（广东省食品药品职业技术学校，广东广州，510663）
摘要：采用PCR-DGGE技术对中华按蚊成虫肠道细菌多样性进行研究，共检测到12条16S rRNA基因序列。在系统发育地位上主要归入3个细菌纲：丙型变形菌纲、黄杆菌纲和放线菌纲，其中有59.8%的细菌属于丙型变形菌纲，占绝对优势，成为中肠主要细菌群落。从而显示出中华按蚊成虫肠道细菌的复杂性和多样性
关键词：中华按蚊，PCR-DGGE，肠道菌群，多样性
中华按蚊是我国传播疟疾的主要媒介，是重要的医学昆虫之一。长期大量使用化学杀虫剂，导致蚊虫抗药性的出现和扩散、并严重污染环境[1]。因此，采用生物防制方法灭蚊引起了医学昆虫界及世界卫生组织专家的广泛关注。Micks 等(1961)曾报道按蚊肠道细菌密度减少与疟原虫密度增加的关系；抗生素试验也表明减少按蚊中肠细菌将增加按蚊感染疟原虫的几率，按蚊肠道细菌群落结构变异影响疟原虫在按蚊肠道中的发育(Beier et al.，1994)。
传统研究肠道菌群的方法存在极大的局限性，纯培养只能研究比较容易培养的微生物[2]。目前肠道中能培养的细菌仅占肠道内总细菌数的10%-50%，随着分子生物学技术的发展和相关研究的累计，逐步建立起来以微生物基因组DNA序列信息为依据，通过分析样品中DNA分子的种类和数量来反映微生物之间、区系组成、群落结构以及微生物与其周围环境条件相互作用关系的体系[4]。
本文通过将PCR-DGGE法用于中华按蚊肠道细菌多样性的分析，鉴定其共生细菌种类，分析其分子多态性。
1、主要材料与仪器
QI Aamp DNA Stool Mini Kit（德国Qiagen公司）；细菌通用引物（Zhang & Jackson，2004）（上海捷瑞生物工程有限公司）；PCR扩增试剂（北京鼎国生物技术公司）；40%丙烯酰胺；10%过硫酸铵（APS）；0％变性储备液（总体积100 ml）：40％丙烯酰胺 15ml，50×TAE 缓冲液 2ml，ddH2O 83ml；100％变性储备液（总体积100 ml）：40％丙烯酰胺 15ml， 50×TAE 缓冲液 2ml，去离子甲酰胺 40ml，尿素 42g，ddH2O加到100ml。
台式冷冻离心机5417R(德国Eppendorf)；凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）； PTC-100型PCR仪(美国MJ Research公司)；基因突变检测仪(美国Bio-Rad)；水平电泳仪(北京六一仪器厂) ；TH-系列梯度混合器（上海精密仪器仪表有限公司）；涡旋混匀器（美国fisher scientific公司）；台式离心机（德国Eppendorf）。
2、实验方法
2.1 中华按蚊解剖
选取刚羽化出来的未吸血的中华按蚊成虫35头，浸泡在75%的酒精中约10s，无菌操作下取出虫体并在无菌水中漂洗10s，然后用尖头镊子解剖肠道，将中肠放在装有1ml PBS缓冲液的灭菌的1.5ml EP管中研磨。
2.2 中华按蚊肠道微生物DNA的提取
参照QIAamp DNA Stool Mini Kit 试剂盒说明提取样品总DNA。
2.3细菌16SrDNA片段的扩增
将获得的肠道微生物总DNA用灭菌的双蒸水稀释10倍作为PCR扩增的DNA模板，利用细菌通用引物968GC-L1401进行PCR扩增。获得的PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。
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2.4细菌16SrDNA片段克隆
将获得的中肠PCR产物连接到pMD18-T载体上，转化到大肠杆菌感受态细胞中，通过在抗氨苄的培养基中培养获得克隆子。
2.5 PCR产物的DGGE分析
从细菌克隆文库中随机挑取250个克隆子，通过提取质粒DNA获得PCR产物。将PCR产物在DcodeTM突变检测系统上，变性胶浓度范围30％－70％的变性梯度凝胶电泳中进行电泳分离。
2.6测序
将分离到的不同条带的克隆子挑取出来，培养12h，将菌液送北京三博远志生物技术有限责任公司测序。
3、结果分析
3.1 DGGE结果
经DGGE分析，成虫中肠250个克隆子中得到12种不同的遗传型，即成虫中肠至少有12种细菌。
3.2序列分析
将测序的结果在GeneBank数据库中用BLAST进行检索和同源性比较，成虫肠道分离出的12条不同条带的基因片段序列与GeneBank中细菌序列相似性最高100%，最低为77%，其中7种细菌与已知序列相似性高于98 %，可以认为是同一种(Devereux，1990；Fry，1991)。
经过比对，中华按蚊成虫中肠细菌主要归入3个细菌纲，分别是丙型变形菌纲、黄杆菌纲和放线菌纲。3个纲的分布比例分别为59.8％，27.8%，12.4%。即在中华按蚊成虫肠道中大部分细菌属于丙型变形菌纲，是肠道的主要细菌群落。分离到的丙型变形菌纲的细菌有6株主要属于假单胞菌属、气单胞菌属和肠杆菌科的细菌，
4、结论
本实验利用变性梯度凝胶电泳技术从中华按蚊成虫中肠中分离到了12种不同细菌遗传型，分属于3个不同的细菌纲。其中放线菌纲、气单胞菌属、假单胞菌属和肠杆菌属的细菌在冈比亚按蚊和不吉按蚊中肠细菌都有分布（Lindh，2005），而在中华按蚊成虫肠道中分离到的放线菌纲的微球菌菌属、丙型变性菌纲的气单胞菌属和假单胞菌属的细菌也存在于野生致倦库蚊中肠（Pidiyar，2004）。
在所分离检测到的细菌中，大部分属于丙型变形菌纲，占整个肠道细菌的约59.8%，成为中华按蚊成虫肠道主要的细菌群落。本实验与前人的研究结果都显示：在蚊子的肠道中都存在放线菌纲和气单胞菌属的细菌，其中，气单胞菌主要是从环境中分离得到，是吸血动物的消化道共生菌，对人类来说是一种致病菌。而放线菌纲的细菌是海洋微生物群落的重要组成部分（Ward，2006），而且有些放线菌可以产生具有生物活性的次生代谢物（Hentschel，2002），降解有毒物质。
本实验通过PCR-DGGE法分析中华按蚊成虫肠道细菌种类，结果显示出中华按蚊成虫肠道细菌的复杂性和多样性。
参考文献
1.张红卫，苏云普，许汴利.河南省疟疾防治研究回顾[J]. 中国病原生物学杂志， 2006,2(1):64-66.
2.费鹏，白洪健，等.PCR-DGGE法分析婴儿肠道菌群多样性[J].食品与机械.2013,29(2):60-63.
3.霍萍萍，耿晓娜，赵宝华.PCR-DGGE法在微生物群落检测中的应用[J].安徽农业科学，2011,39(14):8204-8205,8207.
论文作者:王丹丹
论文发表刊物:《中国医学人文》2016年1月第1期
论文发表时间:2016/4/12
标签：细菌论文; 肠道论文; 成虫论文; 中华论文; 放线菌论文; 群落论文; 微生物论文; 《中国医学人文》2016年1月第1期论文;