滕加文 周斌 李刚 山东中医药大学附属医院骨科 山东 济南 ２５００００
【摘要】 目的 补肾壮骨胶囊对兔膝骨性关节炎软骨细胞凋亡指数及Bax、Bcl－２mRNA 的影响.方法 选取４０只新西兰兔随机分为A 正常组、B 模型组、C治疗组、D对照组.B、C、D三组按照Hulth造模方法造成膝骨性关节炎模型.C组给予补肾壮骨胶囊,D组给予壮骨关节丸.给药８周后,采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测软骨细胞的凋亡指数(AI);逆转录－聚合酶链式反应(RT－PCR)检测关节软骨细胞Bcl－２mRNA、BaxmRNA表达水平.结果 与正常组相比,C组和D组的软骨细胞AI均较高,但都小于B组;C组和D组在Bax/Bcl－２比较无差异(P＞０．０５),但都低于B组.结论 补肾壮骨胶囊能抑制软骨细胞的凋亡,提高软骨细胞Bcl－２mRNA表达,降低BaxmRNA表达. 【关键词】 补肾壮骨胶囊; 膝骨性关节炎; 软骨细胞凋亡; Bax; Bcl－２【Abstract】 Objective:BushenzhuanggucapsuleonrabbitkneeosteoarthritiscartilagecellapoptosisindexandBax,bcl－２mRNA．Methods:select４０NewZealＧandrabbitswererandomlydividedintoanormalgroup,modelgroupB．CgroupandDcontrolgroup),B,C,DgroupsaccordingtoHulthmodelingmethodresultinginkneeosteoarthritismodel．CgroupweretreatedwithBushenZhuanggucapsuleandgroupDreceivedZhuangguGuanjiepill．After８weeksoftreatment,usingtermiＧnaldeoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling(TUNEL)forthedetectionofcartilagecellapoptosisindex(AI)transfer;reversetranscriptionpolymerasechainreactionShould(RT－PCR)forthedetectionofarticularcartilagecellsofbcl－２ mRNA,BaxmRNAexpressionlevel．Results:comparedwiththenormalgroup,CgroupandDgroupcartilagecellAIwerehigher,butlowerthanthatofgroupB;ingroupCandgroupDintheBax/Bcl－２hadnodifference(P＞０．０５),butlowerthantheBgroup．Conclusion:Bushenzhuanggucapsulecaninhibittheapoptosisofcartilagecells,improvecartilagecellsofbcl－２mRNAexpression,deＧcreasetheexpressionofBaxmRNA．[keyword]:Bushenzhuanggucapsule;kneeosteoarthritis;cartilagecellapoptosis;Bax;Bcl－２ 【中图分类号】R３２９【文献标识码】B 【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－１４３３－０２
骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)在骨科是常见的疾病,该病以关节退行性软骨丢失且伴有关节周围骨反应为特征,主要表现为关节疼痛和活动受限,是一种严重危害患者生活质量的退行性关节疾病[１].流行病学调查表明,原发性骨关节炎患者最突出的流行病学特点是随年龄增加,发病率不断增高,好发于５０岁以上[２].但是,目前对于OA的病因及发病机制尚不完全清楚.有的还停留在假说阶段,治疗方法各有不同,疗效也有较大差异.已有研究表明[３－４],OA的发病原因与软骨细胞本身有关.所以本文补肾壮骨胶囊对兔膝骨性关节炎软骨细胞凋亡指数及Bax、Bcl－２mRNA的影响.
１ 材料与方法
１．１ 实验材料 实验白兔为康新西兰白兔４０只,普通级,雌雄各半,体重２．５Kg~３．０Kg.由山东省农科院实验动物场提供,实验兔质量合格证号:SCXK(鲁)２００３０００６.补肾壮骨胶囊由山东省中医院制剂室提供,每粒０．５g,每克粉末相当于生药４g.壮骨关节丸购买于深圳三九医药股份有限公司生产,药物批号:国药准字Z４４０２３３７７.１．２ 实验方法１．２．１ TUNEL法检测软骨细胞AI 切片二甲苯脱蜡,１０分钟３次,梯度酒精脱水后,加入蛋白酶,室温下消化１５min,PBS冲洗三次,加入５０μlTUNEL 混合液;滴加２０μl的TUNEL反应混合液,并设立阴性对照(TdT 酶用PBS 缓冲液代替),３７℃恒温箱中反应３０min;PBS冲洗５min×３次;PBS洗５min×３次;加入BCIP/NTB显色剂,室温显色１０分钟,PBS洗片三次,脱水、封片,光镜辨认被标记的细胞核.正常软骨细胞核未见明显染色,细胞分布均匀,胞体大小基本一致;凋亡软骨细胞TUNEL染色阳性,表现为细胞核呈致密的棕黄色染色,染色质呈明亮的凝聚块,单个凋亡的细胞与周围细胞分离,细胞皱缩呈圆形或卵圆形.显微镜下,每张切片选３个高倍视野,计数其中软骨细胞的总数和TUNEL阳性细胞数.细胞凋亡指数(AI)[１３]根据下列公式计算:AI＝TUNEL标记阳性软骨细胞数/软骨细胞数×１００％.１．２．２ 相对定量Real－TimePCR 通过相对定量Real－TimePCR,以GAPDH 为内参照基因,采用相对CT 值(２一△ct)法分析BaxmRNA 和Bcl－２mRNA的相对表达量.PCR引物设计如表１所示,PCR扩增条件如表２ 所示.由表４可知,对于Bcl－２mRNA的相对表达量,B、C、D组明显高于A组(P＜０．０１),C、D两组明显高于B组(P＜０．０１),C组较D组稍高,二组差别无显著意义(P＞０．０５);BaxmRNA 的相对表达量,B、C、D组明显高于A 组(P＜０．０５),B组明显高于C、D组(P＜０．０１),D组较C组稍高,但二组差别无显著意义(P＞０．０５);对于Bcl－２/Bax,A 组高于B、C、D组(P＜０．０５),B组低于A、C、D组(P＜０．０５),C组比D组稍高,但二者比较差别无显著意义(P＞０．０５).
３ 讨论
OA在我国传统中医属于“骨痹”范畴,多见于体型较胖、长期慢性劳损之人.其病机可概括为:本虚标实,虚实夹杂,以虚为主,肝肾亏虚,筋骨失养,阳虚生寒,阻滞经络[５].补肾壮骨胶囊由淫羊藿、桑寄生、熟地、杜仲、当归、川断、牛膝、独活、红花、威灵仙、土元、穿山甲、甘草等组成,具有补肝肾、壮筋骨、舒经络、祛风湿、活血止痛之功,临床显示该药对OA 有明显疗效[６].蔡余力[７]等人研究表明,补肾壮骨胶囊通过抑制一氧化氮合酶(iNOS)的表达,降低一氧化氮(NO)含量,减少软骨细胞凋亡,促进软骨基质合成及抑制其分解,抑制滑膜炎症,延缓关节软骨退变,促进关节软骨的修复.研究发现OA 关节软骨细胞凋亡过程中有相关癌基因的表达,包括P５３、cmyc和bcl－２.Yang[８]等发现缺乏Ⅱ型胶原的转基因小鼠软骨细胞表现呈明显凋亡,同时伴有Bcl－２水平下降.Erlacher等在转录和蛋白水平研究OA病人及健康成人关节软骨中的表达发现,OA病人Bcl－２mRNA 表达水平较高,邻近软骨缺损区的软骨细胞高表达Bcl－２蛋白.有研究表明补肾壮骨类中药可减少软骨细胞的过度凋亡,促进实验性OA 软骨细胞增殖[９].本研究通过TUNEL法检测软骨细胞凋亡指数,RT－PCR 检测软骨细胞Bax、Bcl－２mRNA的表达,结果发现,补肾壮骨胶囊能够显著的降低细胞凋亡指数,上调Bcl－２mRNA的表达,抑制BaxmRNA 的表达,减少了软骨细胞的凋亡数量,与模型组相比,呈显著性差异,P＜０．０５.因此这反映了补肾壮骨胶囊可对凋亡的调控,通过上调bcl－２表达,抑制BaxmRNA 的表达来保护软骨细胞免受凋亡.参考文献[１] 王飞,史廷瑞,乌兰其其格．通痹汤加减治疗风湿性关节炎１００例[J]．中国中医急症,２００６;１５(５):５４８．[２] 吴孟超,吴在德．黄家驷外科学[M]．７版．北京:人民卫生出版社,２００８;３０２５－３０２７．[３] ER HK,MoneeauV,CamorsE,etal．AnnexinVoverexpressionincreasedjointchondrocyteapoptosisinducedbybasiccalciumphosphatecrystals[J]．AnnRheumDis,２００８;６７(１１):１６１７－１６２５．[４] KawaguchiH．EndochondralossificationsignalsincartilagedegradationdurＧingosteoarthritisProgressioninexperimentalmousemodels[J]．MolCells,２００８;２５(１):１－６．[５] 王静,李建平,张跃文,等．淫羊藿药理学研究进展[J]．中国药业．２００９;１８(８):６０－６１．[６] 玄勇,鲁艳莉,李晶等．膝关节骨性关节炎的运动疗法[J]．中国康复医学杂志,２０１３;１８(９):５２３－５２５．[７] 蔡余力,李刚,颜冰．补肾壮骨胶囊治疗膝关节骨性关节炎的实验研究[J]．中医正骨,２００９;１８(１０):１－４．[８] Steven;AI,WheelerCA,TannenbaumSR,etal．NitricoxideenhancesagＧgrecandegradationbyaggremnaseinresponsetoTNF－alphabutnotILlbetatreatment,atapost－transcriptionallevelinbovinecartilageexplants[J]．OsteoarthritisCartilage,２００８;６(４):４８９－４９７．[９] 潘浩,胡庆丰,李雄峰,等．补肾壮筋汤对兔早期实验性骨关节炎软骨细胞凋亡及PCNA表达的影响[J]．中国中医骨伤科杂志,２００４;１２(４):１６－２０．
论文作者:滕加文 周斌 李刚
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年12月供稿
论文发表时间:2016/3/9
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