扬州市疾病预防控制中心 江苏扬州 225001
摘要：疑似流感患者鼻咽拭子标本进行Real time PCR（RT-PCR）检测，将检测呈新甲型H1N1流感病毒阳性的样品再接种MDCK细胞中进行病毒分离，然后进行RT-PCR扩增病毒测序分析HA基因。对扬州市2009～2011年新甲型H1N1流感病毒血凝素（HA）基因的遗传进化特征分析结果表明：在三年中分离出的9株新甲型H1N1流感病毒HA基其核苷酸及氨基酸同源性分别为98.1%～99.8%和96.6%～99.8%；和疫苗株A/California/07/2009比较，核苷酸及氨基酸的同源性分别为98.4%～99.5%和97.0%～99.3%。在2011年3株病毒在抗原位点上发生了点突变。遗传进化分析显示9株病毒形成3个明显的分支。结果证明新甲型H1N1流感病毒发生了一定的抗原漂移。
关键词：新甲型流感病毒；H1N1；血凝素；遗传进化分析
流行性感冒，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。流感病毒属正粘液病毒，系RNA病毒。根据病毒核蛋白和膜蛋白的抗原性，分甲、乙、丙三型。由于甲型容易发生变异，它所引起的流感流行最为广泛和严重[1]。本世纪的第1次流感大流行是2009年在美国和墨西哥，就是新甲型HINI流感病毒引起。分子遗传进化分析显示该病毒基因起源包含人、禽、猪流感病毒基因，是一种三源基因重配体[2]。血凝素（HA）是流感病毒的一种糖蛋白，具有抗原性和免疫原性与致病性关系密切。HA基因经常发生变异，编码的蛋白在抗原位点发生突变，能轻易地逃避宿主原有抗体的中和作用，导致新的流感爆发[3]。新甲型H1N1流感自2009年爆发以来，病毒在流行和传播过程中是否发生变异? WHO推荐的疫苗株是否仍有效? 这些问题都需要进一步研究。因此，本研究对扬州市2009～2O11年所分离的新甲型H1N1流感病毒的HA基因进行序列测定和遗传进化分析，为制定有效的防控措施提供参考。
1 材料与方法
1．1 标本来源
2009～2011年于扬州市国家级流感检测哨点医院扬州市第一人民医院、苏北人民医院和高邮市人民医院对流感样发烧病人采集口腔咽拭子标本，置于Hank’s采样液中[4]，于一2O℃保存备用。
1．2 主要试剂
抗A（HIN1）亚型血清，国家流感中心提供；TPCK胰酶为美国Sigma公司产品；HEPES缓冲液、DMEM 培养基为美国GIBCO公司产品；胎牛血清为杭州四季青公司产品；MDCK细胞由本实验室保存；QIAamp Viral RNA Kit为德国QIAGEN公司产品；新型甲型（H1N1）流感病毒核酸检测试剂盒为上海之江生物科技公司产品。
1．3 引物
扩增甲型H1N1的HA基因的引物是参照已发表NCBI上的HIN1甲型流感病毒基因序列，通过Primer 5．0软件设计的两段引物，分别命名为HA1和HA2。HA1上、下游引物分别为5’_CAAAAGCAGGGGAAAACAAAAGC-3' 和5'-CGGCAATGGCCCCAAATAGGCCTC-3'，片段大小1 050 bp；HA2上、下游引物分别5'-GCAATACCAACTTGTCAAACACC一3' 和5' 一TCTCATGCTTCTGAAATCCTAATG-3'，片段大小为850 bp。
1．4 Real—time PCR（RT—PCR）检测
利用试剂盒说明书方法提取疑似样本的病毒RNA，按新型甲型（HIN1）流感病毒核酸检测试剂盒的操作手册进行RT—PCR检测。
1．5 新甲型H1N1流感病毒分离
将所采集的标本无菌过滤后，取200L过滤液接种在生长良好含2 g·mL-1。TPCK一胰酶的MDCK细胞液中，对产生细胞病变的培养液采用血凝试验测定病毒的血凝效价，用血凝抑制试验测定其血清亚型。
1．6 HA基因扩增及序列测定
取MDCK细胞上清，按李树纯等[5-6]方法提取病毒RNA，进行反转录和PCR扩增。PCR产物用1．2 ﹪琼脂糖凝胶电泳鉴定。按照Axygen公司试剂盒方法切胶回收预期大小的条带，产物送南京金斯瑞生物科技公司经3730全自动测序仪进行正反双向测序，并对所测序列拼接。
1．7 HA基因分析
参考序列为从GenBank下载的WHO推荐疫苗株A／California／07／20O9（HIN1）和近年来分别来自国内外不同地区不同宿主的HIN1流感病毒（表1）。遗传进化树采用MEGA4．0软件Neighbor—Joining方法绘制[7]。
2 结果与分析
2．1 RT—PCR检测结果和病毒分离
通过新型甲型（H1N1）流感病毒核酸检测试剂盒对采集的临床可疑样品进行筛选，结果有9个样品为阳性。按《全国流感／人禽流感监测实施方案（2005-2010）》病毒分离规程接种MDCK细胞后获得9株病毒，血凝和血凝抑制试验均证实为H1N1流感病毒，其中2009年分离4株，2010年分离2株，2011年分离3株。
2．2 HA基因RT-PCR扩增结果
以病毒RNA反转录的cDNA为模板，PCR分段扩增HA1和HA2两个基因，PCR产物经1．2℅琼脂糖凝胶电泳显示，扩增片段大小分别为1 000和800 bp左右，与预期的大小相符。
2．3 HA基因的核苷酸和氨基酸序列分析
将HA1和HA2基因的PCR产物测序，拼接成完整的HA基因序列。HA基因的开放阅读框由1 701个核苷酸组成，共编码567个氨基酸，其中氨基端的17个氨基酸为其信号肽部分。9株新甲型HIN1流感病毒的核苷酸及氨基酸同源性分别为98．1℅ ～99．8℅ 和96．6℅ ～99．8℅；与疫苗株A／California／O7／2O09（HIN1）相比，核苷酸及氨基酸的同源性分别为98．4℅ ～99．5℅ 和97．0 ℅～99．3℅。HA蛋白裂解位点的氨基酸组成为VPSIQSR↓ GLF，为低致病性流感病毒特征。
2．4 HA基因抗原表位和受体结合位点的分析
与A／California／O7／2009相比，9株新甲型H1N1流感病毒抗原位点A区的第133～137位氨基酸（参照H3的氨基酸序列[8]）均为NKGVT，7株病毒140～146位氨基酸均为PHAGAKS，A／Yangzhou／11080／2011和A／Yangzhou／11083／2011发生了S146G突变；抗原位点B区中8株病毒的第156～160位氨基酸位点为KKGNS，而A／Yangzhou／11003／2011发生了S160L突变；7株病毒的第187～198位氨基酸为TSADQQSLYQNA，而A／Yangzhou／11080／2011和A／Yangzhou／11083／2011发生了S188T的突变。9株病毒的抗原位点C区的第51～54位氨基酸均为LCKL，第276～280位氨基酸均为DCNTT。流感病毒的HA受体结合位点位于HA分子的球区末端位置，呈口袋状，包括了130环（135～138）、190螺旋（190～198）、220环（221～228）以及这些结构附近保守的氨基酸，与A／Calif0rnia／07／2O09相比，9株流感病毒HA蛋白225、226位仍为D和Q，具有a-2.6受体特征。潜在糖基化位点是由糖苷链通过糖苷键结合在NXT或NXS的天冬酰胺残基上形成[9]。与A／California／07／2009相比，6株分离病毒的糖基化位点是一致的，而A／Yangzhou／11003／2011缺失了第40位的糖基化位点，A／Gaoyou／9878／2010和A／Gaoyou／9879／2010却在179位多了1个潜在糖基化位点（表2）。
*：“+”存在糖基化位点；“-”不存在糖基化位点。
2．5 HA基因遗传进化分析
将9株病毒的HA基因序列与表1中参考株基因序列采用MEGA4．0软件Neighbor—Joining方法绘制核苷酸遗传发生树（图1）。结果显示9株病毒明显分为3个分支：A／Yangzhou／9757／2O09、A／Yangzhou／9758／2O09、A／Yangzhou／11080／2011和A／Yangzhou／11O83／2011与A／Calfornia／O7／2O09株在同一分支；A／Gaoyou／9855／2009、A／Yangzhou／9764／2009、A／Gaoyou／9878／2010和A／Gaoyou／9879／2010与猪源H1N1病毒在同一分支；而A／Yangzhou／11003／2011与A／shenzhen／lg26／2011在同一分支，与其他毒株亲缘性较远。
Fig．1 Phylogenetic tree of HA genes of nine H1N1 influenza virus isolates
3 讨论
HA蛋白是决定流感病毒毒力的关键因素，前体分子HA0需在宿主蛋白酶作用下裂解为HA1和HA2后病毒才具有感染性。影响HA0裂解的蛋白结构主要有2个因素，一是在裂解位点处连接肽的氨基酸序列，二是裂解位点附近氨基酸是否糖基化。高致病性流感病毒HA裂解位点处存在多个连续碱性氨基酸插入[10]，如H5N1亚型禽流感病毒等强毒株裂解位点处存在多个精氨酸和赖氨酸的连续序列。而本研究中分离株新甲型HIN1流感病毒的裂解位点均为PSIQSR↓GLF，与流感病毒株A／Calfornia／O7／2O09的HA连接肽一致，为低致病性病毒裂解位点的特征序列[11]。裂解位点附近糖链丢失可能使HA对蛋白酶裂解的敏感性增强，从而提高流感病毒的致病力[12-13]。但本研究中未发现裂解位点处有糖基化位点的增加或缺失，因此，所分离的新甲型HIN1流感病毒为低致病性病毒。
HA蛋白通过氨基酸的不断变异来逃避宿主的免疫系统。对2009～2011年的新甲型流感病毒抗原位点分析显示，2009和2010年分离株的主要抗原位点未发生变化，而2011年分离株在A 区和B区上均有点突变发生。由于HA蛋白中氨基酸的糖基化会对其抗原性产生影响[14]，作者分析了这9株分离株的糖基化位点，结果显示A／Yangzhou／11003／2011病毒缺失了40位的糖基化位点，而另外2株A／Gaoyou／9879／201O和A／Gaoyou／9878／2O10病毒却在179位多了1个糖基化位点，位点临近抗原位点B区，对其抗原性的影响还有待于进一步分析。遗传进化分析显示，所分离的毒株形成3个小的分支，有4株与A／Calfornia／O7／2O09同处1个分支，有4株与猪源HIN1流感病毒同处1个分支，还有1株与上述2个分支同源性较低，与同年流行的深圳分离株同源性很高（99．3 ﹪）。结果表明，新甲型H1N1流感病毒分离株的HA 的同源性高低与分离的时间具有一定的相关性，同时存在病毒在人与猪之间相互传播的可能性。就抗原的变异性而言，发生抗原位点突变的毒株集中在2011年，说明随着流感病毒的传播及疫苗的使用，流感病毒已渐渐发生了抗原的漂移，其与疫苗株的抗原差异性值得进一步研究。因此，有必要加强新甲型H1N1流感病毒的监测，及时发现变异株，为流感的流行和暴发作好预警工作。
参考文献：
[1]吕宝成，康来仪等。实用传染病防治[M].2版。北京：学苑出版社，2005：460-469
[2]Garten R J，Davis C T，Russell C A，et a1．Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A（H1N1）influenza viruses circulating in humans[J]．Science，2009，325（5937）：197—201．
[3]Wang T T，Palese P．Universal epitopes of influenza virus hemagglutinins?[J]．Nature Structural 8L Molecular Biology，2009，16（3）：233—234．
[4]郭元吉，程晓雯．流行性感冒病毒及其实验技术[M]．北京：中国三峡出版社，1997：43—102．
[5]李树纯，李心海，仲书官，等．H9N2亚型禽流感病毒基因组的遗传进化分析[J]．病毒学报，2012，28（1）：7-14．
[6]丛立新，宿甲子，孟继伦，等．miR-92b一3p在禽流感病毒感染与非感染鸭中的表达差异[J]．扬州大学学报：农业与生命科学版，2012，33（3）：5-8．
[7]张小荣，程小果，张建军，等．H120活疫苗对部分基因型传染性支气管炎病毒的免疫保护效力[J]．扬州大学学报：农业与生命科学版，2011，32（3）：1-5．
[8]wiley D C，Wilson I A，Skehel J J．Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation[J]．Nature，1981，289（5796）：373—378．
[9]Basak S，Pritchard D G，Bhown A S，et a1．Glycosylation sites of influenza viral glycoproteins：characterization of tryptic glycoprotein from the A／USSR（H1N1）hemagglutinin glycoprotein[J]．J Virol，1981，37（2）：549—558．
[10]Bosch F X，Garten W，Clenk H D，et a1．Proteolytic cleavage of influenza virus haemagglutinins：primary structure of the connecting peptide between HA1 and HA2 determines proteolytic cleavability and pathogenicity of avianinfluenza viruses[J]．Virology，1981，l13（2）：725—735．
[11]Wu B，Wang C M，Dong G Y，et a1．Molecular characterizati0n of H1N1 influenza A viruses from human cases in North America[J]．Chinese Sci Bull，2009，54：2179—2192．
[12]Senne D A，Panigrahy B，Kawaoka Y，et a1．Survey of the hemagglutinin（HA）cleavage site sequence of H5 and H7 avian influenza viruses：amino acid sequence at the HA cleavage site as a marker of pathogenicity potential[J]．Avian Dis，1996，40（2）：425—437．
[13]Wang W，Lu B，Zhou H，et a1．Glycosylation at 158N of the hemagglutinin protein and receptor binding specificity synergistically affect the antigenicity and immunogenicity of a live attenuated HSN1 A／Vietnam／1203／2004 vaccine virus in ferrets[J]．J Virol，2010，84（13）：6570—6577．
[14]朱雯迎，许传田，张秀美，等．6株H9N2禽流感病毒分子进化及对小鼠的致病性[J]． 中国兽医学报，2011，31（8）：118O一1183．
论文作者:胡建平
论文发表刊物:《健康世界》2014年22期供稿
论文发表时间:2016/4/7
标签：病毒论文; 流感论文; 氨基酸论文; 位点论文; 基因论文; 抗原论文; 甲型论文; 《健康世界》2014年22期供稿论文;