseleit心脏保存液中分别加入DBBF-pHb和mPEG-DBBF-pHb，用上述两种液体和单纯的Krebs-Henseleit心脏保存液低温保存离体兔心脏左心室组织块24hr作为实验组，离体即刻的心脏组织块作为对照组。DBBF-pHb和mPEG-DBBF-pHb的保存效果较单纯Krebs-Henseleit保存液好。 构建失血性休克模型评价修饰血红蛋白的复苏功效及生理功能。换血量为15％时，小白兔成活率为100％；血液生化指标测定显示，SFH灌注后乳酸脱氢酶为117 IU／L，mPEG-DBBF-pHb灌注后乳酸脱氢酶为227 IU／L，DBBF-pHb灌注对血浆中乳酸脱氢酶影响较大，乳酸脱氢酶为539IU／L，但仍在正常变动范围之内。动力学参数测定显示，DBBF-pHb组灌注后5min后升压效果最明显(从30mmHg升高到107 mmHg)；SFH组在灌注后5min后升压效果明显，然后有一定的下降趋势；mPEG-DBBF-pHb组在输液后60min内能维持比较稳定的血压(平均为106 mmHg)，与基础值相差不大；Ringer Lactate组升压效果最差。mPEG-DBBF-pHb组对心率的影响与全血组类似；SFH组在灌注后5min时心率下降，但随着供氧的恢复，心肌的代谢异常逐渐得以纠正，心率逐渐升高；RingerLactate溶液组的心率在灌注后上升，但随后下降幅度较大。
周勃[8]2008年在《猪血红蛋白及其戊二醛聚合猪血红蛋白的分离纯化工艺研究》文中研究说明本论文主要研究高纯度猪血红蛋白的提取与分离纯化工艺及其戊二醛聚合猪血红蛋白的纯化工艺。通过比较DEAE-Sepharose Fast Flow、SOURCE 30Q和Q Sepharose XL等三种常用的阴离子交换剂层析介质对猪血红蛋白的分离纯化效果,选择DEAESepharose Fast Flow介质作为猪血红蛋白的分离纯化介质。在此基础上,实验设计了两种工艺路线,工艺路线A:首先用低渗法提取猪血红蛋白,然后用超滤、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Sephadex G-75凝胶排阻层析三步法分离猪血红蛋白;工艺路线B:首先用热敏法提取猪血红蛋白,然后用超滤和DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析两步法分离纯化猪血红蛋白。通过比较两种工艺路线,选择工艺路线B来分离纯化猪血红蛋白。色谱条件为,洗脱液A:20 mmol/L PB(pH7.2)+30 mmol/L NaCl,洗脱液B:20 mmol/L PB(pH 7.2)+1.0 mol/L NaCl,洗脱程序:用缓冲A液平衡,上样,缓冲A液洗脱,待样品完全流穿,再用缓冲B液洗脱;洗脱流速为:2.5 cm/min,检测波长为280 nm。此方法所纯化的猪血红蛋白经测定浓度为:7.46 g/dL,回收率为:90.3%,以高效凝胶排阻色谱、高效离子交换色谱及SDS-PAGE电泳检测纯度均在99.9%以上。此工艺具有分离速度快,收率高、操作简单,可线性放大的特点。纯化所得的高纯度猪血红蛋白,按照本实验室已申请的专利方法制备成戊二醛聚合猪血红蛋白后,通过凝胶过滤柱联用多角度激光散射检测其分子量分布范围约为65 kD～800 kD。我们用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱对其进行分离纯化,色谱条件为:洗脱流速为:1.3 cm/min,缓冲液A:20 mmol/L PB(pH7.2,),缓冲液B:20 mmol/L PB(pH 7.2)+1.0 mol/LNaCl,洗脱程序为:0～30min,5%缓冲液B;30～80 min,5～50%缓冲液B;80～100 min,100%缓冲液B。纯化后的戊二醛聚合猪血红蛋白的平均分子量在300 kD左右,四聚体血红蛋白含量小于5%,达到工艺要求。
孙居锋, 刘云艳[9]2009年在《聚乙二醇琥珀酰亚胺酯修饰牛血红蛋白作为红细胞代用品的条件研究》文中提出以单甲氧基聚乙二醇甲酸琥珀酰亚胺酯(Succinimidyl carbonate methoxy polyethylene glycol,SC-mPEG)为修饰剂对牛血红蛋白(Bovine hemoglobin,BHB)进行了修饰,考察了不同条件下,SC-mPEG与牛血红蛋白反应的产率,并且建立了SC-mPEG-BHB混合物的分析方法。根据不同反应因素对SC-mPEG修饰血红蛋白反应的影响确定了SC-mPEG与牛血红蛋白反应的最佳条件,即SC-mPEG与牛血红蛋白最佳配比为60∶1,在4℃,pH9的缓冲溶液体系反应2h。
施海[10]2001年在《猪血红蛋白的提取及修饰的初步研究》文中进行了进一步梳理从新鲜猪血出发，经过超速离心，微孔滤膜过滤等步骤分离纯化得到无基质猪血红蛋白。猪血红蛋白纯化的产物经SDS—PAGE方法分析显示只有一条条带，证明了无基质血红蛋白容易发生四聚体的解聚现象，测定了无基质猪血红蛋白的半饱和氧分压（P_(50)）和希尔系数（n）等有关猪血红蛋白（pHb）携氧能力的参数，并考察了别构效应调节剂对pHb携氧能力的影响。 用小分子试剂双（3，5—二溴水杨酸）延胡索酸酯（DBBF）对pHb进行修饰。与天然血红蛋白相比，DBBF修饰后的血红蛋白具有抗解聚的特性，经SDS—PAGE分析发现DBBF修饰产生的衍生物存在血红蛋白亚基之间的交联。比较了修饰时pHb所处的空间构象（脱氧状态的T构象和氧合状态的R构象）、修饰剂的用量、修饰时间等条件对DBBF修饰pHb的影响，并且DBBF对pHb的修饰还受到别构效应调节剂的影响。 PEG大分子化pHb是延长其在循环系统中的停留时间、降低免疫原性、减少肾脏毒性的有效办法，而PEG修饰一般都使pHb携氧能力下降。我们比较了4种不同方法活化的PEG衍生物对pHb修饰产物携氧能力的影响，还研究了修饰时pHb所处构象对修饰的影响，又用PEG修饰用DBBF内交联的pHb，考察了PEG用量，修饰时间，修饰温度，修饰缓冲液pH值等不同条件对修饰衍生物的携氧能力的影响。在有别构效应调节剂存在的条件下，用DBBF内交联处于脱氧状态的pHb（T态），再用PEG修饰，可以得到携氧能力好，分子量适宜，四聚体稳定的修饰产物。
参考文献：
[1]. 聚乙二醇修饰牛血红蛋白作为红细胞代用品的初步研究[D]. 胡永祥. 天津大学. 2005
[2]. EGDE交联血红蛋白制备红细胞代用品[D]. 徐宇红. 北京化工大学. 2004
[3]. 聚乙二醇修饰牛血红蛋白的制备及其抗失血性休克的研究[D]. 王琳丽. 燕山大学. 2015
[4]. 聚乙二醇修饰血红蛋白制备红细胞代用品的研究[D]. 白坚石. 中国人民解放军军事医学科学院. 2000
[5]. 修饰血红蛋白作为红细胞代用品的研究进展和挑战[J]. 路秀玲. 生物工程学报. 2006
[6]. 聚乙二醇修饰牛血红蛋白制备红细胞代用品的初步研究[J]. 白坚石, 卜凤荣, 李松, 胡远东. 中国生物制品学杂志. 2002
[7]. 人工修饰猪血红蛋白及其应用的初步研究[D]. 王梅. 浙江大学. 2002
[8]. 猪血红蛋白及其戊二醛聚合猪血红蛋白的分离纯化工艺研究[D]. 周勃. 西北大学. 2008
[9]. 聚乙二醇琥珀酰亚胺酯修饰牛血红蛋白作为红细胞代用品的条件研究[J]. 孙居锋, 刘云艳. 生物医学工程学杂志. 2009
[10]. 猪血红蛋白的提取及修饰的初步研究[D]. 施海. 浙江大学. 2001
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