(南华大学附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科 湖南 衡阳 421001）
【摘要】 目的：本研究探讨干扰miR-150表达对鼻咽癌细胞5-8F增殖的影响。方法：使用脂质体将miR-150抑制剂转染5-8F，以无关序列抑制剂作为阴性对照。采用qRT-PCR技术验证miR-150 抑制剂转染细胞中miR-150的表达水平；通过MTS法实验观察miR-150表达下调对5-8F细胞增殖能力的影响。结果：转染miR-150 抑制剂的5-8F细胞中miR-150的表达量明显下调，并且呈现明显的浓度依赖性。表明转染miR-150 抑制剂能显著降低5-8F细胞中miR-150的表达。转染miR-150 抑制剂的 5-8F细胞与对照细胞相比，增殖速度明显减慢，差异具有显著性（P<0.05）。结论：miR-150能促进鼻咽癌细胞增殖能力，它可能在鼻咽癌的发生和进展中发挥重要作用。
【关键词】 鼻咽癌；miR-150；细胞增殖
【中图分类号】R73 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）06-0172-02
miRNA是一类长度为18～24个核苷酸的非编码、内源性小RNA分子，通过靶向结合mRNA的3′非编码区，使翻译抑制或导致mRNA降解，进而调控靶基因表达量[1]。miRNA参与重要生物学进程的调控，包括细胞增殖、凋亡、分化、代谢等过程。肿瘤的发生发展过程涉及多种基因的参与和多种因子的调控。miRNA是重要的调控因子，通过调节相关癌基因或抑癌基因，从而参与多种肿瘤的发生、进展过程[2]。近期，本课题通过qRT-PCR技术检测了miR-150在鼻咽癌细胞系以及放疗抵抗中差异表达，通过转染miR-150抑制剂CNE-2R细胞的放射敏感性得到了提升，而转染miR-150模拟物后CNE-2细胞的抗辐射能力明显增强。本研究通过在鼻咽癌5-8F细胞中转染miR-150 抑制剂使miR-150表达下调，探讨miR-150下调对鼻咽癌细胞增殖的影响，从而初步揭示miR-150在鼻咽癌中生物学功能。
1.材料与方法
1.1 主要材料
miR-150 抑制剂及对照购自Ambion公司。
1.2 细胞培养
鼻咽癌细胞株5-8F为典型低分化鳞癌细胞，培养于含10％小牛血清的RPMI1640，在95%湿度，5% CO2，37℃条件下。
1.3 细胞转染
用胰蛋白酶对细胞进行消化，将细胞计数并接种在6孔板中，确保在转染当天，70％的细胞汇合。使用Lipofectamine2000（Invitrogen）将浓度均为100nM的miR-150 模拟物,miR-150抑制剂以及相应对照物转染至细胞。在转染36小时后，进行后续的实验。
1.4 qRT-PCR检测
取适量细胞，提取用试剂盒(OMEGA Bio-Tek)提取纯化miRNA，并利用miScript II RT Kit (QIAGEN)逆转录合成cDNA。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆按照SYBR Green PCR试剂盒（QIAGEN）说明书进行Real-time PCR。研究miR-150含量时，选取RUN6作为内参。提取总RNA，实验独立重复三次。
1.5 MTS法检测细胞增殖活性
采用MTS法检测细胞增殖，根据CellTiter 96? AQueous 单溶液细胞增殖检测试剂盒（Promega公司）说明书方法对细胞增殖进行检测。
2.结果
2.1 转染miRNA-21 抑制剂细胞内miRNA-21表达变化
分别用无关序列抑制剂及miR-150 抑制剂（终浓度为10μM/L、20μM/L、40μM/L）转染5-8F细胞，48小时后抽提细胞总RNA，运用qRT-PCR验证miR-150在细胞中的表达。结果表明，转染不同浓度miR-150抑制剂的细胞中miR-150的表达量明显下调，并且呈现明显的浓度依赖性。表明转染miR-150 抑制剂能显著降低5-8F细胞中miR-150的表达。
2.2 miR-150下调后5-8F细胞增殖速度减慢
通过MTS法检测，绘制生长曲线来考察miR-150下调对鼻咽癌细胞5-8F增殖的影响。结果发现，转染不同浓度miR-150 抑制剂的5-8F细胞从第48h起增殖速度明显减慢。统计分析各组在96h时的细胞增殖情况发现，不同浓度miR-150 inhibito组与对照细胞组相比，差异均有统计学意义（P<0.05），并且呈现明显的浓度依赖性。
3.讨论
MicroRNAs (miRNAs)是一类内源性的短的保守的非编码RNA，它们通过特异的与mRNA的3'UTR(3'端非翻译区)结合使之降解或者抑制其翻译，从而调控相关靶基因的表达[3]。miRNA在许多人类癌症中发挥着原癌基因或肿瘤抑制基因的作用。一些miRNA已被证实与鼻咽癌的发生，发展，侵袭和转移密切相关，如miR-141，miR-218[4]。然而，miRNA在鼻咽癌辐射抵抗中所发挥的作用至今鲜有报道。已有文献报道miR-150促进一些肿瘤的发生发展。例如，miR-150通过靶向胃癌组织中促凋亡基因EGR2 发挥促癌作用[5]同时在一些上皮来源的恶性肿瘤中miR-150可靶向促凋亡的嘌呤能P2X7受体发挥癌基因作用。然而miR-150在鼻咽癌发生发展中的作用目前并不清楚。通过本次研究，我们通过MTS实验将miR-150抑制剂转染至鼻咽癌细胞5-8F细胞中，观察miR-150下调对细胞增殖能力的影响。结果发现转染miR-150抑制剂的5-8F细胞从48h起增殖速度明显减慢。我们的结果与文献报道的一致，即miR-150能促进鼻咽癌增殖和侵袭能力，很可能作为一个癌基因参与鼻咽癌的发生与进展。miR-150能正调控鼻咽癌增殖和侵袭能力，因而它有可能成为鼻咽癌治疗的潜在靶点。
【参考文献】
[1]Chen PS, Su JL, Hung MC.Dysregulation of MicroRNAs in cancer [J]. J Biomed Sci. 2012; 19(1):90.
[2]Liu J, Zheng M, Tang YL, et al. MicroRNAs, an active and versatile group in cancers[J].Int J Oral Sci, 2011, 3(4): 165-175.
[3]Davis-Dusenbery BN and Hata A: MicroRNA in Cancer: The Involvement of Aberrant MicroRNA Biogenesis Regulatory Pathways [J].Genes Cancer, 2010,1(11): 1100-1114.
[4]Zhang L, Deng T, Li X, et al. microRNA-141 is involved in a nasopharyngeal carcinoma-related genes network [J]. Carcinogenesis, 2010,31(4): 559-566.
[5]Wu Q,Jin H, Yang Z, et al. MiR-150 promotes gastric cancer proliferation by negatively regulating the pro-apoptotic gene EGR2 [J].Biochem Biophys Res Commun, 2010,392(3): 340-345.
基金资助：湖南省科技厅项目资助（2014SK3081）
论文作者:张先锋,肖娟,黄远见
论文发表刊物:《医药前沿》2016年2月第6期
论文发表时间:2016/5/23
标签：转染论文; 细胞论文; 抑制剂论文; 鼻咽癌论文; 基因论文; 浓度论文; 鼻咽论文; 《医药前沿》2016年2月第6期论文;