王小娟[1]2004年在《丝瓜籽核糖体失活蛋白的纯化及其性质的研究》文中研究说明Luffin-B 是一种从丝瓜(Luffa cylindrica)籽中分离纯化出来的单链核糖体失活蛋白，是目前发现的活性最高的单链核糖体失活蛋白之一。但是以往纯化 Luffin-B的常规方法中的得率并不高，只有0.01％左右。所以本研究在前人纯化Luffin-B的方法基础上作了一些改进：1、由于Luffin-B的等电点在10左右，属于碱性蛋白质，所以本研究用冰醋酸将其粗提液的pH值调节到4.2，进行了一次酸性沉淀，以除去大部分酸性蛋白质，然后又采用50-85％的硫酸铵分级饱和沉淀法除去大部分杂蛋白，这样Luffin-B粗提液中的杂蛋白就少了很多，便于更好的纯化Luffin-B。2、在将Luffin-B的粗提液进行CM-52阳离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析后，首次尝试采用Superdex 75 HR 10／30高效凝胶过滤层析进一步纯化Luffin-B，取得了很好的纯化效果，可以从100 g丝瓜籽中纯化到42.92g Luffin-B，得率接近于0.043％，比以往纯化方法的得率要高很多。这为以后开展Luffin-B的进一步深入研究提供了很好的基础。 用SDS-PAGE蛋白质变性电泳测定Luffin-B的分子量约为28KDa，这与文献中报道的一致。大鼠肝核糖体在Luffin-B和苯胺作用后产生明显的特征性的R-片断，表明Luffin-B属于典型的RNA N-糖苷酶型核糖体失活蛋白。它对兔网织红细胞裂解液的蛋白质生物合成有强烈的抑制作用，半抑制剂量IC_(50)约为2.1×10~(-11)M，其活力比天花粉蛋白的IC_(50) (约为2.8×10~(-10)M)强很多，有望成为肿瘤导向药物的高效“弹头”。
李丰[2]2003年在《丝瓜籽和栝楼籽中的小分子核糖体失活蛋白（肽）的研究》文中提出小分子核糖体失活蛋白是一类分子量为8~14 kD 的新型核糖体失活蛋白。它们具有N-糖苷酶活性，并对蛋白质生物合成有较强的抑制活性。它们不仅是研究蛋白质结构与功能的理想材料，而且由于它们分子小，免疫原性相对较低，有望成为免疫毒素的一类新的“弹头”，具有良好的应用前景。本文主要对葫芦科植物种子中的叁种小分子核糖体失活蛋白的分离、纯化、性质及cDNA 克隆和表达进行了研究。通过硫酸铵分级沉淀、CM-52 阳离子交换层析、FPLC Mono S 阳离子交换层析，从丝瓜籽抽提液中分离到一种单体分子量为5226.5 Da 的多肽Luffin P1。其N 端11 个氨基酸序列与丝瓜籽中一种名为6.5 K AGRP 的多肽的部分序列相同，并与南瓜籽中一种胰蛋白酶抑制剂C2 肽具有很高的同源性。体外实验证实，Luffin P1 同时具有两种生物活性：它对兔网织红细胞裂解液蛋白质生物合成有较强的抑制作用，IC50 为0.88 nmol/L；此外它还具有明显的胰蛋白酶抑制活性，IC50 为22 μmol/L。Luffin P1 是迄今已报道的分子量最小的具有失活核糖体活性的多肽。为了探索Luffin P1 可能的作用机制，在不同的溶液条件下对纯化的Luffin P1 进行凝胶过滤分析和N-糖苷酶活力测定，结果显示样品中有聚合体形式存在，单体间主要通过静电相互作用结合在一起，聚合体形式很可能是LuffinP1 的N-糖苷酶的活性形式。此外，我们还利用RT-PCR 方法，克隆了5’端少两个密码子的Luffin P1 的cDNA，序列测定和同源性比较结果提示，Luffin P1 可能是由丝瓜籽中的一种类似vicilin 蛋白的储存蛋白前体加工而来。Luffin S2 是另一种来源于丝瓜籽的小分子核糖体失活蛋白。本文利用3’RACE 法克隆了它的cDNA，并构建了它的融合表达质粒pGEX-4T-S2，该质粒在大肠杆菌中获得了成功表达。表达产物大部分为可溶性蛋白，每升培养液可获得40 mg 左右纯度约为95％的融合蛋白GST－Luffin S2。该融合蛋白具有
林峻凯, 陈明晃, 谢捷明, 赵蓉, 叶晓明[3]2002年在《八棱丝瓜籽核糖体失活蛋白的分离纯化及其生化性质》文中指出通过盐溶液抽提、硫酸铵分级沉淀、CM 5 2纤维素阳离子交换层析、反相毛细管液相色谱 (re verse phasecapillaryliquidchromatography ,RP CLC)等步骤 ,从八棱丝瓜籽中分离到 2种单链核糖体失活蛋白luffaculin 1和luffaculin 2 .在SDS PAGE和IEF上均显示为单一条带 ,表观分子量均为 2 8kD ,其等电点分别为 8 86 (luffaculin 1)和 9 0 5 (luffaculin 2 ) .实验表明 ,它们具有RNAN 糖苷酶活性 .蛋白质合成抑制活性测试表明 ,它们对蛋白质合成具较强的抑制作用 .体外抑制肿瘤细胞生长活性检测表明 ,luffaculin 1和luffaculin 2对人白血病细胞株K5 6 2有较强的毒性 ,IC50 分别为 1 1×10 -6mol L和 2 0× 10 -7mol L .八棱丝瓜籽核糖体失活蛋白具有可以用于或构成免疫毒素治疗癌症的应用前景
邰宁文[4]2000年在《葫芦科植物种子中两种新型小分子核糖体失活蛋白的分离、纯化和性质研究》文中认为本论文主要是对葫芦科植物种子中两种新型的小分子量核糖体失活蛋白的分离、纯化和性质进行了研究。（一）栝楼种子中一种新型小分子核糖体失活蛋白—S-trichokirin的分离、纯化和性质 S-trichokirin是我们首先从栝楼（Trichosanthes kirilowii）种子中通过硫酸铵分级沉淀、Cellulose CM-52阳离子交换层析、SephacrylS-100凝胶过滤和FPLC Mono-S阳离子交换层析纯化到的一种新型核糖体失活蛋白，反相HPLC及质谱分析验证了它为单一蛋白，其得率约为0.4mg/100g脱脂种子干粉。经15％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和15％Tris-Tricine聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，其分子量为8kD左右。通过13.5％酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，S-trichokirin的等电点在pH9.5左右，是一种强碱性蛋白质。S-trichokirin对鼠肝核糖体作用的研究结果表明，其失活核糖体的机制与trichosanthin一致，属于RNA N-糖苷酶催化型。S-trichokirin具有较强的抑制兔网织红细胞裂解液蛋白质生物合成的能力，蛋白质生物合成抑制50％时的浓度（IC_(50)）为1.15×10~(-10)mol/L。 （二）丝瓜籽中小分子核糖体失活蛋白—Luffin S_2的分离、纯化和性质 Luffin S_2是从丝瓜（Luffa cylindrica）籽中经硫酸铵分级沉淀、Cellulose CM-52阳离子交换层析、Sephadex G-25脱盐、FPLC Mono-S离子交换层析得到的另一种新型小分子量核糖体失活蛋白，得率约为1.5mg/100g脱脂种子干粉，经15％SDS-PAGE测定，其分子量为 摘 要 8 kD左右。Luffin S。对兔网织红细胞裂解液的蛋白质生物合成有较强 的扣制左右，其 IC习＊为 1．50X 10’＊mol／L，毒性与 S一trichokirin相当口 利用纯化的 Luffin S。免疫小鼠，制得了 Luffin S。的多克隆抗血 清，它有较高的效价，但专一性不够强。进而利用细胞融合技术，初 步筛选到一株分泌抗Luffin S。单抗的杂交瘤细胞株，其培液上清有较 强的专一性，已用于LllffiflS。的WCStCfttBIOttiflg检狈肌 利用蛋白质测序仪测定了 Luffin S。N－端 9个氨基酸的序列，并据 此设计5，端简井引物，用此引物和 3’－端通用引物，通过RTFCR技 术克隆了 Luffin S。的部分cDNA序列。测序表明，克隆到的Luffin S。 。DNA由 198个碱基的编码序列和 3’－端 87个非编码序列组成，根据 Luffin S。cDNA的编码序列推断，Luffin S。山 66个氦基酸组成，分子 量为 7，852道尔顿，这与天然 Luffin S。的测定结果一致。另外，我们 还构建了 Luffin S。的表达质粒 pET28a叱什侣。，摸索了此质粒在大肠。杆菌中的表达条件，结果表明，rurnn s。的表达量甚微，但通过 ELISA检测和纯化产物切割rRNA的活力检测，验证了表达产物。－h有 重组 Luffin S。的存在。 S－trichokirin和 Luffin S。是我们首先发现的有别于普通的单链和 双链核糖体失活蛋白的一类新型小分于量核糖体失活蛋臼，由于其分 于量仅为常规单链核糖体失活蛋白的可 1／3～l／4左右，因此它们是研 究核糖体的结构与功能、蛋白质与核酸相互作用关系的理想材料。同 时作为免疫毒素的“弹头”，它们也将会有很好的应用前景，并为今 后转基因植物的研究提供更多的选择。
王怡, 孙萍, 詹林盛, 宋丽洁, 李晖[5]2006年在《丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin-a的克隆表达及其cDNA序列分析》文中研究指明目的:从丝瓜籽中克隆核糖体失活蛋白luffin-a基因,并在原核系统进行表达。方法:根据已报道的cDNA序列设计引物,用RT-PCR的方法从成熟的丝瓜籽中克隆luffin-a基因,克隆后鉴定核苷酸序列。构建表达载体pET-28 a(+)-luffin-a,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导表达。利用金属离子亲和层析的方法纯化所得目的蛋白。结果:克隆的luffin-a基因及其所编码的氨基酸序列与国外报道的核苷酸序列及氨基酸序列同源性分别为95%和92%,因而所获得的luffin-a基因是丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin-a一个新的cDNA序列。经SDS-PAGE分析:luffin-a主要存在于包涵体中。金属离子亲和层析可纯化目的蛋白。结论:本研究成功地克隆了luf-fin-a一个新的序列,并建立了该蛋白的原核表达系统,同时利用亲和层析可一步法纯化获得目的蛋白。
熊长云, 张祖传[6]1998年在《一组丝瓜籽小分子核糖体失活蛋白LuffinS的分离、纯化和性质》文中研究说明通过硫酸铵分级沉淀、ＣＭ－５２阳离子交换层析、ＨＲＬＣ分子排阻层析及ＦＰＬＣＭｏｎｏＳ离子交换层析等步骤，从丝瓜籽中分离到一组分子量为８ｋＤ左右的小分子核糖体失活蛋白——ＬｕｆｉｎＳ１、ＬｕｆｉｎＳ２、ＬｕｆｉｎＳ３。末端分析结果表明，它们的Ｎ端氨基酸分别为Ａｌａ、Ｐｒｏ和Ｔｈｒ。氨基酸序列分析确定了ＬｕｆｉｎＳ２的Ｎ端９个氨基酸的序列是Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ａｓｐ。ＬｕｆｉｎＳｓ对核糖体的失活机制与天花粉蛋白（ＴＣＳ）一致，是ＲＮＡＮ－糖苷酶催化型的。它们对无细胞蛋白质生物合成的抑制活性较ＴＣＳ略强，ＩＣ５０分别为１．３×１０－１１、１．０×１０－１０和６．３×１０－１１ｍｏｌ／Ｌ左右。因此ＬｕｆｉｎＳｓ有可能开发成免疫毒素的高效“弹头”。
单宇[7]2009年在《繁缕抗病毒活性蛋白的初步研究》文中提出繁缕(Stellaria media (L.) Villars)为石竹科(Caryophyllaceae)繁缕属(Stellaria L.)植物,是一种药食同源植物。繁缕全草入药,有多种药用功效,尤其繁缕鲜汁液在治疗疱疹等病毒性皮肤病方面有显着疗效。为阐明其药效物质,本研究以抗单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)的活性为导向,从繁缕中分离纯化得到一种新的抗HSV-2活性蛋白,初步对其进行了理化性质、质谱和生物活性研究,发现其具有过氧化物酶(POD)和核糖体失活蛋白(RIP)的相关活性；本文同时对繁缕RIP基因的克隆和表达展开研究,首次克隆到Q1、Q2两个繁缕RIP基因并获得异源表达,为繁缕抗病毒药效物质的分离纯化和阐明提供了关键信息。主要研究结果如下：1繁缕活性蛋白分离纯化、结构及生物活性研究1.1繁缕活性蛋白分离纯化以抗病毒(HSV-2)活性为导向分离指标,采用50%-85%饱和度硫酸铵盐析、弱阳离子交换柱层析、葡聚糖凝胶柱层析及强阳离子交换柱层析技术,从繁缕中分离得到一种抗病毒活性蛋白。SDS-PAGE、FPLC、MALDI-TOF MS显示该蛋白达到色谱纯以上,精确分子量为35.157kD; PAS染色结果表明该蛋白是糖蛋白；IEF-PAGE电泳结果表明为碱性蛋白,等电点9.3 徐小蓉[8]2005年在《丝瓜籽蛋白Luffin-a的基因克隆和表达》文中研究指明[目的] 丝瓜籽蛋白(luffin)是存在于丝瓜籽中的一组单链核糖体失活蛋白(ribosome inactivating proteins,RIPs),由于它们的抗病毒活性和对蛋白质生物合成的抑制作用,受到广泛关注。目前已经纯化出多种类型的丝瓜籽蛋白,主要有luffin-a、luffin-b、luffin-s、luffincylin、luffin-P1,其中,luffin-a由247个氨基酸组成,对兔网织红细胞裂解液的蛋白质合成有强烈的抑制作用,其IC_(50)为1.4×10~(-11)mol/L,是迄今报道毒性最强的单链核糖体失活蛋白之一。最近,Au等发现Luffin-a能够强烈抑制HIV-1病毒的复制,可能有临床应用前景。本研究旨在利用基因工程方法克隆丝瓜籽蛋白luffin-a的基因,构建其表达载体,并获得有活性蛋白,为基因工程生产和改造luffin-a奠定基础。 [方法] 根据报道的cDNA序列,设计合成两条引物,在两条引物上分别添加Nde Ⅰ酶切位点,TGA终止密码子和BamH Ⅰ酶切位点,用RT-PCR的方法从未成熟的丝瓜籽中克隆luffin-a基因,与pMD18-T Simple Vector连接,连接产物转化感受态大肠杆菌JM109,挑取白色单克隆菌落扩增,少量抽提质粒,Nde Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切鉴定。对确实含有外源片段的阳性亚克隆测序,用限制性内切酶Nde Ⅰ和BamH Ⅰ对测序结果满意的亚克隆产物进行双酶切,目的基因片段切胶回收,与经相同酶切的pET44a-c(+)载体连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),涂LB平板,挑取转化成功单克隆菌落扩增,少量抽提质粒,双酶切、小量表达鉴定重组质粒。将含有正浙江大学硕士学位论文徐小蓉确表达载体pET-44a(+>lufA的转化菌BL21(DE3)IPTG诱导表达,收集菌体沉淀,将沉淀超声破菌,将超声所得沉淀反复洗涤,尿素溶解包含体,透析复性。复性蛋白溶液用Blue一SePharose 6B亲和层析纯化,经SDS一队GE电泳检测,用MTT法检测细胞毒性。用统计学方法比较tuffin一a组和RTA组(对照组)细胞存活率的差异。【结果】 Rl;PCR产物经1%琼脂糖电泳,澳乙锭染色后,在紫外光下可见一条明显的约76ObP的亮带,与预计的目的片段长度大小一致。 目的片段与T载体连接产物转化感受态JM 109,长出白色克隆,抽提质粒用拟由I和刀。功Hl双酶切确认外源片段插入,经测序证实该片段序列与所报道的l此阮.a核昔酸序列同源性为99.73%,两者编码的氨基酸序列则完全一致。 重组质粒pET-44岭}lufA用筋由I和刀。从Hl双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳。可见大小约5 600bP和750bP的两个片段,说明lu乙气的编码基因已插入pET-44a-c(+)。含重组子pE下44a(+)一lu￡气的大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达,菌液及菌体超声破菌后沉淀和上清12%SDS一PAGE电泳,经诱导菌液泳道及超声沉淀泳道均可见一分子量约为27切的蛋白条带,与luffin一a的分子量吻合,而未诱导菌液与超声上清无相应条带,这说明hiffin-a以包含体形式正确表达。包含体反复洗涤后纯度达70%以上,尿素溶解,透析复性所得产物纯度约30%,复性率较低。复性液经Blue一sepharose 6B纯化,sDS.PAGE检测,结果显示其纯度大于90%。MTT法进行毒性检测,表明复性纯化后的luffin.a具有与蓖麻毒素A链(RTA)相似的细胞毒性。【结论】 本实验采用RJ’- PCR的方法,从未成熟丝瓜籽中克隆得到了正确的luffin-a基因,并将其插入到载体质粒pET-44a(+)中,成功构建了luffin一a的表达质粒pET-44a(+).】uffin-a。重组质粒转化的大肠杆菌BLZI(DE3)在IPTG诱导下,表达出分子量约为27kD的蛋白质,与目的蛋白分子量一致。而蛋白质电泳表明目的蛋白主要以包含体形式表达,所得包含体经反复洗涤后纯度可达70%以上。洗涤后 3 花龙[9]2013年在《转丝瓜核糖体失活蛋白基因Luffin-a、Luffin-b水稻对稻瘟病和纹枯病抗性的初步研究》文中进行了进一步梳理水稻是世界上重要的粮食作物之一,但稻瘟病和纹枯病等真菌病害严重影响了水稻的高产、稳产。传统的化学农药防治不仅污染环境,更威胁到农民与消费者的身体健康。培育出抗病新品种是最经济有效的方法。随着抗病基因的不断发现与克隆,通过转基因手段获得抗病品种是一种有效的解决途径。实验证明蔗糖合酶启动子pRSUS1是一类能驱动外源基因在水稻根、茎、叶中高效表达而在种子是不表达的组织特异型启动子。丝瓜核糖体失活蛋白是核糖体失活蛋白(RIPs)家族中的一员,它是一种能通过抑制细胞内核糖体蛋白质的合成,从而使细胞死亡的毒蛋白,并且对病毒、真菌、和昆虫具有广谱抗性。本实验是选用具有转基因安全性的蔗糖合酶启动子pRSUS1和丝瓜核糖体失活蛋白Luffin a、Luffin b基因,通过构建pRSUS1分别与Luffin a、Luffin b的表达载体,由农杆菌介导法转入水稻,对转基因植株进行PCR和RT-PCR检测、稻瘟病和纹枯病的抗病性鉴定及农艺性状的调查,从而筛选出既具有抗病性又不影响水稻农艺性状的转基因株系,为水稻抗病育种提供基础材料和依据。目前取得的主要研究结果如下：1.将构建的表达载体pRSUS1-Luffin a、pRSUS1-Luffin b,通过农杆菌介导转入台北309中,对获得的T0代转基因植株进行PCR检测,最后筛选得到转pRSUS1-Luffin a阳性植株11个,转pRSUS1-Luffin b阳性植株24个。2.对T1代pRSUS1-Luffin a转基因株系进行PCR、RT-PCR以及纹枯病抗性检测,其中有8个转基因株系基本符合孟德尔自由分离3：1的规律,RT-PCR结果呈阳性,病斑长度方差分析表明,7个株系与TP309相比,表现出一定的抗性。3.对T2代pRSUS1-Luffin a转基因株系进行PCR、RT-PCR以及纹枯病抗性检测,PCR结果大部分呈阳性,病斑长度方差分析表明有4个株系与TP309相比,对纹枯病具表现出一定的抗性,这4个株系RT-PCR结果呈阳性。T2代转基因株系A1-3/1-7接种18号稻瘟病菌,该株系平均表现为3级抗病。4.选取10个T0代pRSUS1-Luffin b转基因株系进行RT-PCR检测,结果均呈阳性。5.对T1代pRSUS1-Luffin b种植的9个所有转基因植物进行PCR、RT-PCR以及纹枯病抗性检测,结果有5个株系PCR和RT-PCR结果为阳性,病斑长度方差分析表明这5个株系与TP309相比,对纹枯病表现出一定的抗性。对T1代转基因株系B4-2和B6-4接种18号稻瘟病菌,这两个株系平均表现为3级抗病。6.选取T2代pRSUS1-Luffin a和T1代pRSUS1-Luffin b各一个株系进行稻瘟病抗谱分析,与TP309相比转基因株系对转基因株系对10号、11号、13号、21号、44号、47号稻瘟菌小种感抗较为明显。7.对T2代pRSUS1-Luffin a和T1代pRSUS1-Luffin b部分农艺性状进行调查,结果表明TP309的分蘖和株高都低于pRSUS1-Luffin a-、pRSUS1-Luffin b-和转基因阳性株系,其余农艺性状均接近,说明转基因株系的农艺性状并未受到影响。 林娟[10]2002年在《麻疯树（Jatropha curcas）毒蛋白（curcin）的分离纯化、基因克隆及作用机理研究》文中进行了进一步梳理麻疯树为大戟科麻疯树属植物，在我国的西南地区有着丰富的资源。麻疯树种仁中含有丰富的蛋白质，此蛋白质对人、小鼠及羊等是有毒的。以四川攀西地区采集的麻疯树为材料，分析了其种仁中总蛋白的含量和组成。采用硫酸铵分级分离和凝胶层析过滤法从麻疯树种仁中分离纯化出一种毒蛋白，称为麻疯树毒蛋白(curcin)，其相对分子量为28.2kDa，等点电为8.54左右。Curcin是一种糖蛋白，中性糖含量为4.91％。Curcin远紫外圆二色谱(CD谱)显示217nm处的单一负峰，此时的curcin分子中含有22.3％的a螺旋，43.5％的β折叠和34.2％的无规卷曲和转角。使用ABI491A蛋白测序仪测定了curcinN端前32个氨基酸的序列为：A-G／Y-S／K-T／A-P／D-T-L-T-I-T-Y-D-A-T／A-A-D-K-K-N-Y-A-Q-F-I-K-D-L-R-E-A-F／A-G。当curcin浓度大于7.8mg／L时，具有凝集兔红细胞的活性。用纯化出的curcin制备出抗此毒蛋白的兔抗血清，并用ELISA技术和Western杂交技术鉴定了抗体的滴度和特异性。 Curcin对无细胞系统中蛋白质合成的抑制活性较强，IC_(50)为0.19±0.011nmol／L；当curcin作用于大鼠肝核糖体经苯胺处理在3.5％聚丙烯酰胺的尿素变性胶电泳图上能观察到450bp的特征性核酸条带，从而证明curcin是RNAN-糖苷酶，它的作用机制是通过失活真核生物核糖体而抑制蛋白质的合成，因此认为curcin也是一种核糖体失活蛋白(RIPs)。体外生物学活性试验表明，curcin具有抑制胃癌细胞(SGC-7901)、小鼠骨髓瘤细胞(Sp2／0)、人肝癌细胞(Human 四川大学博士学位论文hePatoma）的体外增殖的能力，其 IC50分别为 0．23土0刀04 mg／L，0．66土0刀15mglL和 3．1610．03 mg／L，但对 HeLa细胞和正常细胞无毒；在电脉冲介导下，curcin处理HeLa细胞后，细胞的存活率明显降低；显微镜下观察，可见到明显的凋亡细胞，流式细胞仪测定细胞周期的＊期前有亚二倍体的凋亡峰，DNA凝胶电泳未显示有规律断裂形成的DNA梯状图谱；小鼠急性毒理实验结果表明，小鼠灌胃半致死剂量LD扣为 104．737士29．447mg／kg；小鼠腹腔注射半致死剂量 LD50为 67．20土 10．445 og／kg。 依据curcin的N－端部分氨基酸设计简并引物，通过反转录聚合酶链式反应 （RT－PCR）和快速分离cDNA末端（RACE）技术扩增得到curcin全长cDNA （Ge姻毗注册号 AY069946）。该 cDNA全长由N 73个碱基组成，包含一个完整的编码 193个氨基酸的开放阅读框，构成一个 32 kDa的前体蛋白，成熟蛋白由 251个氨基酸组成，前 42个氨基酸为信号肽，推导的多肽序列与已测出的蛋白质的N．端序列相同。在起始密码子上游有一个由36个碱基组成的5’非编码区；在终止密码子下游有一个由236个碱基组成的3’非编码区，包括两个加 poly（A）信号和一个长度为 ZI个腺昔酸的 poly（A）尾。根据 curcin的 cDNA序列设计引物，采用基因组步查技术克隆了麻疯树基因组中的一个 1802 hP DNA片段（GenBank注册号 AF 469003）。序列分析结果表明，该基因也包含了同上的开放阅读框，在5’端，除具有36个核昔酸外，还包含一个658核昔酸的5’上游序列，含有一个推测的TATA盒和两个CAAT盒；在丁端，也存在两个加poly（A）信号，其序列有两处与CDNA基因不同。该基因的编码区具有核糖体失活蛋白基因的特征：无内含子。 将编码 curcin的成熟蛋白（FLZ）和保守结构域（CB）基因定向克隆到pQE－30质粒后，获得重组质粒pQE－JI（FLZ－pQE－30）和pQE－JZ（CBlpQE－30）。用该重组质粒转化大肠杆菌M15菌株。结果表明，在IPTG诱导条件下，编码curcin成熟肽和保守结构域的基因都得到了表达。表达产物仍具有体外抑制蛋白质合成的能力，蛋白质生物合成被抑制50％时的表达的融合蛋白的浓度r。分别为 0．32土0．038 nmoUL（CBI）和 0．44士0．016 nmol／L（FLZ），说明成熟蛋白N端的前8个氨基酸和C端后5个氨基酸对其活性无影响。 [1]. 丝瓜籽核糖体失活蛋白的纯化及其性质的研究[D]. 王小娟. 华东师范大学. 2004 [2]. 丝瓜籽和栝楼籽中的小分子核糖体失活蛋白（肽）的研究[D]. 李丰. 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）. 2003 [3]. 八棱丝瓜籽核糖体失活蛋白的分离纯化及其生化性质[J]. 林峻凯, 陈明晃, 谢捷明, 赵蓉, 叶晓明. 中国生物化学与分子生物学报. 2002 [4]. 葫芦科植物种子中两种新型小分子核糖体失活蛋白的分离、纯化和性质研究[D]. 邰宁文. 中国农业科学院. 2000 [5]. 丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin-a的克隆表达及其cDNA序列分析[J]. 王怡, 孙萍, 詹林盛, 宋丽洁, 李晖. 军事医学科学院院刊. 2006 [6]. 一组丝瓜籽小分子核糖体失活蛋白LuffinS的分离、纯化和性质[J]. 熊长云, 张祖传. 生物化学与生物物理学报. 1998 [7]. 繁缕抗病毒活性蛋白的初步研究[D]. 单宇. 南京农业大学. 2009 [8]. 丝瓜籽蛋白Luffin-a的基因克隆和表达[D]. 徐小蓉. 浙江大学. 2005 [9]. 转丝瓜核糖体失活蛋白基因Luffin-a、Luffin-b水稻对稻瘟病和纹枯病抗性的初步研究[D]. 花龙. 海南大学. 2013 [10]. 麻疯树（Jatropha curcas）毒蛋白（curcin）的分离纯化、基因克隆及作用机理研究[D]. 林娟. 四川大学. 2002 标签：园艺论文; 核糖体论文; 蛋白质结构论文; 蛋白质合成论文; 基因合成论文; 蛋白质纯化论文; 酸性氨基酸论文; 蛋白质论文; 核糖体rna论文; 参考文献：