1.山东省实验中学 250000；2.黑龙江省双鸭山市第一中学 155100；3.山东大学基础医学院，生化与分子生物学系 250100
1.背景介绍
阿尔兹海默病（Alzheimer's disease，AD）作为一种神经退行性疾病，是老年痴呆中最常见的一种，也是老龄人口中发病率最高的疾病之一。流行病学研究表明，65岁以上人群中，约11%有患病特征；85岁以上的人群中，约1/3患有不同程度的老年痴呆症。现如今，在美国和欧洲，AD影响着大约1.06亿人的生活。据国际阿尔茨海默病协会（ADI）发布的报告显示[1]，2015年全球新发990万AD患者，到2050年，全球患有AD疾病的人数将增加至1.315亿人。
然而与疾病的严峻形势严重不符的是，近年来有关AD的药物研发和疾病的早期诊断，几乎没有取得任何突破性进展。随着基因芯片技术的不断进步，人们发现在AD患者体内，某些microRNA有其特殊的表达谱[2-4]。于是为了能够对AD疾病进行早期的诊断，我们试图利用microRNA的表达差异，发明一种简单快速、安全廉价的microRNA检测装置，以期实现对AD疾病的早期诊断。
2.实验设计
经过分析，我们最终选择了在患者体内高表达的microRNA-34c作为检测目标，试图设计一个microRNA控制下的绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）表达装置，在荧光蛋白的编码框附近位置插入microRNA的互补序列，anti-microRNA。我们的预期效果是，当microRNA存在时，它们会与anti-microRNA位点互补结合，干扰GFP的正常表达，且microRNA含量越高，GFP的表达量越低，即荧光强度与microRNA浓度呈现一种负相关，从而可以通过细菌的荧光强度反映系统中microRNA的浓度，从而对AD疾病做出诊断。
在我们的装置中，用到的基本生物学原理是原核生物中的microRNA对基因表达的调控作用。基于这种原理构建出的装置有以下几点需要论证：
2.1 anti-microRNA插入位点的选择
在真核细胞中进行microRNA实验时，一般会将anti-microRNA插入到蛋白表达框的3’非翻译区（untranslate region，UTR）的位置。但对于原核细胞而言，由于缺少细胞核的界限，转录和翻译过程是同时发生的，这样可能就会有下面的假设：如果在原核细胞中进行microRNA实验时依旧将anti-microRNA序列插入到蛋白ORF的3’-UTR的位置，很有可能在完成蛋白质翻译之前，microRNA还没有发挥作用，那么这样的位置将会是无效的。这里所说的效果包括两个方面，一是插入到GFP的表达框中的anti-microRNA序列不会影响原有GFP的正常表达，二是插入到GFP的表达框中的anti-microRNA确实能对microRNA产生响应，最终能在GFP表达量上有所体现。
为了探究究竟在何处插入anti-microRNA会带来最佳的效果，我们在GFP的表达框中选取了三个位置进行比较（图1），三个实验组分别命名为MRG、RMG、RGM。我们单独转化了这些质粒，之后测定GFP表达，以期找到最佳的anti-microRNA插入位置。
图1 anti-microRNA在GFP表达载体中的不同插入位点示意图
Promoter：启动子；RBS：核糖体结合位点；GFP：
绿色荧光蛋白；terminator：终止子。
A：Nomal Expression（CKP）；B：Promoter-antimicro-RBS（MRG）；
C：RBS-antimicro-GFP（RMG）；D：GFP-antimicro terminator（RGM）.
2.2插入到GFP表达框中的anti-microRNA是否影响原有GFP的正常表达
我们认为，如果令microRNA作为一种输入信号，那么细菌中一定要有一种传感器装置来接收信号，这个装置就是anti-microRNA。令anti-microRNA与报告基因GFP偶联在一起，就形成了最简单的传感器。我们希望通过把anti-microRNA插入到GFP的表达框中来实现这种偶联。问题在于，采取这样的方式是否将影响原有GFP的正常表达。为此我们单独转化了实验组的质粒，之后测定绿色荧光信号的改变，对这一点进行了证明（图1和图2）。
图3 microRNA在原核细胞中对GFP表达的影响
a.Negative Control（CKN）；b.Normal Expression（CKP）；c.Promoter-antimicro-RBS（MRG）；C：RBS-antimicro-GFP（RMG）；D：GFP-antimicro terminator（RGM）.
总体而言，我们做了以下的工作来进行核心概念的功能性论证：①构建三种含有不同anti-microRNA插入位点的测试装置；②每一种装置进行单质粒转化，测试几个装置的初始状态；③对②中筛选到的正常态的装置进行microRNA转化，测试装置对于输入信号（microRNA）的响应。以上三步筛选到最优装置，用于之后的构建和测试。
实验结果显示，Promoter-antimicro-RBS（MRG）与GFP-antimicro- terminator（RGM）两个装置在没有进行microRNA输入时有正常的GFP荧光产生，证明了这两个位点的antimicro插入不会影响原有GFP的正常表达（图2c，2e）；当转化microRNA进入装置后，仅有MRG这一种装置的荧光强度发生了显著的改变，证明了在MRG这种装置中microRNA才能够在原核细胞中发挥作用（图3c）。同时也获得了后续实验的理想装置。
3.检测装置的构建
3.1 microRNA的合成
通过济南博尚生物公司直接合成hsa-miR-34c microRNA。
3.2 anti-microRNA的设计与合成
我们设计了两端的酶切位点，加上anti-microRNA本身的序列，交由南京金斯瑞生物公司进行全基因合成，合成序列的信息如下：
图6 流式细胞仪检测不同浓度的microRNA
转入MRG装置后对GFP表达的影响
Plot1：阴性对照CKN；Plot2：转入10uM不相关microRNA；
Plot3：转入10uM目标microRNA；Plot4：转入20uM目标microRNA.
接下来，我们验证了该装置对于不同浓度的microRNA的响应情况。分别将10uM不相关microRNA，10uM目标microRNA和20uM目标microRNA转化入装置，使用流式细胞仪在第15小时时进行测量，结果如下（图6）。可以看出，整体的表达水平呈现了比较好的梯度降低，证明了我们的装置不仅能够检测microRNA的有无，还能够检测microRNA量的多少，这对于装置的实际应用是十分关键的。
5.讨论
5.1 anti-microRNA插入位点的选择
真核生物中的microRNA的作用位点一般位于mRNA的3’-UTR，转录完成之后mRNA需要在细胞核中进行加工，然后成熟的mRNA才能进入胞质中进行翻译。但是原核生物的转录和翻译过程是同时进行的，即转录还没有完成，翻译已经开始。所以如果原核的microRNA作用位点还是位于mRNA的3’-UTR区域，可能不会影响蛋白质的翻译过程。因此我们选择了3个不同的位点插入anti-microRNA，分别是启动子和RBS之间（MRG）、RBS和GFP之间（RMG）、GFP和终止子之间（RGM）。希望能够在这3个位点中找到一个合适的位点使得microRNA和anti-microRNA作用后能影响GFP的表达。
5.2 插入的anti-microRNA是否影响原有GFP的表达
原有的GFP质粒CKP是能够正常表达GFP的。当我们选择3个不同的位点插入anti-microRNA后，很可能会由于外来序列的插入而影响GFP的表达，如果是这样的话会干扰我们观察microRNA与anti-microRNA的相互作用对GFP表达的影响。因此我们在装置中加入microRNA之前，先检测一下这3种不同的插入情况中，GFP的表达是否有变化。实验结果显示（图2），当把anti-microRNA插入到RBS和GFP之间（RMG）的时候，与CKN和CKP相比较得知，RMG基本不再表达GFP；而插入到启动子和RBS之间（MRG）、GFP和终止子之间（RGM）的装置中，与CKP比较，GFP的表达基本没有发生变化。因此后续的实验应该以MRG和RGM作为检测装置。
5.3 microRNA和anti-microRNA能否在原核细胞中发挥作用
我们在实验中所选择的microRNA，以及我们所依据的microRNA对蛋白质表达的抑制作用机制，都是建立在真核细胞的基础之上的。而本次实验中我们选择的microRNA作用的检测装置是原核细胞的大肠杆菌。迄今为止人们对于原核细胞中的microRNA的作用机制并不十分清楚[5，6]，所以我们在实验之前必需先明确真核细胞中的microRNA的作用机制能否在原核细胞中发挥作用。因此我们在图2中的各种装置中都分别转入了与anti-microRNA序列互补的microRNA以及不相干的无关microRNA做对照，然后比较二者GFP的表达是发有变化。酶标仪的检测结果显示（图3，图5），只有MRG装置中，microRNA能够与anti-microRNA相互作用，从而抑制GFP的表达。图中显示，从细胞培养的12到20小时之内，转染目标microRNA的装置都比对照组的GFP表达下调。
5.4不同浓度的microRNA对GFP表达的影响
要想用我们设计的装置能够检测出AD病人体内microRNA表达量的不同，该装置需要能够对不同浓度的microRNA做出不同的反应。因此我们在MRG装置中，分别转入了10uM不相关microRNA，10uM目标microRNA和20uM目标microRNA，使用流式细胞仪在第15小时时测量装置中GFP表达的变化，结果如图6。从图中我们可以看出，随着转入目标microRNA浓度的增加，GFP的表达呈现出了较好的梯度变化，说明了MRG装置不仅能够检测出目标microRNA的有无，还能检测出目标microRNA的量的变化，这对于该装置的实际应用是十分关键的，显示出了良好的临床应用前景。
参考文献：
[1]World Alzheimer's Report 2015：Global Impact of Dementia. Medscape. August 27，2015
[2]Sachli Zafari，Christina Backes，Eckart Meese，Andreas Keller. Circulating Biomarker Panels in Alzheimer’s Disease. Gerontology. 2015；61（6）：497-503.
[3]Wu HZ，Ong KL，Seeher K，Armstrong NJ，Thalamuthu A，Brodaty H，Sachdev P，Mather K. Circulating microRNAs as Biomarkers of Alzheimer's Disease：A Systematic Review. J Alzheimers Dis. 2016；49（3）：755-66.
[4]Cogoni C，Ruberti F，Barbato C. MicroRNA landscape in Alzheimer's disease. CNS Neurol Disord Drug Targets. 2015；14（2）：168-75.
[5]Susan Gottesman. Micros for microbes：non-coding regulatory RNAs in bacteria. Trends Genet. 2005 Jul；21（7）：399-404.
[6]Kang SM，Choi JW，Lee Y，Hong SH，Lee HJ. Identification of microRNA-size，small RNAs in Escherichia coli. Curr Microbiol. 2013 Nov；67（5）：609-13.
论文作者:王天鸿1,任泓昱2,任桂杰指导老师3
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2017年6月第12期
论文发表时间:2017/12/25
标签：装置论文; 细胞论文; 位点论文; 目标论文; 荧光论文; 浓度论文; 序列论文; 《中国医学人文》(学术版)2017年6月第12期论文;