楚冰[1]2001年在《大鼠局灶性脑缺血后远隔区域损伤及药物干预的研究》文中研究表明1．目的 观察大鼠一侧大脑中动脉闭塞（MCAO）后急性期两侧额叶、丘脑、小脑、下丘脑rCBF的动态变化及额叶、丘脑、小脑细胞形态学变化；评估川芎嗪对上述变化的干预作用，为临床脑局灶损伤后远隔效应的防治提供理论依据。2．方法 采用线栓法建立大鼠一侧大脑中动脉闭塞模型，按实验需要将实验动物分成正常、单纯缺血和缺血后川芎嗪干预叁组；用氢清除法测定两侧额叶、丘脑、小脑、下丘脑在MCAO后1h、3h、6h、24h rCBF；用HE染色和TUNEL法观察两侧额叶、丘脑、小脑MCAO后6h、24h、1w细胞形态学变化。3．结果 （1）正常对照组各相应部位rCBF无显着差异（p＞0.05）；一侧MCAO后，两侧额叶皮层、丘脑、下丘脑、对侧小脑半球rCBF下降，MCAO后1h达最低水平（p＜0.05或p＜0.01），随时间延长，rCBF逐渐增加，除对侧小脑、下丘脑外，其余部位rCBF至MCAO后24h基本恢复正常；同侧额叶、丘脑MCAO后6h开始出现TUNEL阳性细胞，24h后明显增加，至1周阳性细胞减少（p＜0.05）。 （2）川芎嗪干预组，两侧额叶、丘脑、下丘脑、对侧小脑半球rCBF较未用药组明显增加（p＜0.05）；同侧额叶、丘脑凋亡阳性细胞数在用药组明显减少（p＜0.05）。4．结论 线栓法建立鼠一侧MCAO模型，可引起两侧额叶、丘脑、下丘脑、对侧小脑rCBF序列性变化；同侧额叶、丘脑凋亡阳性细胞增加；川芎嗪可增加MCAO后远隔部位的rCBF，减少细胞凋亡。本实验为川芎嗪治疗临床脑缺血后远隔损伤提供了理论依据。
邵国富, 楚冰, 包仕尧, 周旭平[2]2002年在《大鼠局灶性脑缺血后远隔区域脑损伤及药物干预的研究》文中研究说明目的 观察大鼠局灶性脑缺血后急性期两侧额叶、丘脑、小脑、下丘脑局部脑血流量 (rCBF)和细胞形态学的变化 ;评估川芎嗪对上述变化的干预作用。方法 采用线栓法建立大鼠一侧大脑中动脉闭塞 (middlecerebralarteryocclusion ,MCAO)模型 ;用氢清除法测定两侧额叶、丘脑、小脑、下丘脑在MCAO后 1、3、6和 2 4h的rCBF ;用HE染色和TUNEL法观察两侧额叶、丘脑、小脑MCAO后 6h、2 4h、1周细胞形态学变化。结果 正常对照组各相应部位rCBF无显着差异 (P >0 0 5 ) ;一侧MCAO后 ,两侧额叶皮层、丘脑、下丘脑、对侧小脑半球rCBF下降 ,MCAO后 1h达最低水平 (P <0 0 5或 P <0 0 1) ,随时间延长 ,rCBF逐渐增加 ,除对侧小脑、下丘脑外 ,其余部位rCBF至MCAO后 2 4h基本恢复正常 ;而川芎嗪可明显抑制上述rCBF的下降程度 (P <0 0 5 )。同侧额叶、丘脑在MCAO后 6h开始出现TUNEL阳性细胞 ,2 4h后明显增加 ,至 1周阳性细胞减少 (P <0 0 5 ) ,而川芎嗪可明显抑制上述部位凋亡细胞的产生。结论 局灶性脑缺血后可引起远隔区域有关脑组织rCBF下降 ,并进一步引发细胞凋亡。中药川芎嗪可明显抑制上述变化
段周芳[3]2011年在《EGb761对脑缺血再灌注后大鼠中脑胶质细胞和多巴胺神经元的影响》文中认为背景和目的缺血性脑血管病是严重危害人类健康的常见病、多发病之一,具有高发病率、高致残率、高致死率的特点。目前关于缺血性脑血管病的研究主要集中在缺血梗死灶的局部,而对与缺血梗死相关联的脑组织、细胞的损伤研究较少。近年来,有研究表明,脑梗死治疗效果差的原因不仅与梗死灶局部神经元死亡密切相关,与远隔部位损伤也有着不容忽视的作用,且可能影响脑梗死的预后。胶质源性纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)是星形胶质细胞的一种主要中间纤维蛋白,被作为星形胶质细胞成熟活化的标志蛋白,其表达数目增加一定程度上反映了脑组织受损的程度。酪氨酸羟化酶(Tyrosine of enzyme, TH)在中脑的黑质致密部分布密度最高,被用来标志脑内多巴胺能神经元,TH活性的下降,DA合成减少,进而DA能神经元细胞变性、坏死,还增加细胞外源性毒物的敏感性,加重脑组织损害。因此,黑质内TH阳性细胞计数可以间接反映DA能神经元功能的变化。标准银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract, EGb761),主要含24%的银杏黄酮苷(flavonoid)和6%的萜烯内酯(terpenoid)等多种活性物质。EGb761在脑缺血时对神经元保护作用的研究较多,而其对神经胶质细胞抗缺血损伤作用的研究却很少受到关注,其对远隔部位损伤方面的保护作用及其机制尚不清楚。本研究通过建立大鼠大脑中动脉内栓线阻断法(MCAO)脑梗死模型,探讨急性脑缺血再灌注后大鼠中脑黑质部位星形胶质细胞、多巴胺能神经元、细胞凋亡的变化及EGb761的干预作用,为临床治疗提供理论依据。材料与方法1实验动物与分组：清洁级健康雄性SD大鼠54只,体重220±30g,随机分为叁组：假手术组,模型组,EGb761干预组,每组18只,每组再分为叁个不同时间点1天、3天、7天,每个时间点6只大鼠。2模型的制作：参照Longa的大鼠大脑中动脉内栓线阻断法(MCAO)适当改良后进行。建立大脑中动脉缺血再灌注模型,假手术组除不插线外,余步骤同其它两组。术后观察同侧Homer氏征及对侧肢体瘫痪体征来判断模型是否成功。3动物给药方法：将标准银杏叶提取物(EGb761)金纳多片研成粉末状,用蒸馏水溶解并混匀配成浓度为5mg/ml的溶液,术后24小时按照0.5m1/100g灌胃,假手术组和模型组给予等量生理盐水灌胃。各组灌胃均每日一次,直至处死。4标本的收集与处理：模型制作成功后大鼠分别于1d、3d、7d时,10%水合氯醛(2.5ml/kg)麻醉下,心脏灌注,断头取脑,固定后制作石蜡切片,供HE染色、免疫组化染色、TUNEL检测用。5观察指标：(1)HE染色观察脑组织病理变化；(2)免疫组化染色检测大鼠脑组织梗死后中脑黑质部位GFAP、TH免疫染色阳性细胞数的表达情况；(3)TUNEL检测细胞凋亡情况。6统计方法：实验数据用均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS16.0统计软件进行统计分析。以α=0.05作为显着性检验水准。结果1 HE染色：假手术组中脑黑质细胞结构紧密,层次清晰,神经元偶见变性、坏死,大部分细胞形态正常未见明显的病理变化；模型组细胞排列稀疏,结构紊乱,神经元数目明显减少,可见大量变性、坏死的神经元,可见胞核皱缩、碎片出现,细胞周围有间隙,空泡变性；EGb761干预组神经细胞的结构破坏及神经元变性、坏死较模型组明显减轻。2GFAP免疫组化染色：各组取同侧黑质部位进行观察,计数GFAP免疫染色阳性细胞个数进行统计分析。假手术组GFAP阳性细胞数有少量表达,各组间差别无显着意义。1d、3d、7d时GFAP阳性细胞表达,模型组分别为12.17±2.04；19.00±1.78、25.33±2.12；干预组：10.00±1.41、14.33±2.73、17.16±1.47。模型组各时间点GFAP阳性细胞数均明显多于假手术组和干预组,7d时阳性细胞数较1d、3d多,差异均具有统计学意义(P<0.01)。3细胞凋亡的检测：TUNEL检测细胞凋亡阳性数目,假手术组各时间点未见阳性细胞。1d、3d、7d时阳性细胞数,模型组：12.23±4.97、39.40±6.94、26.18±6.53；干预组：7.31±1.92、20.26±4.61、12.23±3.70。模型组和干预组均有大量凋亡阳性细胞,且均3d时最多,干预组较模型组明显减少,差别有统计学意义(P<0.01)。4 TH免疫组化：TH为胞质和胞膜着色,阳性细胞显示深棕黄色或深褐色。1d、3d、7d时各组阳性细胞数分别为：假手术组23.39±1.14、24.87±1.98、23.79±2.23；模型组11.67±1.36、8.87±2.43、6.15±1.09；干预组18.68±1.29、14.38±0.71、10.17±1.82。与假手术组比较,缺血再灌注后各时间点,中脑黑质TH阳性细胞表达减少,差别有统计学意义(P<0.05),干预组明显多于模型组,差别显着(P<0.05)。结论1脑缺血再灌注后梗死灶远隔部位存在胶质细胞过度活化、DA能神经元减少及细胞凋亡。2 EGb761可通过抑制脑缺血再灌注后远隔损伤部位星形胶质细胞的过度活化,减少细胞凋亡。3 EGb761对急性脑缺血再灌注后远隔部位的多巴胺神经元、神经胶质细胞有保护作用。
秦文熠[4]2013年在《电针及NBD多肽抑制局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质及海马CA1区炎症反应及其机制的研究》文中进行了进一步梳理背景：缺血性脑血管病属一类严重危害人类健康和严重影响生活质量的神经系统危、急、重症。其中，局灶脑缺血/再灌注是主要的发病类型，具有“高发病率、高致残率及高死亡率”的特点。局灶脑缺血/再灌注后会产生一系列复杂的病理变化过程，其缺血缺氧损害影响脑内较广的范围，不仅仅局限于缺血病灶局部及灶周组织，其远隔损害也可破坏脑内其他重要的功能结构，如海马、黑质等。研究证实，大脑重要组织结构中以大脑皮质及海马结构是对缺血缺氧损害较为敏感的区域。海马的CA1区是其重要的功能结构，是对短暂性脑缺血最为敏感的区域。对于大脑中动脉梗塞/再灌注引起的病理损害，非缺血缺氧局部的海马仍受其损伤而引起相应的病理变化即为脑缺血/再灌注后产生的远隔损害。而在远隔损害的病理机制中，炎症反应起着非常重要的作用，即局灶脑缺血/再灌注后诱发的炎症反应，对非缺血病灶内的海马同样产生严重的病理损害，是对海马区域的远隔炎性效应。在局灶脑缺血/再灌注发生的起始阶段，各种复杂的病理过程共同作用于机体，导致脑功能受到严重的损伤。在其复杂的病理损伤机制中炎症反应是极其重要的组成部分，不仅参与局部缺血灶内的病理损伤，同时也会引起非缺血区内海马部位的远隔损伤效应。在大量实验性脑缺血/再灌注动物模型中发现，脑缺血缺氧损伤后缺血病灶局部及灶周等均有炎性细胞因子的表达和炎性细胞的浸润，说明脑内炎症反应被激活，加重机体组织的损伤，促进继发性脑损害发生，成为局灶脑缺血/再灌注损伤的主要过程之一。核因子-κB（Nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路为炎症反应病理环节中主要的组成部分，属于调节炎症反应的关键节点，且活化的NF-κB可单独或协同其他与炎症相关的转录因子共同作用参与多种炎症介质基因的诱导表达。由于NF-κB信号通路能启动下游多个炎症介质，具有级联放大的特点，因此NF-κB信号通路应视为炎症反应调控的中心和关键起始步骤。同时，NF-κB信号通路本身就是一个复杂的细胞转导通路，由多个起关键作用的重要蛋白相互作用、相互协同激活或抑制NF-κB信号通路，调节其在生理病理状态下的反应平衡。在NF-κB信号通路中，由发挥最重要且最基本作用的抑制蛋白IκB家族及激活蛋白IKKs家族共同调节NF-κB信号通路的活性。因此，以抑制NF-κB信号通路过度激活为主要靶向，调节抑制蛋白与激活蛋白之间的平衡为有效抑制局灶脑缺血/再灌注炎症反应的损害的关键节点。在调节NF-κB信号通路的多种干预手段中，电针是目前较为常用的“非药物”治疗手段，正被越来越多地运用于脑血管病的临床治疗与基础研究中。同时，电针在局灶脑缺血/再灌注后的抗炎作用也在大量研究中得到证实。但电针的抗炎作用机制中是否通过干预NF-κB信号通路而发挥作用仍未有较深入的研究。同时，作为NF-κB信号通路的特异性抑制多肽（nemo binding domain, NBD）NBD多肽，针对局灶脑缺血/再灌注后的抗炎干预作用的研究也未有更深入的报道。目的：观察局灶脑缺血/再灌注后炎症反应的激活变化及探讨电针与NF-κB特异性抑制剂NBD多肽对于NF-κB信号通路中关键蛋白活性的调节作用及其主要的作用靶点，以探索电针及NBD多肽调节信号通路激活作用的可能机制；将电针干预NF-κB信号通路激活的作用机制与NBD多肽的作用机制作对照，以深入探讨电针调节NF-κB信号通路的激活或抑制的平衡反应，从而得出电针抑制局灶脑缺血/再灌注后炎症损伤可能的作用靶点和作用机制。另外，以右侧海马CA1区为研究区域，以NBD多肽为干预手段，取再灌注后24h及7d为观察时相点，以NF-κB信号通路中关键蛋白NF-κB p65及IκBα作为研究对象，研究探讨局灶脑缺血/再灌注后给予该药抑制海马CA1区炎症反应进而减轻远隔损害的神经保护作用及其可能的作用机制。方法：1.运用大鼠右侧大脑中动脉闭塞/再通模型（middle cerebralartery occlusion/reperfusion, MCAO/R），将355只SD雄性健康清洁级大鼠随机分为假手术组（n=70）、模型组（n=95）、电针组（n=95）及NBD药物组（n=95），每组将按照再灌注后6h、12h、24h及48h四个时相点分为4个亚组，每组每个时间点5只大鼠。利用电针刺激模型大鼠的“百会”穴（GV20）及“四关”穴（“合谷”LI4/“太冲”LR3）进行电针干预；同时利用侧脑室注射NBD多肽进行药物干预。运用TTC染色观察局灶脑缺血/再灌注后24h时脑梗死体积的变化；HE及FJB染色观察局灶脑缺血/再灌注后24h脑缺血再灌注、电针及NBD多肽干预后病灶内神经细胞变性损伤及丢失情况；ELISA检测缺血病灶区内脑组织及外周血血清中6h、12h、24h及48h四个时间点细胞因子（IL-1β/IL-13）的含量变化；免疫组化定位观察再灌注后24h时间点NF-κB p65蛋白胞浆/胞核的表达情况；免疫荧光检测再灌注后24h时间点缺血灶内NF-κB p65/IκBα胞浆/胞核蛋白的表达及IKKα及IKKβ的蛋白变化；Western blot检测各组NF-κB p65/IκBα胞浆或胞核蛋白的表达变化；Western blot、Q-PCR检测各组内IKKα及IKKβ的蛋白及mRNA表达变化；EMSA实验检测各组内NF-κB与DNA结合能力的变化。2.将138只雄性健康清洁级SD大鼠随机分为假手术组（n=24）、模型组（局灶脑缺血/再灌注组，n=38）、NBD多肽药物组（局灶脑缺血/再灌注+NBD多肽, n=38）及NBD对照药物组（局灶脑缺血/再灌注+NBD多肽转化型, n=38）。运用苏木素-伊红染色及FJB染色观测局灶脑缺血/再灌注及NBD多肽干预后大鼠海马CA1区内神经细胞变性损伤、丢失情况；运用ELISA检测海马区组织内IL-1β及IL-1Ra的含量变化；免疫荧光双标、免疫蛋白印迹检测NF-κB p65及IκBα蛋白在胞核表达的变化情况探讨各组别海马CA1区内NF-κB的核转位活化过程。结果：1. TTC染色显示局灶脑缺血/再灌注24h后模型组脑梗死体积约为40%，电针组及NBD组脑梗死体积明显减小（P<0.05）（电针组约为30%、NBD组约为22%）。HE及FJB染色显示，局灶脑缺血/再灌注24h后模型组内神经细胞受损及丢失明显；电针组及NBD组缺血区内神经细胞受损及丢失情况明显减轻（P<0.05）；与模型组、电针组比较，NBD组减轻效应更显着（P<0.05）。ELISA检测显示，与假手术组比较，模型组中促炎因子IL-1β含量在缺血脑组织及外周血血清中明显增高，电针组及NBD组IL-1β含量水平明显低于模型组（P<0.05），NBD组比电针组降低更明显（P<0.05）；抑炎因子IL-13含量在模型组、电针组及NBD组的脑组织及外周血血清中均升高，但比模型组比较，电针组、NBD组升高更明显（P<0.05），同时模型组中IL-13含量高峰时间点为48h，电针组将IL-13含量高峰时间点提前至24h及NBD组内的提前至12h。免疫组化显示模型组NF-κB p65在胞浆及胞核均表达，特别在胞核内高表达（P<0.05），电针组及NBD组结果与模型组比较，以胞浆表达为主，胞核表达明显减少（P<0.05），电针组与NBD组结果比较无明显差别（P>0.05）。免疫荧光、Western blot检测显示，与假手术组比较，模型组胞核内NF-κB p65蛋白高表达（P<0.05），而IκBα蛋白呈低表达（P>0.05）；电针组及NBD组与模型组比较，均能明显增加胞浆及胞核内IκBα的表达、降低NF-κB p65在胞核内的高表达（P<0.05），抑制NF-κB的核转位。在IKKα、IKKβ指标的观测中，与假手术组比较，模型组内IKKα、IKKβ蛋白及mRNA表达明显增高，特别是再灌注后24h及48h，IKKβ蛋白及mRNA升高明显（P<0.05）；与模型组比较，电针组IKKα、IKKβ蛋白及mRNA表达显着下降（P<0.05），而NBD组与模型组及电针组比较，IKKβ蛋白及mRNA表达下降最明显（P<0.05），但对IKKα无明显抑制作用（P>0.05）。在NF-κB与DNA结合能力变化的检测中，与假手术组比较，模型组内NF-κB与DNA结合能力明显升高（P<0.05），电针组及NBD组内NF-κB与DNA结合能力与模型组比较明显下降，其中电针组与NBD组比较，电针组下降更显着（P<0.05）。显示电针及NBD多肽对于NF-κB信号通路中其关键抑制蛋白及关键激活蛋白均有调节作用。2.海马CA1区检测结果示：HE及FJB染色显示，与假手术组比较，局灶脑缺血/再灌注后模型组24h及7d海马CA1区出现明显的神经细胞变性坏死损伤（P<0.05），神经细胞丢失明显（P<0.05），MT-NBD药物对照组显示相同结果（P<0.05），模型组内24h与7d之间比较神经细胞受损数目无显着差异（P>0.05），MT-NBD组结果与模型组结果比较无差异（P>0.05）；同时，与假手术组比价，模型组及MT-NBD组内1L-1β及IL-1Ra含量显着增高，特别是再灌注后24h时间点最显着（P<0.05）。与模型组及MT-NBD组比较，NBD组内24h及7d变性受损及丢失的神经细胞数目明显减少（P<0.05），特别是再灌注后7d改善最显着（P<0.05）；同时，NBD组内IL-1β含量显著降低（P<0.05），IL-1Ra含量明显增高（P<0.05）。免疫荧光及western blot检测结果显示，与假手术组比较，模型组及MT-NBD组于再灌注后24h及7d海马组织CA1区细胞核内p65蛋白表达显着增加（P<0.05），而IκBα呈低表达（P>0.05）；NBD组与模型组及MT-NBD组比较，胞核内p65蛋白表达显着降低（P<0.05），而IκBα蛋白在胞核内大量表达（P<0.05），表明NBD多肽能有效调节NF-κB p65及IκBα在胞核的表达，从而有效干预NF-κB的核转位过程。结果表明局灶脑缺血/再灌注后，海马CA1区内神经细胞受损明显，炎症反应被激活；NBD多肽干预后促炎因子水平下降，神经细胞受损减轻，证实海马区内炎症反应被抑制，能有效缓解脑缺血/再灌注对海马产生的远隔损害。结论：1.局灶脑缺血/再灌注后炎症反应被激活，局部缺血大脑皮质内神经细胞受损明显；电针刺激及NBD多肽干预均能抑制NF-κB信号通路的激活：二者均能通过增加NF-κB/IκBα反馈环路中IκBα的表达在局灶脑缺血/再灌注早期有效抑制NF-κB核转位过程；但二者对于IκB激酶的作用却不相同：电针极有可能是通过有效抑制IKKα、IKKβ的表达，阻止IκBα降解的程度，调节NF-κB/IκBα反馈环路的平衡而抑制NF-κB核转位，同时抑制NF-κB增高的活性而达到有效抑制NF-κB信号通路激活的目的；而NBD多肽能显着抑制IKKβ的表达调节NF-κB/IκBα反馈环路的平衡而抑制NF-κB信号通路的激活，对于IKKα作用却不显著，其抑制NF-κB活性的能力也弱于电针，因此，NBD多肽的作用靶点精确与电针多靶点的特点有所不同。综上，电针及NBD多肽通过有效调节NF-κB信号通路在病理状态下过度活化的平衡，达到减轻局灶脑缺血/再灌注后炎性反应损害的目的。2.局灶脑缺血/再灌注后，缺血缺氧远隔损害部位的大鼠海马CA1区内NF-κB核转位过程启动，NF-κB信号通路被活化，海马CA1区内炎症反应被激活，加剧了局灶脑缺血/再灌注产生的远隔损害对脑组织的破坏；NBD多肽干预能抑制NF-κB的核转位过程，阻止NF-κB信号通路的活化从而有效抑制炎症反应的级联放大，达到减轻局灶脑缺血/再灌注后海马CA1区内远隔损害的目的。
周密[5]2016年在《Parkin/DJ-1调控的线粒体自噬在远端缺血后处理减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的作用》文中提出缺血性脑血管病占脑血管病绝大部分,其有效的治疗方法是及时的恢复缺血区域的血液灌注。然而,在脑缺血一段时间恢复再灌注后会导致再灌注损伤(Reperfusion Injury),因此需要采取有效的脑保护措施,尽可能的降低缺血再灌注损伤。研究表明,缺血预处理(ischemic preconditioning, IPR)和缺血后处理(ischemic postconditioning, IPO)均能有效减轻脑缺血再灌注损伤,但由于自身局限性使这两种方式在临床实践中的应用受到极大的限制。而在器官缺血后,在更能耐受缺血的远隔器官如肢体施行缺血后处理即远端缺血后处理(remote ischemic postconditioning, RIPoC),可控性强、操作方便,在临床实践中具有广泛的应用价值。虽然RIPoC对脑缺血再灌注损伤能够产生良好的保护作用且作用靶点多样,但其作用机制并未完全阐明。自噬(autophagy)在缺血再灌注损伤中发挥重要作用,但对于自噬在脑缺血再灌注损伤中起保护作用还是促进神经细胞死亡,目前的研究尚存在争议。现普遍认为：生理状态下,自噬在细胞内持续低水平进行以维持细胞正常功能；当细胞处于适度应激状态时,如氧化应激、缺血、饥饿等,自噬可以显着增强,以维持细胞的结构与功能；当细胞处于强烈应激状态下,过度自噬将会发生,从而使细胞失去活力。在机体处于健康状况下时,经氧化磷酸化反应线粒体能够为细胞正常活动提供能量和生物合成的底物,同时,线粒体代谢过程中ROS的异常积累会引起线粒体损伤；受损的线粒体通过自噬被选择性清除而维持细胞内环境的稳定,即线粒体自噬(mitophagy)。调控机体适度的自噬水平,特别是选择性调控线粒体自噬水平对维持细胞正常结构功能并防治一些疾病发生发展十分重要。研究表明,不论是IPR还是IPO均可通过调节细胞自噬水平来诱导对缺血神经元的保护作用。然而到目前为止,在脑缺血再灌注损伤过程中神经元的生存和死亡是如何通过自噬水平的高低来决定还不太清楚。远端缺血后处理对脑缺血再灌注损伤的保护作用是否与调节线粒体自噬有关,尚无研究报道。Parkin与DJ-1为帕金森病相关蛋白,均可通过调控氧化应激水平而维持线粒体功能,并在调控的线粒体自噬中具有重要作用。本研究将在SD成年大鼠上,建立短暂性局灶性脑缺血再灌注模型及肢体远端缺血后处理模型,首先明确远端缺血后处理对脑缺血再灌注损伤具有保护作用,然后应用线粒体自噬抑制剂研究Parkin/DJ-1调控的线粒体自噬在远端缺血后处理减轻脑缺血再灌注中的作用,探讨其可能的作用机制,为其今后应用于临床提供理论指导和实验依据。本实验研究分为两个部分：1.远端缺血后处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。2. Parkin/DJ-1介导的线粒体自噬在远端缺血后处理减轻局灶性脑缺血再灌注损伤中的作用。第一部分远端缺血后处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用目的：探讨RIPoC对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用与氧化应激、神经元凋亡相关性方法：成年雄性SD大鼠39只,体重280-320g,采用随机数字表法,将其分为3组(n=13)：假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、I/R+远端缺血后处理组(I/R+RIPo组)。采用大脑中动脉阻断法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。于再灌注开始时,I/R+RIPoC组立即夹闭双侧股动脉实行10min缺血/10min再灌注,共计3个循环。于再灌注24h,行神经功能缺陷评分(NDS)；采用TTC染色测定脑梗死体积,计算脑梗死体积百分比；TUNEL法检测缺血半暗区神经元凋亡情况；测定缺血半暗区SOD的活性及MDA、15-F2t-Isoprostane的含量。结果：1、RIPoC减轻缺血再灌注后脑梗死体积,改善大鼠的神经功能：S组大鼠脑组织TTC染色未见梗死灶,无神经功能障碍；与S组比较,I/R组、]I/R+RIPoC组脑梗死体积百分比、NDS评分显着升高(P<0.05)；与I/R组比较,I/R+RIPoC组脑梗死体积百分比、NDS评分显着降低(P<0.05),表明RIPoC减轻了缺血再灌注后脑梗死体积,改善了大鼠的神经功能。2、RIPoC减轻大鼠缺血半暗区神经元凋亡,抑制氧化应激反应：与S组比较,I/R组、I/R+RIPoC组缺血半暗区神经元凋亡指数、MDA和15-F2t-Isoprostane含量显着升高,I/R组缺血半暗区SOD活性降低(P<0.05)；与I/R组比较,I/R+RIPoC组缺血半暗区神经元凋亡指数、MDA和15-F2t-Isoprostane含量显着降低、SOD活性升高(P<0.05),表明RIPoC减轻了大鼠缺血半暗区神经元凋亡,抑制了氧化应激反应。结论：RIPoC可有效的减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤,其与抑制氧化应激反应,减少神经元凋亡有关。第二部分Parkin/DJ-1介导的线粒体自噬在远端缺血后处理减轻局灶性脑缺血再灌注损伤中的作用目的：探讨Parkin/DJ-1介导线粒体自噬在RIPoC减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的作用。方法：成年雄性SD大鼠96只,体重280-320g,采用随机数字表法,将其分为5组：假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、I/R+远端缺血后处理组(I/R+RIPo组)、I/R+RIPoC+线粒体自噬抑制剂组(I/R+RIPoC+M组)和I/R+RIPoC+生理盐水组(I/R+RIPoC+NS组)。采用大脑中动脉阻断法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。于再灌注开始时,I/R+RIPoC组、I/R+RIPoC+M组和I/R+RIPoC+NS组立即夹闭双侧股动脉实行10min缺血/10min再灌注,共计3个循环；I/R+RIPoC+M组、I/R+RIPoC+NS组在缺血前5 min分别腹腔注射线粒体分裂抑制剂(mitochondrial-division inhibitor-1, Mdivi-1) 3mg/kg和等容量的生理盐水。于再灌注24h,行神经功能缺陷评分(NDS)；采用TTC染色测定脑梗死体积,计算脑梗死体积百分比；透射电镜观察缺血半暗区线粒体自噬体；流式细胞术检测缺血半暗区神经元线粒体膜电位和线粒体质量；Western blot法检测缺血半暗区LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Parkin和DJ-1蛋白表达水平,计算LC3-Ⅱ/Ⅰ比值；免疫荧光染色观察Parkin和DJ-1蛋白的亚细胞定位；LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、脑梗死体积百分比分别与Parkin和DJ-1蛋白表达水平行直线相关分析。结果：1、RIPoC减轻缺血再灌注后脑梗死体积,改善大鼠的神经功能,mdivi-1阻抑RIPoC的作用：S组大鼠脑组织TTC染色未见梗死灶,无神经功能障碍；与S组比较,其余4组脑梗死体积百分比、NDS评分显着升高(P<0.05)；与I/R组比较,I/R+RIPoC组和I/R+RIPoC+NS脑梗死体积百分比、NDS评分显着降低(P<0.05),表明RIPoC减轻了缺血再灌注后脑梗死体积,改善了大鼠的神经功能；与I/R+RIPoC组和I/R+RIPoC+NS组比较,I/R+RIPoC+M组脑梗死体积百分比、NDS评分显着升高(P<0.05),而I/R组和I/R+RIPoC+M组间脑梗死体积百分比、NDS评分比较差异无统计学意义(P>0.05),表明抑制线粒体自噬会阻抑RIPoC的脑保护作用。2、脑缺血再灌注诱导缺血半暗区神经元发生线粒体自噬,而RIPoC增加了缺血半暗区线粒体自噬的水平,mdivi-1阻抑RIPoC的这种作用：1)透射电镜显示：S组神经元细胞结构正常,线粒体膜完整,未见线粒体自噬体；I/R组可见典型双层膜包裹的线粒体自噬体,还可观察到线粒体自噬溶酶体以及自噬溶酶体内不能降解的线粒体残体。流式细胞术检测显示：与S组比较,I/R组缺血半暗区神经元线粒体膜电位和线粒体质量分别减低到56.5%和64.8%(P<0.05)。以上结果表明脑缺血再灌注显着诱导缺血半暗区线粒体自噬的发生。2)LC3-II/I比值的变化来评价自噬水平,与S组比较,其余4组缺血半暗区LC3-II/I比值升高(P<0.05)；与I/R组比较,I/R+RIPoC组和I/R+RIPoC+NS缺血半暗区LC3-II/I比值升高(P<0.05),表明RIPoC增加了缺血半暗区神经元自噬的水平；与I/R+RIPoC组和I/R+RIPoC+NS组比较,]I/R+RIPoC+M组缺血半暗区LC3-II/I比值降低(P<0.05),而I/R组和I/R+RIPoC+M组间LC3-Ⅱ/Ⅰ比较差异无统计学意义(P>0.05),表明]mdivi-1阻抑RIPoC引起的缺血半暗区神经元自噬水平的增加。3、RIPoC上调大鼠脑缺血半暗区Parkin、DJ-1蛋白表达水平,mdivi-1未能抑制RIPoC的作用：与S组比较,其余4组缺血半暗区Parkin、DJ-1蛋白表达上调(P<0.05)；与I/R组比较,I/R+RIPoC组和I/R+RIPoC+NS缺血半暗区Parkin、DJ-1蛋白表达上调(P<0.05),表明RIPoC上调大鼠脑缺血半暗区Parkin, DJ-1蛋白表达水平；I/R+RIPoC组、I/R+RIPoC+NS组、I/R+RIPoC+M组之间两两比较,Parkin、DJ-1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),表明mdivi-1未能抑制IRIPoC对大鼠缺血半暗区Parkin、DJ-1蛋白表达水平的上调。4、免疫荧光染色观察Parkin和DJ-1蛋白的亚细胞定位,结果显示：与S组比较,I/R组黄色荧光在脑缺血半暗区神经元线粒体上显着增强,表明脑缺血再灌注诱导Parkin和DJ-1蛋白向线粒体转位；与I/R组比较,I/R+RIPoC组脑缺血半暗区神经元线粒体上黄色荧光也显着增强,表明RIPoC进一步促进Parkin和DJ-1蛋白向线粒体转位。5、大鼠脑缺血半暗区Parkin和DJ-1蛋白表达水平分别与LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、脑梗死体积百分比行直线相关分析,结果显示：大鼠脑缺血半暗区LC3-Ⅱ/Ⅰ比值与Parkin、DJ-1蛋白表达水平呈正相关,脑梗死体积百分比与Parkin、DJ-1蛋白表达水平呈负相关。结论：RIPoC减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤,与其上调Parkin、DJ-1蛋白表达水平,促进Parkin、DJ-1蛋白向线粒体转位,从而增强线粒体自噬有关,即Parkin/DJ-1介导线粒体自噬参与了远端缺血后处理的脑保护作用。
王刚[6]2016年在《祛湿通脉方治疗肢体缺血再灌注损伤（湿瘀互结证）的疗效观察及对SOD及TNF-α的影响》文中研究指明目的下肢缺血类疾病的发病率近些年来有逐渐上升的趋势,在70岁以上人群中发病率高达15-20%。目前,药物治疗可以改善患者的症状,缓解病情,但不能使已经阻塞血管再通,随着现代医学的逐渐发展,介入治疗在下肢缺血类的疾病中应用越来越广泛,而在介入改善了血管供血的同时,我们又常面临另一个让我们头疼的问题,就是肢体缺血再灌注。缺血再灌注可引起肢体症状,比如疼痛、肿胀、麻木等,还可以引起远隔器官的损伤,比如心、脑、肾、肝、胃肠道等,严重的可危及生命；目前针对再灌注损伤的治疗没有特别有效的方法,中药在治疗肢体缺血再灌注损伤方面有很好的疗效,而关于中药治疗肢体缺血再灌注的研究目前还非常少；杨博华教授在临床工作中使用祛湿通脉方治疗肢体缺血再灌注损伤湿瘀互结证取得了良好的临床疗效,但一直未能针对此治疗方法进行临床总结。本研究将60例下肢缺血患者在介入手术开通血管后发生肢体再灌注损伤且属于中医湿瘀互结辩证分型的患者随机分为常规治疗组及常规治疗加祛湿通脉方口服组,通过两组之间治疗后的症状积分分析,以评价祛湿通脉方在治疗肢体缺血再灌注中的临床疗效,为治疗肢体缺血再灌注找到更多的治疗途径以及保证更确切的疗效,以达到在临床推广为更多的患者造福的目的；并在治疗后1、3、7、14天两组之间分别检测血清中超氧化物歧化酶的活性和肿瘤坏死因子α浓度,比较治疗组和对照组在治疗后超氧化物歧化酶的活性和肿瘤坏死因子α浓度是否有差异,以及随着治疗时间的延长超氧化物歧化酶的活性和肿瘤坏死因子α浓度的变化趋势,以期找出祛湿通脉方治疗肢体缺血再灌注损伤的机制,为中药治疗肢体缺血再灌注找到更多循证学证据,以及为中药有效治疗肢体缺血再灌注提供更多的理论支持。方法2013年1月1日到2015年10月1日,我院下肢缺血患者在介入手术后发生肢体缺血再灌注损伤且符合中医湿瘀互结辨证分型的共60例患者随机分为治疗组及对照组,对照组给予静脉滴注0.9%氯化钠250m1+硫辛酸注射液600mg及0.9%氯化钠注射液250m1+七叶皂苷纳注射液15mg,每日一次；常规给予降压降脂降糖等基础治疗并给予拜阿司匹林口服抑制血小板聚集。治疗组在对照组治疗基础上加杨博华教授自拟的祛湿通脉方口服(康仁堂制药公司制作的颗粒剂)组方：黄柏15g 炒苍术l0g牛膝l0g茯苓15g丹参20g红花6g泽兰12g；服药方式：当出现再灌注损伤时即开始服用,每日两次,早餐前及晚餐前各一次,每次一袋,口服14天；观察指标：治疗开始后1、3、7、14天观察患者的疼痛、麻木、肿胀、远隔器官是否受损进行症状积分进行评价分析；并在治疗后1、3、7、14天行静脉抽血,查超氧化物歧化酶的活性和肿瘤坏死因子α的浓度,录入SPSS数据库,经统计分析得出结果；结果1.症状积分评价：在治疗第1天治疗组和对照组之间的症状积分无明显差异,P>0.05；在治疗的第3、7、14天治疗组的症状积分优于对照组,P<0.05；2. TNF-α浓度：组间比较：治疗组与对照组组间比较在治疗的第1天和第14天两组之间无明显差异,P>0.05,在治疗的第3、7天治疗组的TNF-α浓度明显低于对照组,两组之间差异明显,P<0.05；同组不同时间点位比较：治疗组同组不同时间点位的比较显示：第1天与第3天、第3天与第7天TNF-α浓度均有明显差异P<0.05,第7天与第14天TNF-α浓度无明显差异,P>0.05,对照组的同组不同时间点位的比较显示：第1天与第3天、第3天与第7天、第7天和第14天TNF-α浓度均有明显差异P<0.05；3.血清中SOD的活性：组间比较：血清中SOD的活性治疗组与对照组组间比较在治疗的第7天和第14天两组之间无明显差异,P>0.05,在治疗的第1天和第3天治疗组的SOD活性明显高于对照组,两组之间差异明显,P<O.05；同组不同时间点位比较：治疗组血清中SOD的活性在同组不同时间点位的比较显示：第1天与第3天有明显差异,P<0.05；但第3天与第7天、第7天和第14天无明显差异,P>0.05；而对照组的血清中SOD的活性在同组不同时间点位的比较显示：第1天与第3天、第3天与第7天均有明显差异,P<0.05；但第7天和第14天无明显差异,P>0.05；结论祛湿通脉方在治疗肢体缺血再灌注湿瘀互结证型者是明确有效的,值得临床推广；祛湿通脉方能更快的降低血清中TNF-α浓度说明其可能有较好的抗炎性反应,清除炎性介质的作用；祛湿通脉方还能更快的提升SOD活性,说明其清除氧自由基、提高机体抗氧化应激反应的能力较强；肢体缺血再灌注后TNF-α浓度呈现高表达,后逐渐减低；而S0D活性在缺血再灌注后活性减低后逐渐升高；说明肢体缺血再灌注后体内的炎性介质被激活,炎性因子表达增强,而一些抗氧化酶因为要清除大量自由基而被消耗活性减低,这也间接说明了炎性因子和氧自由基参与导致了肢体缺血再灌注后的机体组织的损害。
郑燕华[7]2005年在《大蒜素对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的保护作用及机制》文中进行了进一步梳理大蒜素(allicin),是从大蒜中分离出的有效成分,其化学名为二烯丙基叁硫化物。许多实验表明大蒜素能抑制血小板活化聚集,阻止血栓形成。本研究旨在阐明大蒜素在脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-repeffusion injury,CIRI)中的保护作用、作用机制、有效剂量、有效用药时间,为临床治疗用药提供依据。 采用改良Longa线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血-再灌注损伤(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,分为假手术组、溶媒组、10mg.kg~(-1)大蒜素治疗组及20mg.kg~(-1)大蒜素治疗组。不同组于缺血同时分别舌下静脉给予溶媒或不同剂量大蒜素,观察再灌注24h大蒜素脑保护作用及可能机制:不同组分别于缺血0h、再灌注0h和再灌注2h分别给予大蒜素20mg.kg~(-1)后,观察再灌注24h大蒜素的脑保护作用;不同组于缺血同时分别舌下静脉给予溶媒或不同剂量大蒜素,观察大蒜素对再灌注损伤24h、48h的保护作用:观察大蒜素对再灌注24h时各组远隔重要器官损伤的保护作用。 结果: 1.改良Longa法建立大鼠大脑中动脉闭塞模型更加稳定,成功率更高,具有更好的可靠性和重复性。 2.不同剂量大蒜素对CIRI 24h的保护作用及机制 (1)10 mg.kg~(-1)和20 mg.kg~(-1)剂量大蒜素均可明显降低死亡率、缩小脑损伤范围、减轻脑水肿程度、降低神经功能缺失评分、改善脑组织病理形态,两个剂量大蒜素在缩小脑损伤范围和减轻脑水肿程度方面有剂量依赖关系。 (2)10 mg.kg~(-1)和20 mg.kg~(-1)剂量大蒜素均可明显提高脑组织SOD活性,降低脑组织MDA、MPO含量;降低脑组织NO、iNOS,抑制iNOSmRNA表达、降低血浆ET水平;提高血浆PG12/TXA_2,阻止炎性介质产生;两个剂量大蒜素在提高SOD活性、降低MDA含量、抑制NO、iNOS,抑制iNOSmRNA表达方面有剂量依赖关系;大剂量大蒜素可提高bc1-2/bax,有明显的抗凋亡作用;两个剂量大蒜素对钙调神经磷酸酶(CaN)活性均无影响。 3.大蒜素不同治疗时间窗对CIRI 24 h的保护作用 (1)缺血0 h、再灌注0 h和再灌注2h分别给予大蒜素20 mg.kg~(-1)后,均
田向阳[8]2013年在《氧糖剥夺后处理在氧糖剥夺—再灌注损伤中的保护作用及可能机制》文中指出脑梗死（cerebral infarction）是一种具有高发病率与高致残率的脑血管疾病。其主要病理是血栓堵塞血管导致的神经细胞缺血性死亡，对其最有效的疗法是溶栓治疗以恢复缺血组织的血供，但会造成脑缺血-再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤。缺血后处理（ischemic postconditioning，IPostC）是一种在组织器官发生缺血损伤后，再灌注恢复之前，给予多次短暂交替的亚致死性缺血与再灌注的处理方式。已经在一些实验与临床中证实它具有抗I/R损伤的作用，并且IPostC在再灌注前施行，可操作性好。现有的研究认为，IPostC发挥作用的主要靶点是细胞凋亡与PI3K/Akt信号通路，但其具体机制仍未阐明。目前，IPostC对脑I/R损伤影响的研究较少，多以动物模型为研究对象，对其在体外细胞模型中的作用及机制研究很少。本研究拟通过使用体外培养的SK-N-SH细胞，改进建立氧糖剥夺-再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）损伤的细胞模型，以模拟体内I/R损伤，同时通过短暂交替的氧糖剥夺与复氧糖的处理方式实施氧糖剥夺后处理（oxygen-glucose deprivation postconditioning，OGDP）以模拟IPostC，观察OGDP对OGD/R的影响及其影响因素。在此基础上，选择OGDP的最适处理方式，进一步探讨OGDP抗OGD/R损伤的机制，为在体外研究脑I/R损伤的机制与治疗靶点提供可靠的实验基础。本研究内容分为两个部分：（1）氧糖剥夺后处理在氧糖剥夺-再灌注中的保护作用。（2）氧糖剥夺后处理对氧糖剥夺-再灌注细胞凋亡的作用及可能机制。第一部分氧糖剥夺后处理在氧糖剥夺-再灌注中的保护作用目的：观察OGDP在OGD/R中的保护作用及其影响因素。方法：应用SK-N-SH细胞进行OGD4h，然后恢复氧糖20h而建立OGD/R模型，并在细胞OGD后实施OGDP。细胞分为对照组（正常培养组）、氧糖剥夺-再灌注组（OGD/R组）与氧糖剥夺后处理组（OGDP组），其中OGDP组根据OGDP的不同处理时间分为1、5、10、15、20、30、60min亚组；根据不同时间窗分为5、10、15、20、30、60min亚组；根据不同循环次数分为1、2、3、4、5、6次循环亚组。MTT比色法检测不同处理组的细胞存活率，倒置相差显微镜观察细胞形态学的变化。结果：（1）OGDP不同处理时间对细胞存活率的影响OGD/R组细胞存活率比对照组下降约44.5%（P<0.01）。与OGD/R组相比，10、15min组细胞存活率的增加有统计学意义（P<0.01），其中10min组细胞存活率约比OGD/R组提高约15.7%，并与15min组比较无差别（P>0.05）。20、30、60min组的细胞存活率呈下降趋势，并且不能提高存活率（与OGD/R组比较，P>0.05）。（2）OGDP不同时间窗对细胞存活率的影响。与OGD/R组相比，时间窗10、15min组能显着提高损伤细胞的存活率（P<0.01），而5、20、30、60min组则不能提高细胞存活率（P>0.05）。（3）OGDP不同循环次数对细胞存活率的影响。与OGD/R组比较，1、2、3、4次循环组细胞存活率显着增加（P<0.01），与1次循环组相比，3次循环组细胞存活率显着增加，提高了约8.5%（P=0.02），而2、4次循环组细胞存活率无显着提高（P>0.05）。（4）倒置相差显微镜下细胞形态学观察对照组细胞数量多，呈不规则贴壁生长，胞体饱满呈锥形或多边形，边界清楚有明显的光晕，有很强的折光性，突起粗而长。OGD/R组细胞数量明显减少，细胞稀疏，折光性下降，贴壁性差，突起回缩，胞体明显皱缩变小变圆。与OGD/R组相比，OGDP组细胞数量显着增多，多数形态正常，贴壁状态较好，折光性上升，胞体多呈多边形，少数细胞胞体皱缩变圆。结论：OGDP对OGD/R损伤细胞的具有保护作用，其作用与OGDP的处理时间、时间窗及循环次数有关，并且在3次循环的10min后处理时效果显着。第二部分氧糖剥夺后处理对氧糖剥夺-再灌注细胞凋亡的作用及可能机制目的：观察OGDP在OGD/R中的抗细胞凋亡作用，并寻找其抑制凋亡的可能机制，探讨PI3K/Akt信号通路在OGDP抗OGD/R细胞凋亡中的作用。方法：模型制作及OGDP方式同第1章。细胞实验分为对照组（正常培养组）、氧糖剥夺-再灌注组（OGD/R组）、氧糖剥夺后处理组（OGDP组）。Hoehst33258凋亡染色观察凋亡形态学的变化并进行凋亡计数，Western blot法检测蛋白Caspase-3、p-Akt和Akt的表达。结果：（1）Hoechst33258检测结果对照组细胞核荧光颜色呈均匀淡蓝色，细胞核形态规则。OGD/R组细胞核发高亮的蓝色荧光，核有破碎，染色质固缩和边集化，呈凋亡特征。OGDP组较OGD/R组细胞核荧光颜色明显变淡，细胞核形态趋于规则，染色质固缩减少。凋亡计数结果显示，OGD/R组与OGDP组细胞凋亡率与对照组相比显着增高（P<0.01），OGDP组细胞凋亡率显着低于OGD/R组（P=0.023）。（2）Western blot检测Akt、p-Akt表达的结果各组间Akt蛋白表达量差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组相比，OGD/R组与OGDP组p-Akt蛋白表达水平显着增加（P<0.01）。与OGD/R组比较，OGDP组p-Akt表达水平显着增加（P=0.04）。（3）Western blot检测caspase-3表达的结果与对照组相比，OGD/R组与OGDP组caspase-3蛋白表达水平明显增高（P<0.01），但与OGD/R组相比，OGDP组caspase-3表达水平显着下降（P=0.02）。结论：OGDP具有抑制OGD/R中细胞凋亡的作用，其抑制凋亡作用可能与caspase-3表达受抑制有关，并且PI3K/Akt信号通路参与OGDP抑制细胞凋亡的过程。
刘毅[9]2008年在《缺血后处理、缺血远隔后处理和纳洛酮后处理对大鼠局灶性脑缺血—再灌注损伤影响的实验研究》文中指出背景:缺血后处理是指在一个持续时间较长的缺血期后,在再灌注前交替实施短时间的再灌注和停止再灌注。缺血远隔后处理是指在非缺血器官交替实施短时间的缺血和再灌注。近年来,缺血后处理和缺血远隔后处理抗缺血-再灌注损伤的器官保护效应已经被中外学者所证实。纳洛酮是临床麻醉中用于拮抗阿片类药物的常用药物,虽然其神经保护作用早已被证实,但目前尚不明确其是否具有抗脑缺血-再灌注损伤的后处理作用。有鉴于此,我们设计了本实验,旨在观察缺血后处理、缺血远隔后处理和纳洛酮后处理是否具有神经保护作用及其各种后处理措施之间的相互作用。另外,通过蛋白印迹分析,判断各种后处理措施的神经保护作用与MAP2表达的相关性;通过激光扫描共聚焦显微镜检查,进一步研究了各种后处理条件下大脑微循环结构的变化。方法:将134只成年雄性SD大鼠(270～330g)随机分为8组(Ⅰ-Ⅱ组,n=19;Ⅲ-Ⅷ组,n=16),具体实验方案如下:Ⅰ组为假手术组,其余各组接受90 min的右脑局部缺血(MCAO)和24 h的再灌注。Ⅱ组为缺血对照组;Ⅲ组为缺血后处理组,再灌注开始后,Ⅲ组首先实施重复3次的30 s再缺血和30 s再灌注;Ⅳ组为缺血远隔后处理组,在再灌注前实施5 min的右股动脉缺血;Ⅴ组为缺血后处理和缺血远隔后处理复合应用组,实施Ⅲ组和Ⅳ组的两种后处理操作;Ⅵ组为小剂量纳洛酮后处理组;Ⅶ组为大剂量纳洛酮后处理组;Ⅷ组为缺血、缺血远隔和大剂量纳洛酮复合后处理组,实施Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅶ组的叁种后处理操作。在再灌注即刻,大鼠腹腔注射用生理盐水稀释的纳洛酮10ml(Ⅵ组1 mg/kg,Ⅶ和Ⅷ组10 mg/kg)或等容生理盐水(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组)。本实验采用线栓法建立大鼠的局灶性脑缺血-再灌注损伤模型,即在颈总动脉(CCA)分叉下方1 cm处,将尼龙线栓置入CCA,经分叉上行进入颈内动脉(ICA)遇明显阻力表明线栓头端已进入大脑中动脉(MCA)起始处。开始计时大脑中动脉阻断(MCAO)诱发的局灶性脑缺血,90 min后缓慢抽出尼龙线栓,并开始再灌注计时。缺血远隔后处理采用单侧下肢缺血模型,在开始再灌注前5 min阻断单侧股动脉,在再灌注即刻松开股动脉夹。实验动物的排除标准包括:HBG低于80 g/L;SO_2低于90%;迷走神经损伤;手术操作失败;MAP低于60 mmHg;蛛网膜下隙出血;尼龙线栓置入失败或刺破血管;术后24 h内感染和死亡。实验过程中连续监测心率(HR)、平均动脉压(MAP)和Ⅱ导联心电图(ECG);在再灌注1 h后抽取动脉血进行血气分析。再灌注2 h和24 h后采用四分法测定大鼠的神经功能缺损评分(neurologic deficit score;NDS):0级,无神经功能缺损症状;1级,轻度局灶性神经功能缺损,即提尾悬空时不能伸展左前肢;2级,中度局灶性神经功能缺损,即行走时向左侧偏转;3级,重度局灶性神经功能缺损,即行走时向左侧倾倒;4级,昏迷,不能自发行走。实验结束后断头取脑,采用TTC染色法测定脑梗死面积(以其同侧大脑半球面积的百分比表示)(n=10),采用蛋白质斑迹技术测定双侧脑组织的MAP2表达(n=3)。在再灌注24 h后,每组的另外3只大鼠在股静脉注射异旒氰酸-右旋糖酐1 ml,1 min后快速断头取脑,进行激光扫描共聚焦显微镜检查。在再灌注即刻,Ⅰ组和Ⅱ组另外的3只大鼠,静脉注射异旒氰酸-右旋糖酐1 ml用于激光扫描共聚焦显微镜检查。结果:各组大鼠缺血前HR和MAP的基础值无显着性差异(P＞0.05),再灌注1 h后的血红蛋白和血氧饱和度无显着性差异(P＞0.05)。各组大鼠在缺血-再灌注期间各时间点的HR和MAP亦无显着性差异(P＞0.05)。除Ⅰ组之外,其余各组在再灌注2 h和24 h的NDS评分的组内比较均无显着性差异(P＞0.05)。与Ⅱ组相比,再灌注2 h时,Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ组的NDS评分均显着降低(P＜0.05);再灌注24 h时,Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ组的NDS评分均显着降低(P＜0.05)。与Ⅷ组相比,再灌注24 h时,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ和Ⅶ组的NDS评分均显着升高(P＜0.05)。与Ⅱ组相比,Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ组的脑梗死面积均显着减小(P＜0.05);与Ⅷ组相比,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ组的梗死面积均显着升高(P＜0.05)。与Ⅱ组相比,Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ组缺血侧MAP2蛋白的表达均显着升高(P＜0.05),与Ⅷ组相比,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ组缺血侧MAP2蛋白的表达均显着降低,(P＜0.05)。在再灌注即刻,MCAO缺血组(Ⅰ组)缺血侧脑组织的血浆容量和血管直径较对侧和假手术组显着降低(P＜0.05),MCAO缺血组非缺血侧脑血管直径也较假手术组显着降低(P＜0.05);再灌注24h后,与Ⅱ组相比,Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ组脑组织血浆容量、血管直径和血管节段长度均显着升高(P＜0.05),与Ⅷ组相比,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ和Ⅶ组缺血侧的脑血浆容量均明显降低(P＜0.05)。与Ⅲ组或Ⅳ组相比,Ⅴ组的所有检测指标均无显着性差异。结论:通过本研究,我们得出以下结论:1.在局灶性脑缺血-再灌注损伤大鼠,缺血后处理、缺血远隔后处理和大剂量纳洛酮后处理均具有显着的神经保护作用,表现为脑梗死减少和神经功能障碍改善。2.联合应用缺血后处理和缺血远隔后处理并不显着增强对局灶性脑缺血-再灌注损伤的保护作用。3.纳洛酮后处理的神经保护作用只有在大剂量(10 mg/kg)下才能得以体现。4.联合应用缺血后处理、缺血远隔后处理和大剂量纳洛酮后处理这叁种措施可进一步增强后处理的神经保护作用。5.后处理可显着增加缺血脑组织的血浆灌注,并且其神经保护效应与MAP2蛋白表达增强高度相关。
汤波[10]2016年在《远隔缺血后适应对脑缺血后神经因子表达的影响》文中进行了进一步梳理目的:应用大鼠大脑中动脉缺血/再灌注模型模拟人类缺血性疾病,研究远端肢体缺血后适应对脑缺血后神经因子表达的影响。方法:将54只SD雄性大鼠随机分为3大组:假手术组(仅暴露右侧颈总、颈内、颈外动脉,不行大脑中动脉闭塞及肢体远隔缺血后适应操作),模型组(应用线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞模型,90min后给予再灌注,不给予肢体远端缺血后适应操作),实验组(在大脑中动脉闭塞模型90min后行再灌注时给予肢体远端缺血后适应操作)。模型组在再灌注后24h、72h、4w不同时间点分3个亚组,实验组在再灌注行肢体远端缺血后适应操作后24h、72h、4w不同时间点分3个亚组。运用Bederson神经功能评分法对每只大鼠进行评分及留取脑组织、脑脊液、血液标本,并采用酶联免疫法测定以上标本中MMP-9、VEGF、BDNF及GDNF的表达量。结果:1、实验组大鼠24h、72h亚组Bederson评分较模型组评分减低,差异有统计学意义(P<0.05)。2、实验组大鼠脑组织、脑脊液、血液各标本中检测到的VEGF、BDNF、GDNF量均较模型组量高,MMP-9量较对照组低,差异均有统计学意义(P<0.05),且差异在24h亚组更明显。3、Western Blot检测24h亚组各组大鼠脑组织、脑脊液、血液中VEGF、BDNF、GDNF量实验组多于模型组,而MMP-9量低于模型组。结论:1、肢体远端缺血后适应能减少脑缺血后大鼠神经功能评分。2、远隔缺血后适应对脑缺血后保护作用的机制之一可能为VEGF、BDNF、GDNF等神经保护物质的增多及MMP-9等神经损伤因子的减少。
参考文献：
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[8]. 氧糖剥夺后处理在氧糖剥夺—再灌注损伤中的保护作用及可能机制[D]. 田向阳. 河南大学. 2013
[9]. 缺血后处理、缺血远隔后处理和纳洛酮后处理对大鼠局灶性脑缺血—再灌注损伤影响的实验研究[D]. 刘毅. 中国协和医科大学. 2008
[10]. 远隔缺血后适应对脑缺血后神经因子表达的影响[D]. 汤波. 遵义医学院. 2016
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