彭远远 王庆（安徽省胸科医院 安徽合肥230000）
【摘要】目的 探讨结核分枝杆菌T 细胞斑点试验（T-SPOT.TB）技术在结核性胸膜炎诊断及鉴别中的临床应用价值。方法 收集结核性胸膜炎组患者48 例、非结核性良性胸膜炎组患者25 例和恶性胸腔积液患者32 例。用T-SPOT.TB 测试上述患者的胸腔积液中单个核细胞（PEMC）中对结核分枝杆菌早期分泌靶向抗原6（ESAT-6）和培养滤液蛋白10（CFP-10）致敏的T 细胞与腺苷酸脱氨酶（ADA）、血清结核抗体（Tb-Ab）进行比较，分析其诊断价值。结果 结核性胸膜炎检测组T-SPOT.TB 试验的阳性率显著高于非结核性良性胸膜炎组和恶性胸腔积液组，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 T-SPOT.TB 试剂盒能够辅助诊断结核性胸腔积液，在临床诊断中具有较高的灵敏度和较高的特异度。
【关键词】T-SPOT.TB 结核性胸腔积液 临床诊断【中图分类号】 R2 【文献标号】 A 【文章编号】 2095-9753（2016）3-0039-02
胸腔积液临床常见且病因复杂，首要病因为结核。表现为淋巴细胞为主的渗出性炎症．由于该病在临床上缺乏特异性表现，早期诊断困难[1]。传统手工涂片镜检检测阳性率低．胸膜活检因其为创伤性操作限制了在临床上的广泛应用。腺苷脱氨酶检测试剂盒和免疫学血清结核抗体技术虽提供了快速诊断技术，但仍存在假阳性等技术方面的问题。80 年代[2]，Czerkinsky CC 根据ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。结核杆菌感染T 细胞斑点（T-SPOT.TB) 技术是目前诊断结核性胸膜炎敏感性较高的细胞学检测技术。我们应用T-SPOT.TB 技术检测胸腔积液单个核细胞(PEMCs）中被结核分枝杆菌早期分泌靶向抗原6ESAT-6 和培养滤液蛋白10(CFP-1o) 致敏的T 细胞数目[3]，来评价该试剂盒诊断结核性胸腔积液的临床价值。
1. 材料与方法1.1 标本来源 收集2014 年1 月到10 月在我院结核科、呼吸科、肿瘤科等科室收治的经过胸部CT、抗酸染色涂片镜检和组织病理学检查等证实的胸腔积液患者105 例，其中结核性胸膜炎患者48 例，男性25 例，女性23 例，年龄范围为24-70 岁，非结核性良性胸膜炎患者25 例，男性14 例，女性11 例，年龄范围为28-65 岁，恶性胸腔积液患者32 例，男性14 例，女性18 例，年龄范围为22-68 岁，组间无差异。结核性胸腔积液的诊断标准：1、胸腹水或胸膜活检培养出结核分支杆菌2、结核分枝杆菌DNA 检测阳性3、胸膜活检病理干酪样肉芽肿。恶性胸腔积液的诊断均经过组织学或病理细胞学检查证实。
1.2 仪器与试剂 96T-SPOT.TB 试剂盒、 5%CO2 培养箱，自动微孔洗板机，移液器及消毒枪头、PBS 缓冲液、水平离心机、II 级生物安全柜等。
1.3 检测方法 胸腔积液中的单个核细胞(PEMC) 的分离、收集采集新鲜胸腔积液5 lOm1．置肝素锂抗凝管即刻混匀．加入等体积RPMI 1640 细胞培养液混匀后．加在预先准备好的（icol）淋巴细胞分离液上层．3000 r ／ min 水平离心2O min．用毛细滴管吸取中间层云雾状细胞．用RPMI 1640 培养液洗涤PEMC 2 次．进行显微镜下细胞计数．根据计数结果用无血清AIM—V 培养基调整细胞悬液浓度至2．5x106 ／ ml.检测过程在已包被小鼠抗人I（N 一单克隆抗体的微孔培养板中分别加入作为阴性对照的AIM—V 培养基、阳性对照植物血凝素PHA、MTB 特异性混合多肽早期分泌靶向抗原6（ESAT-6) 与培养滤液蛋白1O(CFP-10) 各501l．然后在各孔中加入调整好浓度的细胞悬液100l 将微孔板放在37OC，5％ C02 培养箱中培养16 ～ 20h，用PBS 缓冲液洗板，加人碱性磷酸酶标记的单克隆抗体501，在2 8℃下孵育1h 后洗板．最后在每孔中加入底物显色液．室温下静置反应7 min 后用蒸馏水终止反应。
T-SPOT.TB 试验结果判读根据T-SPOT.TB 试剂使用说明书．如果阴性对照孔斑点数(SC<6 时且( 抗原A 或抗原B 孔的斑点数1 一（阴性对照孔斑点数) ≥ 6，可判断检测标本为阳性；如果阴性对照孔斑点数为6 ～ 10 个时且（抗原A 或抗原B 孔的斑点数1 ≥ 2x(J 性对照孔斑点数) 可判断检测标本为阳性：如果上述标准不符合且阳性质控对照孔正常时检测结果为“阴性”。
1.4 统计学方法 采用SPSS13.0 统计软件，数据呈偏态分布，采用Mann-Whitney U Test 非参数检验，用P50(P25-p75) 表示，以P<0.05 代表统计学上差异有显著性。采用灵敏度和特异度的计算公式，统计三种检测方法的百分率。
2 结果2.1 T-SPOT.TB 阳性率在三组间的比较105 例结核性胸膜炎组患者、非结核性良性胸膜炎组患者和恶性胸腔积液患者T-SPOT.TB 阳性率比较结果如下表一，结核患者胸腔积液中T-SPOT.TB 阳性率明显高于恶性组和非结核良性组，两者比较差异具有统计学意义（P<0.05）。恶性患者和非结核良性患者胸腔积液的T-SPOT.TB 结果无明显差异（P>0.05）。
3 讨论T-SPOT.TB 做为一种新型酶免疫检测方法应用于结核杆菌感染的检测，不仅敏感度高，特异性强，而且操作简单，用时少，一般2 天就能得到结果，同时，非结核患者不会产生假阳性[4]。T-SPOT.TB 与传统结核病检测方法在敏感度和特异度上均有明显提高。
本研究结果显示T-SPOT.TB 检测结核性胸腔积液的特异性和灵敏度与美国FDA 数据（特异度94.6%，敏感度91.5%）相近[5]。
但确诊结核病，需结合流行病学、接触史、临床症状有咳嗽、咳痰、咯血，午后低热、夜间盗汗、消瘦（结核菌中毒症状）、胸痛等，影像学检查以及传统方式检查（尤其农村），结核菌皮试法，痰找结核菌等，条件许可的前提下，提倡T-SPOT.TB（结核感染T 细胞斑点试验）技术用于检测结核感染后特异性T 细胞分泌的г 干扰素，判断是否感染结核，同时T-SPOT.TB 检测缺点：检测步骤复杂，对操作人员，实验条件要求高，仪器及试剂的价格昂贵，这使得T-SPOT.TB 检测限于发达城市、生活水平较高城市开展。
综上所述，对结核性胸腔积液的临床诊断具有较高的灵敏度和特异性，联合ADA 和 Tb-Ab 等传统检测方法可以提高其阳性率，更好的为临床服务。
参考文献[1] 王更民，赵德福，王国治，等. 结核病诊断实验室检验规程[M]. 北京：中国教育文化出版社，2006，2006：9-16，30-45.[2] 肖倩，黄旭峰.T-SPOT．TB 试验快速检测结核杆菌感染的临床应用研究《实验与检验医学》2009 年 第3 期 272-274[3] 于永敏，任鹏飞，陈裕.T—SPOT．TB 诊断活动性结核病的应用价值《医药论坛杂志》2014 年七月第35 卷第7 期104-107.[4] 刘国威, 梅早仙, 杜钟珍.T-SPOT.TB 在结核病诊断中的应用价值《天津医药》2012 年09 期[5] 孟成艳 , 张舒, 金嘉琳. T-SPOT.TB 技术用于结核的辅助诊断《微生物与感染》2006 年9 月第1 卷第3 期 190-193
论文作者:彭远远 王庆
论文发表刊物:《中国医学人文》2016年3月第3期
论文发表时间:2016/5/31
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