陈富林[1]2000年在《用组织工程方法修复骨缺损和再造骨组织的实验研究》文中进行了进一步梳理组织工程是细胞生物学、材料学、工程学共同发展并相互融合的产物，其目的是研究和开发组织替代物，组织工程方法的建立标志着人类即将走出器官移植的年代，进入再造组织和器官的新时代。本研究对用组织工程方法修复骨缺损和再造骨组织进行了系统的研究。 1．骨髓基质干细胞成骨能力的实验研究 方法：体外分离、培养MSCs，观察其生长特点并进行碱性磷酸酶(ALP)组织化学染色：用矿化液连续培养，观察其骨形成能力。结果：第三代MSCs碱性磷酸酶染色，7—8％阳性；倒置显微镜下观察，在矿化条件下，细胞传代5—6天后，长满培养瓶的底部，约10天开始叠层生长，为局灶状，中央出现较多颗粒样改变，14—15天时，培养瓶底部肉眼可见白色小结节形成，并逐渐增大，细胞连续培养30天，Von-Kossa染色显示有局灶状钙盐沉积；扫描电镜观察，10天左右细胞呈叠层生长，20天时形成粗大的胶原纤维束，上有钙盐沉积。30天时矿化组织更大，形成骨小梁样结构。结论：MSCs易于分离培养，体外扩增速度快，在矿化条件下，骨髓基质干细胞在体外即具有很强的成骨能力，可以形成矿化结节，30天时形成骨小梁样结构。因而可以作为种子细胞，用于骨组织工程。 2．rhBMP2对培养骨髓基质干细胞的生物学效应 方法：将培养的MSCs接种于96孔板，暴露于不同浓度的rhBMP2中，观察MSCs增殖、ALP活性、蛋白质含量的变化。结果；低浓度的rhBMP2对培养骨髓基质干细胞的碱性磷酸酶活性、蛋白质含量均有明显的促进作用，且呈剂量依赖性，高浓度的rhBMP2对培养骨髓基质干细胞的增
宋克东[2]2006年在《生物反应器内成骨细胞的扩增和组织工程骨的构建》文中研究表明骨组织工程(Bone tissue engineering)概念的提出为解决由于创伤、肿瘤等各种因素引起的骨缺损等疾病提供了一种崭新的方法和思路，已成为治疗骨科疾病的新突破点。生物反应器系统既可以揭示在三维培养环境中细胞功能的基本机制，又有提高工程化组织质量的功能。旋转壁式生物反应器(Rotating wall vessel bioreactor，RWVB)具有剪切力低、培养的细胞之间有三维联系的机会、极高的溶氧效率、营养物质浓度梯度低等特点，是一种非常理想的骨组织工程用三维培养系统。 本研究使用Sprague-Dawley(SD)大鼠和新西兰兔的成骨细胞(Osteoblasts，OBs)作为骨组织工程的种子细胞，对其原代、传代培养的方法和其特异性和形态学等生物学性能进行了检测，确定所培养的细胞是成骨细胞，并通过纯化确保没有其他细胞的污染，可为后续的实验提供数量充足的骨组织工程种子细胞，也为实验的准确性和可重复性提供了保证。 在相同条件下分别在培养瓶、转瓶(Spinner flask)和RWVB中使用微载体悬浮培养法进行了SD大鼠成骨细胞扩增培养的研究。培养7天后，经倒置相差显微镜、扫描电镜(Scanning electron microscope，SEM)、苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin，HE)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)、MTT、von-Kossa染色和茜素红染色等生物学性能检测，结果显示RWVB中扩增的细胞能最好地保持成骨细胞的各种生物学特征，可以作为骨组织工程的种子细胞。且当微载体的浓度为10mg／ml、成骨细胞的接种密度为5×10~4 cells／ml时，细胞在RWVB中可以获得最佳的扩增效果，每代可以扩增十倍以上，明显高于其它培养方式。 使用FLUENT软件模拟计算了旋转壁式生物反应器内的二维流场，计算了在反应器内进行细胞扩增和工程化组织构建时培养室内的动压、总压、剪切力和流体速度的分布，具体分析了当反应器的转速和旋转方向、中空纤维膜的径向位置和直径等发生改变时膜壁面各点的受力情况和流场分布。此外，还详细分析了当反应器的转速和旋转方向以及细胞-支架材料构建物的径向位置发生改变时构建物壁面各点的受力和流场分布情况。模拟结果显示在旋转壁式生物反应器内不同位置的中空纤维膜壁面和细胞-支架材料构建物壁面各点的动压、流体速度和剪切力随着反应器的旋转而发生周期性的变化，培养物可以获得周期性的应力刺激；反应器内流体的剪切力较低。 在上述理论分析的基础上，设计了旋转壁式中空纤维膜生物反应器(Rotating wall hollow-fiber embrane bioreactor，RWHMB)，利用中空纤维膜作为成骨细胞的载体，以1×10~5 cells／ml接种密度在该反应器内对其进行大规模扩增，并在静态环境中以相同条件对照培养。每隔12 hr对细胞进行取样，培养5天后对细胞进行收获。对所扩增的细胞分别进行扫描电镜(SEM)观察、碱性磷酸酶(ALP)染色、钙化结节染色等生物学
张晓东[3]2002年在《用组织工程方法辅助钛支架修复骨缺损的实验研究》文中认为组织工程学是近十年发展起来的新兴学科，它是应用细胞生物学和工程学的原理，研究和开发具有生命的生物替代物，用来修复和重建人体组织和功能的一门新兴科学。其基本方法是，体外分离、培养种子细胞，使其适度增殖、分化，然后将其接种到具有一定形态和空间结构的三维支架材料上，形成具有特殊形态和功能的组织和器官，以达到修复创伤和重建功能的目的。 骨缺损修复一直是临床治疗的难点问题之一，骨组织工程学的研究发展为临床骨缺损修复和功能重建提供了新的思路。本研究以免骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell,BMSC)作为种子细胞，研究其体外培养条件下的生物学特性，探讨了重组人骨形成蛋白—2(recombinanthuman bone morphogenetiC protein-2,rhBMP-2)、地塞米松(Dex)单独和联合作用对BMSC的增殖和分化的生物学作用；同时以珊瑚为支架材料，形成BMSC／珊瑚复合人工骨，钛网加强修复兔自体下颌骨缺损，BMSC／珊瑚复合人工骨钛板固定修复自体股骨缺损，观察骨修复情况，初步探讨了钛支架在组织工程方法修复骨缺损中的作用。 实验方法：取新西兰兔骨髓，分离BMSC，体外培养，经诱导分化为骨髓基质成骨细胞(MSO)，采用细胞形态学观察、生长曲线测定、扫描电镜(SEM)、碱性磷酸酶(ALP)染色、钙染色等方法观察BMSC的生物学特性；采用ALP测定、MTT法检测、考马斯亮蓝法探讨rhBMP-2和Dex对BMSC的生物学作用；采用大体观察、SEM、组织学染色、骨磨片 窜四旱匠大学项士学位论文 等方法评价新骨形成情况。 结果：BMSC可以在体外适宜条件下培养，经诱导可向成骨细胞转化； rhBMP－2和Dex在一定条件下，可促进BMSC的增殖和向成骨细胞转化； 钛金属加强的BMSC／珊瑚复合骨在修复自体下颔骨缺损及股骨缺损的过 程中成骨作用明显，随时间延长，成骨量增加且更加成熟。 结论：BMSC取材方便、损伤小、倍增迅速、可定向分化，可以作为 骨组织工程的种子细胞：fhBMPZ和 DCX对BMSC具有促增殖和定向诱 导分化作用：钛金属加强的8＊sC／珊瑚在修复骨缺损的过程中成骨活跃， 显示出良好的应用前景。
李春明[4]2005年在《bFGF基因修饰组织工程骨移植修复颌骨缺损及相关机制的实验研究》文中研究表明骨缺损畸形是颌面外科、骨科、整形外科临床常见病。颌骨缺损的修复问题一直是口腔颌面外科较难解决的问题,现常规的修复方法很多,但各有其优缺点。用组织工程方法构建种子细胞、支架材料和生长因子复合的生物活性人工骨被认为是未来进行骨缺损修复和骨再造最有效的方法之一。现在骨组织工程的种子细胞来源有:骨、骨膜、骨髓、骨外组织。这些来源的种子细胞各有优缺点。骨髓来源的骨髓基质干细胞(BMSC)作为种子细胞研究甚多,均证明该细胞具有来源广泛、取材方便、生长稳定、增殖快、定向分化能力强、易于接种成活,在一定条件下可向成骨细胞转化;骨髓基质干细胞易于转染目的基因,可以作为基因治疗的靶细胞用于骨缺损的修复。所以本实验选择骨髓基质干细胞作为bFGF基因转染的种子细胞。骨组织工程支架材料研究内容主要有陶瓷类、高分子聚合物和生物衍生材料。许多实验研究表明:Bio-oss支架材料是一种天然的、无抗原的、将牛骨中的所有有机成分去除后提取的纯无机多孔骨移植材料,它的天然结构决定了其理化性质与人体骨十分相似,其生物相容性好。Bio-oss支
马雷[5]2010年在《bFGF基因修饰的MSCs细胞复合β-磷酸三钙修复骨缺损实验研究》文中研究表明目的：骨缺损畸形是颌面外科、骨科、整形外科临床常见病。颌骨缺损的修复问题一直是口腔颌面外科较难解决的问题,现常规的修复方法很多,但各有其优缺点。组织工程化骨是利用生物组织工程技术将种子细胞与支架材料复合,形成具有与自体骨结构功能相似的骨组织,它弥补了多种单一植骨材料的缺陷,结合了它们各自的优点,具有组织相容性好、骨诱导能力强、取材方便、可快速修复缺损等特性。用组织工程方法构建种子细胞、支架材料和生长因子复合的生物活性人工骨被认为是未来进行骨缺损修复和骨再造最有效的方法之一。通过人碱性成纤维生长因子(basic fibroblant growth factor, bFGF)转染以增加组织细胞bFGF的分泌量,提高bFGF蛋白在生物体骨缺损局部组织中的浓度,达到促进骨愈合的目的。但是,如何提高质粒对于靶组织的转染效率、寻求一种高效、简便的转染手段,如何缩短鉴定转染是否成功的时间,以及在基因转染促进骨愈合的过程中,一直未得到很好的阐明。本研究目的包括以下几个方面：1)建立稳定的、基因序列正确的、检测方便的、和GFP-慢病毒载体,并检测转染293-FT细胞的效率及转染后的生物学活性；2)获得骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells, BMSCs),bFGF-慢病毒载体转染诱导第3代的犬BMSCs,了解该质粒转染犬骨髓间充质干细胞的效率及转染后的生物学活性；3)体内观察对比bFGF基因修饰rMSCs细胞活性的影响以及诱导异位成骨的情况,为构建更优化的骨组织工程种子细胞和组织工程化骨提供重要的实验基础。方法：1)bFGF基因真核表达载体的构建设计人bFGF基因引物,用Trizol法提取胎盘组织总RNA,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法扩增bFGF基因,连接至ViraPowerTM慢病毒载体系统,经Xho-Ⅰ, BamH-Ⅰ双酶切和测序并与Genebank中序列进行比较分析。2)bFGF基因遗传修饰的犬骨髓间充质干细胞的建立：①结合Percoll分离液密度梯度离心和差速贴壁传代筛选法相,分离培养犬骨髓间充质干细胞。②在脂质体转染剂Lipofectamine2000的介导下,bFGF-pLenti6/V5-D-TOPO表达质粒同包装质粒pLP1、pLP2、包膜质粒pLP/VSVG共转染293FT细胞株,收集bFGF-慢病毒上清转染诱导后第3代的犬BMSCs, Blasticidin压力筛选稳定表达株。③设计GFP基因引物,以GFP-PMSLV-Plazmid为—1—模板,采用PCR的方法扩增GFP基因,连接至pLenti6/V5-D-TOPO(?)表达质粒,GFP-慢病毒载体的构建及转染BMSCs过程同bFGF-慢病毒。RT-PCR方法检测bFGF mRNA水平的表达。④RT-PCR检测转染组细胞中目的基因mRNA表达情况,Western blot,细胞免疫化学检测各转染组细胞胞浆中目的蛋白表达情况；ELISA检测各各转染组细胞培养上清中目的蛋白的分泌情况。3)bFGF基因转染的rMSCs成骨活性的体内实验研究实验共分为4组进行：A、对照组(空白组)；B、p-磷酸三钙组；C、MSCs细胞复合β-磷酸三钙组；D、bFGF基因修饰rMSCs+β-磷酸三钙组；①在体外分别将rMSCs和bFGF基因修饰rMSCs接种于多孔支架材料磷酸三钙上。②将不同组细胞／材料复合物植入犬牙槽骨内。③每组分别于植入3月后取材,石蜡包埋,组织病理学切片,HE染色分析新骨形成情况；④术后4、8和12周进行X光片、4、8周CT摄片观察骨缺损变化、骨皮质及β-磷酸三钙降解情况。结果：1)RT-PCR自脑组织cDNA库中扩增出bFGF基因；成功将bFGF基因克隆入真核表达载体,构建了bFGF-pLenti6/V5-D-TOPO表达质粒,DNA测序证明,所克隆目的基因序列与Genebank收录一致。2)bFGF真核表达质粒转染了犬骨髓间充质干细胞后,经抗生素Blasticidin压力筛选获得了具有抗性的细胞克隆；GFP真核表达质粒转染了犬骨髓间充质干细胞48小时后,倒置荧光显微镜下显示转染后的犬骨髓间充质干细胞内可见绿色荧光蛋白分布于整个细胞,呈胞浆分布。培养第八代,转染的细胞依然存活,绿色荧光蛋白持续表达；RT-PCR结果显示抗性细胞克隆中均有大量目的基因bFGFmRNA转录,ELISA检测培养上清中目的蛋白表达阳性,Western blot结果显示胞浆中有目的蛋白的表达。3)犬牙槽骨缺损异位诱导成骨实验显示：基因修饰MSCs组与单纯MSCs对照组相比,材料降解和替代的速度明显提高,有较多的新骨形成；实验动物牙槽骨骨缺损愈合过程的X线4周、8周、12周观察显示及4、12周的CT扫描,bFGF基因修饰rMSCs+β-磷酸三钙组骨缺损在骨皮质的连续性、p-磷酸三钙的降解速度及骨缺损愈合的大小优于MSCs细胞复合p-磷酸三钙组,p-磷酸三钙组明显优于对照组,bFGF修饰的MSCs组在各阶段均有比其他组更明显的材料替换速度。结论：1)成功构建了携带人bFGF和GFP基因的真核表达载体。2)含有人bFGF基因序列可以通过脂质体介导有效地导入犬MSCs中并得到表达。3)人bFGF基因对犬骨髓间充质干细胞修饰转染并能在骨髓间充质干细胞中翻译、表达产生bFGF基因。4)bFGF能够启动或诱导MSCs成骨方向分化和能够促进新生血管形成,对rMSCs进行修饰后,能够在犬牙槽骨内有效地促进异位骨的形成。
王常勇[6]2000年在《采用组织工程技术建造生物性人工软骨》文中研究指明在面中部或鼻基部区域,由于创伤、肿瘤或先天性畸形等原因,导致的局部软骨缺损需要进行软骨重建,以达到美观和功能效果,而现有的治疗方法不能满足临床软骨缺损治疗的需要,因此在现代头颈外科领域,迫切需要新的治疗方法对大块软骨缺损进行修复。而且由于至今没有任何一种修复材料能够完全达到或基本满足人体对气管移植物的条件要求,因此对喉和气管缺损后如何进行修复重建,仍是医学研究面临的难题之一。 由于自体肋软骨和耳软骨具有能够保持移植活力、吸收少等优点,因此在临床上获得广泛应用,但存在供体材料来源有限、需二次手术等缺点,而且自体肋软骨移植有远期钙化倾向,从而限制了其临床应用。同种异体及异种软骨移植物存在自溶现象、引起免疫排斥反应以及传播病原等限制,因而难以广泛应用。由于软骨自身修复能力有限,而现有治疗方法又不能完全满足临床需要,因此迫切需要科研人员尝试新的技术和手段,对软骨缺损进行治疗。 组织工程学是一门跨学科的新领域,它应用工程学和生命科学的基本原理试图建造能够用于重建、维持或提高缺损组织功能的生物性人体组织。组织工程研究为临床上修复因各种原因导致的软骨缺损带来了希望。近年来,科研人员应用国外研制的可生物降解聚合物作为支架,成功地在动物体内培育出组织工程化人工软骨,如耳形软骨、鼻样软骨等,应用国内研制的支架材料成功进行软骨再造的研究较少。本研究应用国产支架材料,对采用组织工程技术建造生物性人工软骨进行了研究,实验主要包括以下三个部分:1.聚(乙交酯-丙交
艾尔肯·热合木吐拉[7]2012年在《采用显微（Micro）-CT及三维打印机制备仿生化、数字化组织工程指骨支架材料》文中研究说明目的：利用显微-CT采集人类拇指末节指骨三维微观数据并使用三维立体打印机，建立三维指骨支架材料模型，对仿生化、智能化组织工程支架材料的体外构建进行初步探讨。方法：利用显微-CT对成年男性新鲜标本拇指末节扫描所得的原始DICOM数据为基础通过Mimics软件三维处理得到宏观及微观仿生的三维打印STL文件，并通过三维打印机打印出指骨支架三维模型。结果：采用显微-CT扫描得到的数据用Mimics三维医学处理软件处理后，可直接用三维立体打印机快速成型构建仿生化、数字化组织工程指骨支架材料。结论：基于显微-CT及三维打印机的仿生化、智能化组织工程骨建模技术对治疗指骨毁损伤有重要意义。有良好的应用前景。
高瞻[8]2008年在《基于细胞膜片技术构建组织工程化骨实验研究》文中研究表明骨组织工程研究为肿瘤切除、创伤、先天性畸形等所致骨缺损的修复提供了新思路,其中种子细胞是核心问题之一。本研究以骨髓间充质成骨细胞为种子细胞,通过体外培养,构建出骨髓间充质成骨细胞膜片。并提出了新的骨髓间充质成骨细胞聚集体构建方法——骨髓间充质成骨细胞膜片(Bone marrow stromal osteoblast cell sheet)技术,其主要策略是提取骨髓间充质干细胞,体外扩增后,诱导为骨髓间充质成骨细胞,体外扩增纯化骨髓间充质成骨细胞,按照特定的培养程序在体外构建出骨髓间充质成骨细胞膜片,扩增的骨髓间充质成骨细胞在细胞分泌的细胞外基质表面实现三维立体生长,它的特点在于:①本研究构建的骨髓间充质成骨细胞膜片分为三层:富含基质层、中间层和富含细胞层,从而使形成的细胞膜片具有生长的动力性和方向性;②保持了扩增细胞良好的功能表型,在细胞数量增加的同时兼顾了细胞的分化能力;③良好的生物相容性和低免疫源性;④较高的种子细胞利用效率;⑤通过与天然支架材料支撑赋形,可以进行特定形态的组织构建。本研究对构建骨髓间充质成骨细胞膜片的理化性质、组织学结构和生化成分进行了分析;通过体外三维构建和动物实验评估了骨髓间充质成骨细胞膜片在体外形成骨样组织的能力和在体内形成特定形态骨样组织的能力。进而提出新的骨髓间充质成骨细胞膜片构建策略,研究不同形态骨样组织的构建方法,探索新的体外构建移植体修复骨缺损的思路。实验一骨髓间充质成骨细胞膜片体外构建目的:本实验对构建骨髓间充质成骨细胞膜片组织学结构和生化成分进行了分析;通过体外三维构建评估了骨髓间充质成骨细胞膜片体外骨样组织的形成能力。方法:骨髓间充质成骨细胞膜片的体外构建:切取兔四肢长骨干骺端,通过离心分层法制备原代骨髓间充质干细胞,将原代细胞进行细胞计数并分为六等分,平均接种至六个75 cm~2培养瓶中,培养瓶底壁有80%被骨髓间充质干细胞贴满后,加入诱导液。待细胞长满皿底,消化,搜集细胞。将获取细胞高密度接种至三个九厘米直径培养皿中。孵育十四天后,观察骨髓间充质成骨细胞膜片的形成情况,并进行组织学染色和电镜观察。结果:经过体外孵育,骨髓间充质成骨细胞膜片为半透明膜状物,有弹性,内富含有质硬的白色结节,可用金属镊钳夹操作。HE染色证实有骨基质形成,并形成类似骨陷窝样的组织结构。Von kossa染色证实有矿化成分在基质中合成。观察:发现骨髓间充质成骨细胞膜片分为三层:富含基质层、中间层和富含细胞层。结论:提出骨髓间充质成骨细胞膜片的两极学说(静止极和增殖极),建立了一种新的骨髓间充质成骨细胞膜片构建技术,骨髓间充质成骨细胞膜片是一种由骨髓间充质成骨细胞和基质(自行分泌)组成的聚集体,相信它在进一步的体外自体骨移植体的构建中具有广阔的应用价值。实验二骨髓间充质成骨细胞膜片/管状珊瑚复合体移植裸鼠皮下成骨实验研究目的:在新的骨髓间充质成骨细胞膜片构建技术下,观察骨髓间充质成骨细胞膜片在无免疫动物体内发育成管状骨样组织的能力。方法:静态培养条件下,骨髓间充质成骨细胞膜片的静止极朝向管状天然珊瑚,将其均匀缠绕在管状珊瑚外表面,进行卷层样复合,经体外孵育4周后,观察聚集体之间的融合情况,并通过组织学染色观察组织成熟情况。最后将骨髓间充质成骨细胞膜片/珊瑚复合体植入裸鼠皮下,分为8周组、12周组,了解成骨情况。结果:大体观察,体外孵育四周后,在管状珊瑚体外周部分的骨髓间充质成骨细胞膜片卷层之间发生了组织融合,并形成了较成熟的骨样组织,而在管状珊瑚体的中央部分,有非常明显成熟的骨样组织形成。结论:在良好营养交换的环境下,骨髓间充质成骨细胞膜片具备继续成熟并发育为骨样组织的能力,调整骨髓间充质成骨细胞膜片的卷层方向(静止极和增殖极的朝向)可为骨髓间充质成骨细胞膜片的体外三维构建提供新的塑形方法。实验三骨髓间充质成骨细胞膜片/种植体/珊瑚复合体移植裸鼠皮下成骨实验研究目的:利用新的骨髓间充质成骨细胞膜片构建技术,在无免疫动物体内构建出内有种植体的骨样组织,以探索骨髓间充质成骨细胞膜片体内构建带有种植体骨样组织的可行性。方法:按实验一所述方法构建出的骨髓间充质成骨细胞膜片后,以构建好的种植体/珊瑚复合体为赋形支撑体,骨髓间充质成骨细胞膜片的增殖极朝向种植体/珊瑚复合体,将其均匀缠绕在种植体/珊瑚复合体外表面。体外孵育四周后,观察聚集体之间的融合情况,最后将骨髓间充质成骨细胞膜片/种植体/珊瑚复合体植入裸鼠皮下,在8周后,取出标本。从大体形态、组织学结构等方面评价形成骨样组织情况。结果:通过此策略构建的骨髓间充质成骨细胞膜片/种植体/珊瑚复合体具有良好的生物相容性。形成的骨样组织保持着良好的初始外形,组织学结构类似于天然骨组织,含有丰富的矿化物质和胶原纤维。结论:骨髓间充质成骨细胞膜片在体内具有良好的骨样组织形成能力。形成的组织结构均匀,细胞表型维持良好,并为下一步颌骨缺损修复探索了新的方法。实验四骨髓间充质成骨细胞膜片贴附移植实验研究目的:研究骨髓间充质成骨细胞膜片贴附后成骨的构建方法。方法:按实验一所述方法构建出骨髓间充质成骨细胞膜片后,以圆片状珊瑚为支撑体,将其均匀平铺在珊瑚一面。体外短时间孵育,使骨髓间充质成骨细胞膜片与珊瑚牢靠贴附后,将构建的圆片状移植体植入细胞供体动物(新西兰兔)去除骨膜的颅骨表面。体内孵育8周、12周后,取出标本。从大体形态、组织学结构等方面了解贴附成骨情况。结果:通过上述策略,可以形成形态稳定的圆盘状骨样组织,有一定的机械性能,有大量的新骨样组织形成。结论:此策略所形成的贴附后骨样组织与膜状成骨、软骨成骨贴附移植后的情况不同。实验五骨髓间充质成骨细胞膜片修复兔颅骨极限缺损的实验研究目的:运用骨髓间充质成骨细胞膜片技术,探索在无支撑体条件下修复兔颅骨极限缺损的方法。方法:按实验一所述方法构建出骨髓间充质成骨细胞膜片。同时设自体髂骨移植的阳性对照组和单纯珊瑚材料的阴性对照组。将其分别植入兔颅骨极限缺损处,8周和12周后采用X线片,HE染色、Masson's三色染色法等观察、比较骨缺损修复的情况。结果:组织学结构显示骨髓间充质成骨细胞膜片构建出了骨样组织。骨髓间充质成骨细胞膜片修复颅骨缺损的能力强,且与自体髂骨修复的情况相近。珊瑚组材料无成骨能力。结论:骨髓间充质成骨细胞膜片构建的组织工程骨可成为一种良好的骨缺损修复材料。实验六骨髓间充质成骨细胞膜片/种植体/珊瑚复合体修复羊下颌骨缺损的实验研究目的:利用新的骨髓间充质成骨细胞膜片构建技术,探索构建特定形态大块骨样组织的思路,并进行大动物下颌骨缺损修复。方法:以山羊为动物模型,按实验一所述方法构建出骨髓间充质成骨细胞膜片后,以珊瑚为支撑体构建山羊部分下颌骨外形,并将种植钉放入支撑材料中,用此珊瑚/种植钉作为骨髓间充质成骨细胞膜片内支撑体。骨髓间充质成骨细胞膜片的增殖极朝向支撑体,然后,将骨髓间充质成骨细胞膜片小心缠绕在内支撑体外周。进行体外孵育4周后。将此方法获得的部分下颌骨移植体植入制作好的供体动物下颌骨缺损处,12周后,取出标本,进行大体外形、组织学形态观察,了解大动物下颌骨缺损修复情况。结果:通过此策略,在内支撑体外构建的移植体具有稳定的外形,能在动物缺损部位形成理想的外形,组织学结构显示构建的骨样组织具有较好的质量。结论:骨髓间充质成骨细胞膜片加内支撑体赋形是构建特定形态骨样组织的新策略。具有较好的组织形成能力和外形稳定性,使它为大块骨缺损修复提供了新的思路。
史培良[9]2001年在《用组织工程的方法构建组织工程骨的实验研究》文中研究说明组织工程学是应用生命科学和工程学的原理，研究和开发具有生命的生物替代物，用来修复、改善和重建人体组织和功能损伤的一门新兴科学。其技术核心包括种子细胞、支架材料和组织构建三大内容。 本研究以骨髓基质细胞（MSC）作为种子细胞，研究其生长规律和生物学特性；并对MSC在灌注培养条件下生物学特性进行探讨。同时以聚羟基丁酸酯（PHB）为支架材料与骨髓基质来源的成骨细胞复合，在免疫缺陷动物体内异位成骨、在有免疫动物体内修复颅骨缺损等实验，探讨MSC和PHB作为骨组织工程种子细胞和支架材料的可行性。 实验方法：取新西兰兔骨髓，分离MSC，体外培养，经诱导分化为骨髓基质成骨细胞（MSO）。采用形态学观察、生长曲线测定、细胞分裂指数、 细胞贴壁率、钙染色、扫描电镜（SMX透射电镜观察但MSX碱性磷酸酶 kLP侧定、骨钙素＊C测定，观察SEM生长规律和生物学特性；采用X 线摄片、大体观察、组织学染色等方法评价新骨形成情况。 实验结果：MSC可以在体外适宜条件下培养，经诱导分化为MSO；在 灌注培养条件下，细胞可以保持生物学性状稳定，并继续分化增殖； MSC/PHB复合物在免疫缺陷动物（裸鼠）体内异位成骨作用明显，以软骨 内成骨为主，对照组未见骨形成；MSC／PHB复合物修复兔颅骨缺损效果良 好，单纯植入PHB及空白对照组未见骨修复。 结论：MSC经体外诱导可以分化为成骨细胞，而且增殖迅速，作为骨 组织工程的种子细胞有广阔的应用前景；灌注培养系统可以用来扩增细胞， 并保持其生物学性状稳定；PHB泡沫材料有良好的生物相容性可以作为骨 组织工程支架；MSC／PHB复合物可以用来构建骨组织和修复骨缺损
鲁红[10]2002年在《应用组织工程方法促进牙周组织再生的实验研究》文中研究表明牙周组织缺损最理想的愈合方式是达到牙槽骨、牙骨质和牙周膜的完全功能性再生，而牙周组织再生的基础是牙周膜细胞(PDLCs)，PDLCs是牙周炎治疗后形成牙周新附着的主要细胞来源，但在牙周病损部位，PDLCs的来源非常有限，以致牙周组织很难达到有效地再生和重建，而组织工程技术有望解决这一难题。组织工程学是近年来发展起来的一门新学科，其基本方法是将体外培养的高浓度的功能相关的活细胞种植到具有一定空间结构的三维支架上，再将此细胞支架复合物植入体内或在体外继续培养，通过细胞之间的相互粘附、生长繁殖分泌细胞外基质，从而形成具有一定结构和功能的组织或器官，以达到修复创伤和重建功能的目的。现代广义的组织工程学已包括种子细胞／支架材料、生长因子／支架材料和种子细胞／生长因子／支架材料三种构建方式。为初步探讨组织工程技术在牙周领域的应用潜能，本实验在对重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)和重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)促牙周组织再生的细胞学机理进行研究的基础上，首次应用前两种构建方式的组织工程技术，对非细胞型和细胞型牙周组织工程进行了研究，以探索在体外及动物模型上应用组织工程学手段促进牙周组织再生的技术和方法，为牙周疾病的治疗提供新的思路和途径，为组织工程在牙周疾病治疗方面的应用奠定实验基础。本研究分为以下三部分： 一、rhBMP-2和rh-bFGF的细胞学基础研究 1．应用MTT比色法和流式细胞仪(FCM)分析技术，检测了rhBMP-2和rh-bFGF单独或联合作用对人PDLCs增殖、DNA合成及细胞周期的影响，以进一步观察分析rhBMP-2和rh-bFGF促人PDLCs增殖的作用及其可能作用机理。结果表明：rhBMP-2和rh-bFGF单独应用均可促进人PDLCs增殖和DNA合成，两者联合应用具有协同作用。rhBMP-2和rh-bFGF的促增殖作用呈剂量依赖性，且rhBMP-2对人PDLCs促增殖作用不如rh-bFGF。而经rhBMP-2和 第四军医大学博士学位论文．4． fhbFGF作用后，人 PDLCS细胞周期的q％（DN合成前期细胞所占百分比） 降低，而S％＊＊A合成期细胞所占百分比）升高，反映细胞增殖活力的增殖指 数h值（包括DNA合成期侣），DNA合成后期闷力和有丝分裂期则）的细胞所 占百分比，即侣十GZM）％）也明显升高，提示 hBMP2和山七FGF促人 PDLCS 增殖的作用可能是通过促使静止态的Q期细胞活跃进入S期而实现的。 2．采用考马斯亮蓝法检测rhBMPZ和山七FGF作用后人PDLCs总蛋白含 量的变化，并通过透射电镜观察这两种因子作用下人PDLCS超微结构的改变， 以进一步探讨rhBMP－2和山七FGF对人PDLCs蛋白合成和分泌功能的影响。 结果表明：hBMP－2单独应用时可显著提高人PDLCs的总蛋白含量，在25～ 100pg／L浓度范围内呈浓度依赖性，而rhbFGF表现为降低人PDLCs的总蛋白 含量，但至第7天这种作用趋于缓和。两者联合应用时自第5天起仍表现为提 高人 PDLCs的总蛋白含量。透射电镜观察可见 rhBMP－2作用后人 PDLCs DNA 合成和蛋白合成、分泌功能加强，而rhbFGF作用后PDLCs DNA合成活跃， 而蛋白合成相关细胞器未见明显变化，提示rhBMPZ可促进PDLCs的DNA合 成、蛋白合成和分泌，而rhbFGF促进PDLCs的DNA合成，但可能抑制其外 输性蛋白质的合成和分泌。 3．应用Western斑点杂交方法检测rhBMP－2和山七FGF作用后人PDLCs 中 OCN、OPN和 BSP mRNA的表达情况，以进一步探讨rhBMP．2和山七FGF 对人PDLCs分化功能的影响。结果表明：rhBMP－2可促进人PDLCS中OCN、 OPN、BSP mRNA的表达，而 rh七FGF不影响人 PDLCs中 OCN、OPN、BSP ITu：＼xA的表达，两者联合应用时山－bFGF对rhBMPZ的促OCN、OPN、BSP Ilin－guA表达的作用也无影响。提示AnMPZ可能通过促进人PDLCS矿化相关 蛋白的表达而促进人PDLCS的分化。 二、rhBMP毛和山1FGF应用于牙周组织工程的实验研究 l．将rtl．－－MP上和rh七FGF与nHAC复合后植入动物体内修复牙周缺损， 通过组织学观察和测量分析和评价非细胞型组织工程技术对牙周组织再生的作 第四军医大学博士学位论文．5． 用。结 果 表 明：rtl．－－MPZ／nHAC／膜 组、rhbFGF／nHAC／膜组 和 nMP士／山七FGF／nHAC／膜组均较空白对照组和单纯GTR组有更多的新生牙槽 骨、新生牙周膜和新生牙骨质生成，且均未见上皮长入，提示应用生长因子／ 支架材料构建方式的组织工程方法可有效地促进牙周组织再生和重建。 2．应用免疫组化方法对上述各实验组再生的牙周组织中BSP、OPN及 ON的表达进行了比较，以观察分析不同实验组促牙周组织再生作用h不同。 结果表明：各实验组新生牙周组织中BSP、OPN、ON的表达量均较空白对照 组和单?
参考文献：
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[10]. 应用组织工程方法促进牙周组织再生的实验研究[D]. 鲁红. 第四军医大学. 2002