重组人ApoA-I基因转基因小鼠的研究

李汇华^[1]1998年在《人载脂蛋白AI转基因小鼠抗实验性动脉粥样硬化的分子病理学研究》文中指出人apo AI基因全长1863bp，含4个外显子，3个内含子，主要在肝和小肠中表达。成熟的apo AI是由243个氨基酸残基组成的单链多肽，分子量28 kD，血浆浓度100-150mg／dl。Apo AI是高密度脂蛋白(HDL)的主要蛋白成份，大量证据表明，apoAI可有效地激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)，在胆固醇逆转运(RCT)过程中起着重要的作用。 AS性疾病是当前人类的主要死因之一。大量流行病学调查证实，血浆apo AI和HDL水平与AS性心血管疾病的发生呈明显负相关。临床观察和动物实验也表明，apo AI具有抗AS作用。对此也有一些动物实验和临床报道的结论还不一致。仍需对apo AI基因表达与胆固醇转运和AS间的相互关系做进一步探讨。本实验应用重组人apo AI转基因小鼠，探讨人apo AI基因表达及对血浆HDL代谢和LCAT活性的影响，以进一步研究其抑制或延迟AS发生的分子机理。 一．表达重组人apo AI转基因C57BL／6小鼠系的建立 1．人apo AI基因整合：用本组已建立的人apo AI转基因C57BL／6首建

韦玉生^[2]2004年在《BAC介导ApoCⅢ增强子删除的人载脂蛋白apoAⅠ/CⅢ/AⅣ/AⅤ基因簇突变株转基因鼠系的建立以及其与完整基因簇转基因小鼠的比较研究》文中进行了进一步梳理迄今已知人载脂蛋白基因家族包括19个成员，主要基因分布在5条染色体上，其中apoAI、apoCIII、apoAIV和apoAV基因于11号染色体q23区约50kb的区域内形成一个基因簇，簇内apoCIII的转录方向与另3个基因相反。ApoAI簇基因表达呈现相对组织特异性：apoAI、apoCIII、apoAV基因以肝脏表达为主；apoAIV基因以小肠表达为主。apoCIII增强子作为基因簇的共调控元件调节apoAI、apoCIII和apoAIV的肝肠组织特异性表达。ApoAI簇基因成员均在脂类代谢系统中发挥重要作用，并通过多种不同机理参与动脉粥样硬化等复杂心血管疾病的发生、发展过程。简单归纳：基因簇中apoAI和apoAIV促进胆固醇的逆转运，与动脉粥样硬化的发生、发展关系密切；而另外两个成员apoCIII和apoAV强力调节机体甘油三酯水平，但发挥增高与降低的相反作用，它们与高甘油三酯血症密切相关并与动脉粥样硬化有联系。因此从整个基因簇水平研究簇内基因的表达调控机理和各基因在脂类代谢与动脉粥样硬化中的整体作用有重要意义。 转基因动物是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组中稳定整合并能遗传给后代的实验动物。利用转基因动物研究真核基因的表达调控既可以在分子水平上设计实验，又能包括基因表达的诸多影响因素，以调控系统的基本特征为线索，从四维时空观察转基因的整体效应。利用转基因动物技术可以建立人类疾病相关基因的转基因动物模型，以探讨异常基因的表达调控规律。大容量载体技术可以模拟机体天然染色质微环境，克服以往小片段重组体转基因实验中忽略基因间或调控元件之间相互作用的缺陷，从而可以研究大范围基因簇的表达调控规律。近年发展起来的细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)遗传特性稳定，不易发生缺失和重组；制备和纯化方法简便快速；可直接进行DNA测序分析；载体上的稀有限制性内切酶位点NotI可以方便地线性化BAC DNA并去除载体片段，这些优点使其被广

吕新跃^[3]1997年在《北京鸭载脂蛋白AI、树鼩载脂蛋白AI、CI三个cDNA的克隆、测序及组织分布》文中进行了进一步梳理载脂蛋白AI(apoAI)是血浆高密度脂蛋白(HDL)中的主要蛋白质，约占HDL蛋白组份的70％。流行病学调查显示：血浆中HDL和apoAI水平与冠心病的发病呈明显负相关。apoAI参与胆固醇逆向转运，在脂蛋白代谢及抗动脉粥样硬化(AS)方面发挥极其重要的作用。 北京鸭和树鼩(tree shrew，Ts)是王克勤等人在80年代发现的两种不易感AS动物模型，在国际上独具特色。北京鸭和TS血浆均富含HDL及apoAI，卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)的活性也明显高于人及其他哺乳类动物，胆固醇酯转移蛋白(CETP)的活性则明显降低。长期喂饲高脂饮食，也不易形成动脉粥样硬化斑块。与国外学者合作，已测定了北京鸭apoAI全部氨基酸序列，但其基因结构特别是决定血浆高水平apoAI的基因表达调控机制尚不清楚。获得两种不易感AS动物apoAI及其他apos的cDNA序列是进一步研究其载脂蛋白基因结构和表达调控机制的基础。 本论文旨在利用分子克隆技术，在国际上率先获得了北京鸭和TS两种不易感AS动物apoAI以及TS apoCI的cDNA序列，推译出它们的蛋白序列，并检测了上述apos在各组织的表达分布。 首先，应用超速离心、柱层析和电泳技术分离纯化了不易感AS动物北京鸭血清apoAI，并以纯化的鸭、TS apoAI为抗原，制备了兔抗鸭，兔抗Ts apoAI的多抗血清，其效价分别为1 X10~5、1 X10~(4-5)。Western blot显示这两种多

程爱娟^[4]2004年在《ApoAI基因多态性与血脂水平和冠心病关系的研究》文中认为目的：探讨冠心病患者载脂蛋白(apo)AI基因多态性及其对血脂的影响。方法：应用聚合酶链反应对196例正常人和240例冠心病患者apoAI基因多态性进行分析，扩增含apoAI基因启动子-75bp和第一内含子+83bp的DNA片段，以限制性内切酶MspI进行酶切，琼脂糖凝胶电泳分离基因多态性。结果：2组apoAI基因-75bp位点均为G／G基因型占优势，但冠心病组中A／A基因型显著低于对照组，两组间基因型比较p＜0.05，有显著性差异；但两组间-75bp位点A、G等位基因频率差异无统计学意义。在男性冠心病患者中，A／A基因型携带者血清高密度脂蛋白(HDL)水平显著低于G／G基因型携带者(p＜0.05)。两组间+83bp位点基因型与等位基因频率差别均无统计学意义。冠心病男性组内，+83bp位点T等位基因携带者HDL血浆水平显著低于C／C基因型携带者(0.74 vs 0.86)，两者间比较P＜0.05，有统计学意义。结论：apoAI基因启动子-75bp位点突变与中国人冠心病有一定关联。在冠心病男性患者中，A／A基因型及T等位基因携带者与血清HDL的降低有一定相关性。

田丽^[5]2007年在《载脂蛋白AI、AII、体重指数与血浆高密度脂蛋白亚类分布的关系》文中提出Ⅰ.载脂蛋白AI水平与HDL亚类分布关系的研究背景与目的：载脂蛋白AI是高密度脂蛋白(HDL)中主要的蛋白质，它是细胞胆固醇逆向转运(RCT)的特殊重要因素。ApoAI能与磷脂，多种血浆因子及细胞膜受体结合，可以激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)，起着促进细胞内胆固醇的移出，酯化，转移，以及调节HDL代谢的作用。本研究旨在探讨载脂蛋白水平主要是apoAI的水平对HDL亚类分布的影响。方法：采用双向电泳-免疫印迹检测法分析了545例受试者血浆HDL亚类的组成及含量。应用在受试人群呈正态分布的apoAI含量均值加或减一个标准差作为分割点将受试者分为3组即低apoAI组(apoAI≤1043．6mg/L)、中间apoAI组(1043．6＜apoAI＜1452．6mg/L)和高apoAI组(apoAI≥1452．6mg/L)。结果：1．与低apoAI水平组比较，中间及高apoAI水平组受试者所有HDL亚类的含量均逐渐显著的增加(p＜0．01～p＜0．001)。并且在高apoAI水平组，大颗粒的HDL_(2b)含量的增加较其小颗粒的preβ_1-HDL含量的增加更明显。2．当apoAI及HDL-C水平同时升高时，高apoAI-HDL-C组较低apoAI-HDL-C组，其HDL_(2b)的含量增加116％，而preβ_1-HDL含量却仅仅增加了26％。3．两两相关分析发现，apoAI水平与所有HDL亚类显著正相关，多元线性回归分析显示，apoAI水平为HDL亚类分布改变最有力的预测指标。结论：1．随血浆apoAI水平升高，所有HDL亚类，其含量都逐渐显著增加，尤其是大颗粒的HDL_(2b)最为明显。2．当apoAI及HDL-C水平同时增加时，HDL向大颗粒转变更加明显。表明HDL成熟代谢过程加强，胆固醇逆向转运作用增强。3．血浆apoAI水平是影响HDL亚类分布的的重要因素。Ⅱ．血浆apoAⅡ含量对于HDL亚类分布的影响背景与目的：载脂蛋白AⅡ(apoAⅡ)是HDL颗粒中第二种主要的载脂蛋白，约占HDL中蛋白质总量的20％；apoAⅡ除了作为HDL的结构成份之外，还具有抑制卵磷脂胆固醇酯酰基转移酶(LCAT)及激活肝酯酶(HL)的作用。但是，ApoAⅡ与HDL亚类分布关系的研究却鲜有报道。本研究探讨血浆apoAⅡ含量对HDL亚类分布的影响，并分析apoAⅠ、apoAⅡ含量同时增加时，HDL亚类组成、分布所发生的变化。方法：采用双向电泳-免疫印迹检测法分析了292例受试者血浆HDL亚类的组成及含量。应用在受试人群呈正态分布的apoAⅠ和或apoAⅡ含量均值加或减一个标准差作为分割点把受试者分为低apoAⅡ组(apoAⅡ≤232．4mg/L)、中间apoAⅡ组(232．4＜apoAⅡ＜331．2mg/L)、高apoAⅡ组(apoAⅡ≥331．2mg/L)以及低apoAⅠ-apoAⅡ组(apoAⅠ≤1024．2mg/L及apoAⅡ≤232．4mg/L)、中间apoAⅠ-apoAⅡ组(1024．2＜apoAⅠ＜1446．6mg/L及232．4＜apoAⅡ＜331．2mg/L)和高apoAⅠ-apoAⅡ组(apoAⅠ≥1446．6mg/L及apoAⅡ≥331．2mg/L)。结果：1．与低apoAⅡ组比较，高apoAⅡ组HDL_(3a)，HDL_(3b)，和HDL_(2b)的含量显著增加(p＜0．01，p＜0．01，p＜0．01)。2．当apoAⅠ及apoAⅡ水平同时增加时，所有HDL亚类的含量均逐渐显著升高。并且，高apoAⅠ-apoAⅡ组受试者HDL_(2b)的含量较低apoAⅠ-apoAⅡ组增加115％，preβ_1-HDL的含量仅增加了39％，HDL_(2b)含量增加更为明显。3．两两相关以及多元回归分析均显示，血浆apoAⅠ水平与所有HDL亚类呈显著正相关，然而血浆apoAⅡ水平则仅与HDL_3及HDL_2呈正相关。结论：1．血浆apoAⅡ含量增多不仅可以引起大颗粒的HDL_(2b)含量的增加，而且可以导致小颗粒的HDL_3积聚。提示apoAⅡ水平在HDL颗粒成熟代谢的过程中可能起着双重的作用。2．当apoAⅠ及apoAⅡ水平同时升高时，大颗粒HDL_(2b)的含量增加更为明显，表明HDL成熟代谢近一步增强。Ⅲ．肥胖患者血浆HDL亚类分布的研究背景与目的：肥胖者以血浆TG水平升高、HDL-C水平降低为特征，与AS和CHD的发生密切相关。研究发现新生缺脂的小颗粒preβ_1-HDL从外周摄取胆固醇并在各种血浆因子，如卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(LCAT)、胆固醇酯转运蛋白(CETP)、磷脂转运蛋白(PLTP)等的参与下，按preβ_1-HDL→preβ_2-HDL→preβ_3-HDL→HDL_3→HDL_2递变过程成熟，逐步转变为富含胆固醇酯的HDL_2从而被运至肝脏进一步降解。因此，HDL亚类组成、含量及分布变化与RCT有密切关系。本研究分析肥胖患者血浆HDL亚类的分布特征，为阐明HDL亚类组成、分布与肥胖人群As及CHD的发生机制提供新的依据。方法：采用双向电泳-免疫印迹检测法分析了581例中国人群血浆HDL亚类组成及含量。依据中国肥胖问题工作组推荐的体重指数(BMI)的标准，将受试者分为超轻组(BMI＜18．5kg/m~2)，合适组(BMI18．5-24kg/m~2)，超重组(24＜BMI≤28kg/m~2)以及肥胖组(BMI＞28kg/m~2)共四组。结果：1．与体重合适者比较，肥胖患者TG、preβ_1-HDL含量显著升高(p＜0．01，p＜0．01)，而HDL-C、HDL_(2a)、HDL_(2b)含量显著降低(p＜0．01，p＜0．05，p＜0．01)。2．随血清BMI的升高，preβ_1-HDL含量显著逐渐增加，而HDL_(2b)含量显著逐渐减少(p＜0．01，p＜0．01)。3．HDL颗粒变小的趋势在超重及肥胖患者中随着TG水平的升高更加明显。4．两两相关分析揭示，超重及肥胖患者血浆TG、BMI与preβ_1-HDL含量显著正相关(p＜0．01)，与HDL_(2b)含量显著负相关(p＜0．01)。5．多元线性回归分析发现，TG含量与高水平的preβ_1-HDL呈独立正相关而，与低水平的HDL_(2b)呈独立负相关。结论：超重者及肥胖患者血浆HDL颗粒呈变小趋势，而且这种趋势随血浆TG、BMI特别是TG水平升高更加明显。提示超重者及肥胖患者血浆HDL成熟代谢过程受阻，胆固醇逆向转运作用减弱。

余立清^[6]1995年在《重组人ApoA-I基因转基因小鼠的研究》文中研究表明ApoA—I是HDL的主要蛋白成份，参与胆固醇逆向转运。一些流行病学调查提示：血浆HDL—C和apoA—I水平与冠心病发病呈明显的负相关。哺乳类动物apoA—I主要在肝及小肠表达。人apoA—I mRNA长893nt，成熟编码产物是由243个氨基酸组成的单链多肽，分子量为28kD。基因全长1863bp，核苷酸序列早已清楚，有4个外显子和3个内含子，定位于11号染色体。 探索调节HDL水平的代谢基础，对理解AS易感性的遗传背景非常重要。作为HDL中的主要蛋白，apoA—I的合成和血浆HDL含量密切相关。但对这方面的研究还难以直接在人体内进行。转基因动物技术的出现改变了这一局面。利用这种技术，可将外源基因导入小鼠细胞的染色体基因组中，便于直接在体内分析一个基因的功能或多个基因的相互作用。国外一些实验室已成功地建立了人apoA—I转基因动物模型，并证明：apoA—I可选择性地升高HDL水平；参与HDL重构；有抗高脂饮食诱发AS的作用等。然而，已报道的人apoA—I转基因动物都是用天然人apoA—I基因制备的，表达部位限于自然表达组织，表达水平一般固定不变。本研究将人apoA—I基因置于小鼠MT—I基因启动子控制之下，用于制备转基因小鼠，旨在建立一种新的人apoA—I转基因小鼠模型。选择MT—I基因启动子是由于它可指导其所控制的基因在多种组织，如肝、肾、脑等中表达；用重金属离子和皮质激素诱导，能明显增加表达水平。这两种特性的导入，有利于研究异位表达和定时定量表达的影响；便于观察人apoA—I水平升高过程中伴随的脂蛋白系统的动态变化。

李汇华, 谷素敏, 佘铭鹏^[7]1998年在《转基因小鼠人载脂蛋白AI基因表达对血浆高密度脂蛋白的影响》文中研究表明目的研究载脂蛋白ＡＩ（ａｐｏＡＩ）基因表达调控对血浆高密度脂蛋白（ＨＤＬ）代谢的影响。方法采用已建立的含小鼠金属硫蛋白Ｉ（ＭＴ－Ｉ）启动子的人ａｐｏＡＩ转基因Ｃ５７ＢＬ／６小鼠系，通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术检测锌诱导前后人ａｐｏＡＩ基因整合和表达的情况。结果转基因小鼠整合４～１５拷贝的人ａｐｏＡＩ基因。人ａｐｏＡＩ基因主要在肝和肾中表达，经重金属锌诱导后，人ａｐｏＡＩ基因可在肝、小肠及肾中高效表达。转基因鼠血浆总ａｐｏＡＩ水平比对照组明显增高，其中人ａｐｏＡＩ水平经锌诱导后增高约４６％。与对照组相比，血浆ＨＤＬ水平在锌诱导前后分别增高约４７％和１０３％。转基因鼠ＨＤＬ和人ａｐｏＡＩ水平间呈显著正相关（ｒ＝０．８５，Ｐ＜０．０１）。结论ＡｐｏＡＩ对血浆ＨＤＬ水平升高有重要的调节作用，该转基因鼠是进一步研究ａｐｏＡＩ在高脂血症时对脂质代谢的影响和抗动脉粥样硬化（ＡＳ）作用机制的理想动物模型

崔丽^[8]2009年在《雌激素对载脂蛋白A Ⅰ体外表达作用的研究》文中指出目的:观察雌激素对载脂蛋白AⅠ(Apo AⅠ)基因转录的影响;探讨Apo AⅠ基因启动子不同区域及ApoCⅢ/AⅣ基因调控元件在Apo AⅠ基因转录调控中的作用,分析雌激素刺激对apoAⅠ基因表达的调节机制。方法:1.分别将0.01、0.1、1、10、20μmol/L雌激素与体外培养的HepG2细胞共同孵育24h;选用10μmol/L的雌激素与HepG2细胞共同孵育0h、1h、6h、24h、48h;分别提取总RNA,采用半定量RT-PCR方法测定Apo AⅠmRNA表达水平,观察不同剂量雌激素和不同刺激时间对Apo AⅠmRNA表达的影响。2.以携带萤火虫荧光素酶报告基因的质粒pGL_2为载体,构建携带ApoAI基因启动子不同长度片段的重组质粒pGL_2/-41AⅠ、pGL_2/-256AⅠ和pGL_2/-2500AⅠ,以及同时携带ApoCⅢ/AⅣ基因的重组质粒:pGL_2/-41AⅠCⅢAⅣ、pGL_2/-256AⅠCⅢAⅣ、pGL_2/-2500AⅠCⅢAⅣ;采用阳离子脂质体法分别将重组质粒与携带海肾荧光素酶报告基因的pRL-null质粒内参进行双质粒共转染,并在HepG_2细胞中表达;转染24小时后给予10μmol/L雌激素刺激,48小时后收集、裂解细胞,应用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶报告基因的荧光强度。结果:1.在体外培养的HepG_2细胞中,随雌激素浓度的增加,Apo AⅠmRNA表达呈现先升高后降低的趋势,以非生理剂量10μmol/L时Apo AⅠmRNA表达最高,与空白对照组及生理剂量浓度组(0.01、0.1、1μmol/L)相比有明显差异(P<0.05),20μmol/L时Apo AⅠmRNA表达降低,低于10μmol/L时,但仍高于空白对照及生理剂量组。2.随加入雌激素刺激时间的延长,HepG_2细胞中Apo AⅠmRNA表达呈现先升高后降低的趋势,雌激素刺激6h后ApoAⅠmRNA表达水平增加,与0h、1h表达水平相比差异有统计学意义(P<0.05);刺激24h后Apo AⅠmRNA表达水平最高(P<0.05),48h后Apo AⅠmRNA表达水平下降,与24h相比差异有统计学意义。3.包含ApoAI基因启动子-256bp～+397bp和-2500bp～+397bp片段的重组质粒转染HepG_2细胞后表达的荧光素酶的相对活性明显高于只含有-41bp～+397bp片断的重组质粒;同时携带ApoCⅢ/AⅣ基因片段的重组质粒亦显示相似的结果。4.同时携带ApoCⅢ/AⅣ基因和ApoAⅠ基因启动子不同长度片段的重组质粒转染HepG_2细胞后表达的荧光素酶的相对活性明显高于只连接Apo AⅠ不同启动子区域的重组质粒pGL_2/AⅠ,差异有统计学意义(P<0.05)。5.重组质粒pGL_2/-256AⅠ及pGL_2/-2500AⅠ及pGL_2/-256AⅠCⅢAⅣ及pGL_2/-2500AⅠCⅢAⅣ转染的HepG_2细胞其表达的荧光素酶的相对活性雌激素组明显高于对照组(P<0.05),而pGL_2/-41AⅠ及pGL_2/-41AⅠCⅢAⅣ质粒转染后表达的荧光素酶相对活性在雌激素刺激前后差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.随雌激素浓度的增加,体外培养的HepG_2细胞中Apo AⅠmRNA表达呈现升高趋势,以浓度为10μmol/L时表达水平最高;以该浓度刺激6h后表达水平开始增加,24h达高峰,本研究显示雌激素可在转录水平调节Apo AⅠ基因表达,并呈现部分的剂量和时间依赖性。2.Apo AⅠ基因转录起始点上游-256bp区域至上游-41bp区域,具有较强启动子转录活性,可能与该区域内含有肝特异性增强子有关。含有-2500bp～+397bp片段与-256bp～+397bp片段相比,荧光强度虽有增强,但无统计学意义,显示Apo AⅠ基因启动子-256bp上游区域可能缺乏调控的顺式作用元件。同时携带ApoCⅢ/AⅣ基因的重组质粒的荧光强度明显高于只含有Apo AⅠ基因片段的重组质粒,表明Apo CⅢ/AⅣ基因调控区内存在调节Apo AⅠ基因转录增强的作用元件。3.转录起始点至上游-41bp区域的Apo AⅠ启动子对雌激素无明显反应,包含-256bp区域的Apo AⅠ启动子受雌激素刺激转录活性增强,此区域可能是最小雌激素反应元件,ApoCⅢ/AⅣ基因调控区不受雌激素作用的影响。

栗炳南^[9]2011年在《rAAV_2同时介导apoAI与SR-BI双基因对动脉硬化治疗作用的研究》文中认为目的：动脉粥样硬化(AS)所致的心脑血管性疾病是当今严重危害人类生命健康的疾病之一,其发病率和死亡率均居各种疾病之首。但是,动脉粥样硬化的病因尚未完全清楚,治疗效果还不十分满意,因此探讨动脉粥样硬化的发生机制和寻找更加有效的治疗方法具有十分重要的意义。本课题拟通过重组腺相关病毒(rAAV)同时介导人载脂蛋白AI与人B族Ⅰ型清道夫受体双基因对大鼠动脉粥样硬化模型鼠治疗作用的研究,对比双基因联合后的治疗效果及是否优越于单独一个基因。方法和结果：1.获取携带apoAI与SR-BI双基因的重组腺相关病毒载体。本研究首先从正常流产胎儿(经产妇本人及家属同意)肝脏组织中提取总RNA,通过逆转录获得全长cDNA,然后根据序列设计特异性引物从胎肝cDNA中扩增出约804bp的apoAI序列与约1530bp的SR-BI序列,同时以pAAV2-IRES-hrGFP质粒为模板,通过特异性引物扩增出670bp的IRES序列。通过预先设计的酶切位点,将apoA工连入pAAV2-IRES-hrGFP的多克隆位点,将IRES-SR-BI序列融合后替换掉质粒载体pAAV2-apoAI-IRES-hrGFP的IRES-hrGFP序列,构建出重组腺相关病毒载体pAAV2-apoAI-IRES-SR-BI.然后采用磷酸钙共沉淀法将三质粒pAAV2-apoAI/SR-BI,pAAV2-RC,pHelper共转染HEK293细胞,包装同时含有人apoAI/SR-BI双基因的rAAV2-apoAI/SR-BI,并以pAAV2-apoAI-IRES-hrGFP质粒作为荧光对照,通过“硫酸肝素法”纯化获得rAAV2-apoAI/SR-BI与rAAV2-apoAI/IRES-hrGFP,经western-blotting和dot-blot斑点杂交检测,结果获得了较高纯度的rAAV2-apoAI/SR—BI与rAAV2-apoAI-IRES-hrGFP,两者的滴度分别为：1.2376×1011v.g/ml与6.716×1010v.g/ml。2. rAAV2-apoAI-IRES-SR-BI在HepG2 cells中的表达及对胆固醇逆向转运功能的影响。将包装纯化后的rAAV2-apoAI-IRES-GFP以不同的物理滴度体外转染HepG2 cells并于72小时后进行荧光观察,以检测病毒的活力及确定其转染效率,探索最佳转染体系。结果显示：rAAV2-apoAI-IRES-hrGFP的转染效率随病毒滴度的增高而增加,约在100MOI时达到了平台期,即获得了较好的转染效率.然而在预实验中发现50MOI与100MOI的转染效率相差并不明显,为了节约病毒用量,即分别将rAAV2-IRES-hrGFP, rAAV2-apoAI-IRES-hrGFP, rAAV2-apoAI/SR-BI三种病毒载体分别以50MOI的滴度对HepG2细胞进行转染,并设立未转染的空白对照组,于72小时内进行连续荧光观察,确定转染成功且效率达到预期标准后立即进行细胞总RNA及总蛋白提取并以β-actin为内参应用RT-PCR和western-blotting技术对转染后目的基因的mRNA和蛋白水平的表达进行半定量研究。结果显示：apoAI mRNA和蛋白质水平在rAAV2-apoAI, rAAV2-apoAI/SR-BI均得到了上调表达,SR-BI mRNA和蛋白质水平在rAAV2-apoAI/SR-BI组得到了表达。与上述体系相同,HepG2细胞于病毒转染48h后,移去上清,并加入含有ox-LDL(50μg/ml)的无血清DMEM进行共孵育培养,培养24小时后移除细胞上清液,用PBS轻轻冲洗一遍后,利用细胞裂解液收集细胞。采用HPLC胆固醇酶结合法检测各组细胞内胆固醇的含量。HPLC检测处理后各组胞内胆固醇含量可知：与其他各组相比,经过rAAV2-apoAI,rAAV2-apoAI/SR-BI处理后的HepG2细胞胞内总胆固醇含量是降低的,其中rAAV2-apoAI/SR-BI病毒转染组胞内胆固醇含量较rAAV2-apoAI-IRES-hrGFP更低；与rAAV2-GFP组和空白对照组相比,CE/TC的比值在rAAV2-apoAI组和rAAV2-apoAI/SR-BI转染组中较高。3.动脉硬化大鼠动物模型的建立,并在随机分组后分别尾静脉注射rAAV2-GFP,rAAV2-apoAI,rAAV2-apoAI/SR-BI观察其对动脉粥样硬化大鼠的治疗作用。将32只雄性大白鼠随机分为四组每组8只,其中一组为正常饮食组,另外3组为高脂饮食组,建模前测量血脂一次,并于高脂饮食3个月后分别进行血脂和B超检测,观察模型建立是否成功。取对照组大鼠和高脂组大鼠进行主动脉超声检测观察血管内膜的改变及是否出现动脉粥样硬化斑块。结果显示,对照组主动脉内膜光滑,管壁无隆起、增厚、无斑块形成,与中膜层分界清楚。所有的动脉硬化鼠均可见不同程度的动脉硬化超声改变,分别为：主动脉管壁中膜偏心性增厚,内膜不光滑,连续性中断,可见较小斑块形成,内中膜与血管外膜及周围的结缔组织分界不清。各组在动脉硬化模型建立后(3个月)血清TC与LDL-C的测定。高脂饮食后3个月与同时期正常饮食组)相比*p<0.01。确定动脉粥样硬化模型建立成功后,根据体重将模型鼠再次进行随机分组,分为三组后,分别将rAAV2-IRES-hrGFP, rAAV2-apoAI-IRES-hrGFP,rAAV2-apoAI-IRES-SR-BI三种病毒载体以1×1010v.g./ml PBS的量进行模型鼠的尾静脉注射,正常饮食组作为正常对照组尾静脉注射1 m1 PBS,为了更好的模拟临床用药特点,各组于病毒注射后均做了一定的改善饮食的处理,并于治疗后2个月检测目的基因在模型鼠体内的表达,其中两个目的基因的检测引物与载体构建时引物相同。采用与ELASA和Western-Blotting检测目的蛋白的表达,并统计各组模型鼠的血脂与B超的检测结果,对比各治疗组的治疗效果；冰冻切片后在荧光显微镜下观察荧光蛋白GFP在肝脏与动脉管壁的表达情况；应用ELASA的方法检测各组大鼠血清中hs-CRP的含量,以预测各组大鼠发生心脑血管疾病的风险系数；应用MDA,SOD检测试剂盒检测血清中其含量,借以反应各组大鼠体内的抗氧化能力；以β-actin为内参,应用RT-PCR的方法检测各处理组动脉管壁中的NF-κBp65,IKBα,VCAM一1,ICAM-1,IL-1β,MCP-1mRNA的表达,以推测各组炎症因子的表达与NF-K B活化程度之间的关系；通过检测各处理组MMP-2和MMP一9 mRNA的表达,研究基因治疗后各组的动脉壁斑块稳定性的大小；检测各处理组动脉壁eNOS mRNA水平的表达,反应其分泌NO的能力借以反应对内皮细胞的修复和保护功能。结果表明：rAAV2-apoAI-IRES-hrGFP组及rAAV2-apoAI/SR-BI组的TC及LDL-C水平较AAV2-GFP处理组有明显下降；主动脉彩色多普勒超声可以检测到rAAV2-apoAI组及rAAV2-apoAI/SR-BI组动脉粥样硬化斑块明显减少,而后者效果更明显；冰冻切片在荧光显微镜下可以观察到在rAAV2-GFP组与rAAV2-apoAI组的主动脉管壁和肝脏上均有荧光的表达；应用RT-PCR的方法,在rAAV2-apoAI与rAAV2-apoAI/SR-BI组的肝脏与动脉管壁中都检测到目的基因的表达,采用ELASA的方法检测到rAAV2-apoAI与rAAV2-apoAI/SR-BI组的大鼠血清中有人apoAI的表达；利用western-blotting技术在rAAV2-apoAI/SR-BI组的大鼠肝脏中检测到人SR-BI目的基因的表达；应用南京建成的MDA.SOD检测试剂盒检测各组大鼠血清中其含量,结果显示基因治疗后各组氧化程度均较rAAV2-GFP处理组有明显减轻(P<0.01),且rAAV2-apoAI/SR-BI治疗组效果优于rAAV2-apoAI治疗组；同时以β-actin为内参的RT-PCR检测与动脉硬化相关基因的表达结果显示,与病理对照组相比各治疗组中NF-KBp65、ICAM-1 VCAM-1、IL-1β、MCP-1、MMP-2、MMP-9、mRNA的表达明显降低；而与之相反,1KBα, eNOS治疗后的mRNA水平表达升高.通过此次检测结果我们设想apoAI与SR-BI双基因可能是通过抑制NF-KB途径的活化来发挥抑制炎症因子表达、增加斑块的稳定性以及增加NO释放作用的,从而对动脉粥样硬化起到一定的治疗作用,当然这种设想还有待于后续实验的进一步验证。结论：本研究成功完成了同时携带有apoAI与SR-BI双基因的重组腺相关病毒载体的构建；通过HPLC胆固醇酶结合法检测胞内胆固醇含量发现目的基因在HepG2细胞中高表达可以减少胞内胆固醇的净含量,并且rAAV2-apoAI/SR-BI组作用效果强于rAAV2-apoAI组；成功建立了动脉粥样硬化的SD大鼠模型；进一步的体内实验结果研究表明rAAV2-apoAI与rAAV2-apoAI/SR-BI均对动脉粥样硬化大鼠产生了一定的治疗效果,而且rAAV2-apoAI/SR-BI的治疗效果更为明显。

张麟^[10]2009年在《汉族人载脂蛋白AII基因-265T/C多态性与2型糖尿病合并冠心病的相关性研究》文中认为[研究背景]载脂蛋白AII(apolipoprotein AII,apoAII)是人高密度脂蛋白(high densitylipoprotein,HDL)颗粒的一种主要的载脂蛋白,其在机体内的生理生化功能尚未完全明了。因为缺乏对apoAII缺陷的大样本人群研究,长期被认为是载脂蛋白中不重要的组分。近年来,随着apoAII编码基因(APOAII)的表达调控及多态性研究深入,以及各种临床和动物实验结果显示,APOAII在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)、高脂血症发生、发展及防治方面的重要性越来越受到研究者的关注。但是有关APOAII基因多态性与冠心病风险的关系不同的研究有许多矛盾之处。对不同人群的多个基因研究也发现APOAII基因多态性与2型糖尿病相关,也使得APOAII成为研究该病的热门基因。[研究目的]本研究旨在探讨我国北方地区汉族人APOAII-265T/C多态性对脂代谢、糖代谢的影响,及其与冠心病、糖尿病和糖尿病合并冠心病的关系,为动脉粥样硬化性心血管病的防治提供科学依据。[对象与方法]研究对象均为我国北方地区汉族人群,包括155例健康人对照组、101例2型糖尿病患者(DM组)、91例冠心病患者(CHD组)和78例糖尿病合并冠心病的患者(DM+CHD组)。采用改良碘化钠(NaI)法提取基因组DNA,聚合酶链反应限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment lengthpolymorphism,PCR-RFLP)法分析APOAII-265T/C多态性。高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low densitylipoprotein cholesterol,LDL-C)采用直接匀相法测定;血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)采用酶法测定;血糖(blood glucose,GLU)采用己糖激酶法测定;糖化血红蛋白(hemoglobin A1c,HbA1c)采用低压层析法测定。Excel2003和SPSS11.5统计软件进行统计学分析。[研究结果]1.糖尿病组、冠心病组及糖尿病合并冠心病组BMI、HbA1c、血清TG和GLU均明显高于对照组,而HDL-C水平低于对照组,结果差异均具有统计学意义(P＜0.05)。2.我国北方地区汉族人群APOAII-265T/C多态性等位基因频率C、T分别为0.229和0.771。C等位基因的频率分布均低于澳大利亚、西班牙以及美国白种人,而与美国黑人接近。3.对照组、DM组、CHD组和DM+CHD组的APOAII-265T/C多态性的基因型频率分布与性别、高血压家族史和体重指数等无明显相关。4.APOAII-265T/C多态性与HDL-C及血清TG和HbA1c水平无明显相关。5.正常对照组APOAII-265T/C多态性TT、TC、CC基因型频率分别为68.4%、21.3%和10.3%;糖尿病组分别为64.4%、20.8%和14.8%;冠心病组分别为62.6%、26.4%和11.0%;糖尿病合并冠心病组分别为65.4%、24.4%和10.2%。四组的TT、TC、CC基因型频率分布均无差异。不同组APOAII-265T/C多态性等位基因频率分布也无差异。6.不论C等位基因携带者还是TT基因型,DM组、CHD组、DM+CHD组的TG、GLU、HbA1c均高于对照组,而HDL-C均低于对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05),而T基因型和C等位基因之间各指标比较无显著统计学意义(P＞0.05)。7.Logistic回归分析显示,BMI、血糖和HbA1c是糖尿病发生的独立危险因素(OR值分别为2.290、15.583和17.965);而年龄、BMI、血糖、TG是冠心病发生的独立危险因素(OR值分别为8.781、0.566、0.240、2.057),同时HDL-C是冠心病发生独立保护性因素(β=-1.462,OR=4.315,95%CI=2.678-6.953,P＜0.001)。在对糖尿病合并冠心病的Logistic回归分析中也发现相似的结果:年龄、HbA1c是糖尿病合并冠心病发生的独立危险因素(OR值分别为2.788、1.931),而HDL-C是糖尿病合并冠心病发生的独立保护因素(β=-0.646,OR=1.907,95%CI=1.175-3.097,P=0.009)。而本研究发现APOAII-265C等位基因不是糖尿病、冠心病和糖尿病合并冠心病发生的独立危险因素。[结论]本研究建立了碘化钠(NaI)法快速提取基因组DNA,PCR-RFLP法分析APOAII-265T/C基因多态性的方法。该方法简便快捷,易于操作,非常适合大规模流行病学调查和临床实验室采用。不同研究对象之间APOAII-265T/C多态性的基因型与等位基因频率分布无差异。BMI、血糖和HbA1c是糖尿病发生的独立危险因素;而年龄、BMI、血糖、TG是冠心病发生的独立危险因素。年龄、HbA1c则是糖尿病合并冠心病发生的独立危险因素。且HDL-C是冠心病以及糖尿病合并冠心病发生的独立保护性因素。而本研究未发现APOAII-265T/C多态性与血清HDL-C、TG和HbA1c水平之间存在明显相关性。该位点多态性的改变亦不是糖尿病、冠心病和糖尿病合并冠心病发生的独立危险因素。

参考文献：

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[2]. BAC介导ApoCⅢ增强子删除的人载脂蛋白apoAⅠ/CⅢ/AⅣ/AⅤ基因簇突变株转基因鼠系的建立以及其与完整基因簇转基因小鼠的比较研究[D]. 韦玉生. 中国协和医科大学. 2004

[3]. 北京鸭载脂蛋白AI、树鼩载脂蛋白AI、CI三个cDNA的克隆、测序及组织分布[D]. 吕新跃. 中国协和医科大学. 1997

[4]. ApoAI基因多态性与血脂水平和冠心病关系的研究[D]. 程爱娟. 天津医科大学. 2004

[5]. 载脂蛋白AI、AII、体重指数与血浆高密度脂蛋白亚类分布的关系[D]. 田丽. 四川大学. 2007

[6]. 重组人ApoA-I基因转基因小鼠的研究[D]. 余立清. 中国协和医科大学. 1995

[7]. 转基因小鼠人载脂蛋白AI基因表达对血浆高密度脂蛋白的影响[J]. 李汇华, 谷素敏, 佘铭鹏. 中华医学杂志. 1998

[8]. 雌激素对载脂蛋白A Ⅰ体外表达作用的研究[D]. 崔丽. 天津医科大学. 2009

[9]. rAAV_2同时介导apoAI与SR-BI双基因对动脉硬化治疗作用的研究[D]. 栗炳南. 中南大学. 2011

[10]. 汉族人载脂蛋白AII基因-265T/C多态性与2型糖尿病合并冠心病的相关性研究[D]. 张麟. 中国协和医科大学. 2009

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