路义鑫, 郭昭林, 宋铭忻, 李冬梅[1]2004年在《旋毛虫分子分类和49ku结构基因在昆虫细胞中表达研究》文中认为18S rRNA 基因是一类编码核糖体小亚基RNA、长约1800bp 的DNA 序列,由于在生物体内含量较大占80%左右,且在进化过程中非常保守,核苷酸的替换率较低,因而它是探讨生物高级分类群系统演化的难得工具之一。本实验克隆并比较了旋毛虫5个隔离种的18S rRNA 基因序列,分析他们的同源性,为旋毛虫的分类和诊断开辟了新的途径。旋毛虫排泄分泌(Excretory-Secretoryantigen,ES)抗原,即旋毛虫生长过程中的排泄分泌产物,是旋毛虫检测和免疫的良好抗原。本实验将本地毛形线虫(Trichinella nativa)ES 抗原的49ku 结构基因构建到杆状病毒表达载体上,并在昆虫细胞中得到表达。
李冬梅[2]2004年在《旋毛虫分子分类和49ku结构基因在昆虫细胞中表达研究》文中研究表明18S rRNA基因是一类编码核糖体小亚基RNA、长约1800bp的DNA序列，由于在生物体内含量较大占80%左右，且在进化过程中非常保守，核苷酸的替换率较低，因而它是探讨生物高级分类群系统演化的难得工具之一。本实验克隆并比较了旋毛虫5个隔离种的18S rRNA基因序列，分析他们的同源性，为旋毛虫的分类和诊断开辟了新的途径。旋毛虫排泄分泌（Excretory-Secretory antigen，ES）抗原，即旋毛虫生长过程中的排泄分泌产物，是旋毛虫检测和免疫的良好抗原。本实验将本地毛形线虫（Trichinella nativa）ES抗原的49ku结构基因构建到杆状病毒表达载体上，并在昆虫细胞中得到表达。本实验以NCBI中U60231序列为参考，设计并合成引物，用改进AGPC方法结合Trizol LS试剂盒提取旋毛虫总RNA，用分光光度计检测RNA的质量。然后用特异性引物, 对旋毛虫标准隔离种旋毛形线虫（Trichinella spiralis）和本地毛形线虫，以及分离自黑龙江省的猪旋毛虫、犬旋毛虫和猫旋毛虫5个旋毛虫隔离种进行RT-PCR扩增目的基因18S rRNA片段，均扩增出1800bp左右的基因片段。将目的基因与克隆载体pMD18-T 连接，转化大肠杆菌JM109中，筛选阳性重组子，并将阳性质粒送有关生物公司测序，同时在哈尔滨兽医研究所生物技术重点实验室也进行测序。用DNAstar和Genedoc软件分析结果显示，18S rRNA 基因的种间同源性很高，均在99%以上。猪旋毛虫与旋毛形线虫的同源性为99.4%，犬旋毛虫与本地毛形线虫的同源性为99.3%，猫旋毛虫与旋毛形线虫比与本地毛形线虫的同源性要略高0.4%。因此，猪旋毛虫与旋毛形线虫，犬旋毛虫与本地毛形线虫的亲缘关系更近，这与传统分类学的结果相符合。本地毛形线虫和猪旋毛虫的18S rRNA基因序列已经提交GeneBank，序列号分别为AY487254和AY497012。这为旋毛虫分类学的研究开创了一种新的方法和思路。根据BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统的供体质粒，设计表达引物，从克隆质粒上扩增本地毛形线虫49ku ES结构基因，酶切后与供体质粒连接，在大肠杆菌中克隆，将克隆有外源基因的供体质粒转化DH10Bac感受态细胞，该细胞含有杆状病毒穿梭载体，供体质粒中的外源基因在辅助质粒编码的转座酶作用下，通过转座而插入杆状病毒基因组中，筛选含有重组质粒的Bacmid DNA，用脂质体介导法转染昆虫细胞获得重组病毒。SDS-PAGE电泳显示表达蛋白为36ku的融合蛋白，将表达产物进行Western blot检测，可以被小鼠旋毛虫的阳性血清识别。实验结果表明，旋毛虫的ES抗原在诊断和免疫方面具有很好的应用前景。
李冬梅, 王秀荣, 路义鑫, 马广鹏, 花丽茹[3]2008年在《本地毛形线虫49 ku ES蛋白结构基因在昆虫细胞中的表达》文中指出根据BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统的供体质粒,设计表达引物,从克隆质粒上扩增本地毛形线虫(Trichinella nativa)49kuES结构蛋白基因TNPG,酶切后与供体质粒连接,在大肠杆菌中克隆,将克隆有外源基因的供体质粒转化DH10Bac感受态菌,该菌含有杆状病毒穿梭载体,供体质粒中的外源基因在辅助质粒编码的转座酶作用下,通过转座而插入杆状病毒基因组中,筛选含有重组质粒的Bacmid DNA,用脂质体介导法转染昆虫细胞获得重组病毒。SDS-PAGE电泳显示表达蛋白为36ku的融合蛋白,Western blot检测表明表达的融合蛋白能够被小鼠旋毛虫的阳性血清识别。实验结果表明,本地毛形线虫的ES融合蛋白的制备将在诊断方法的建立和免疫研究方面具有很好的应用前景。
参考文献：
[1]. 旋毛虫分子分类和49ku结构基因在昆虫细胞中表达研究[C]. 路义鑫, 郭昭林, 宋铭忻, 李冬梅. 中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第五次代表大会暨第八次学术研讨会论文集. 2004
[2]. 旋毛虫分子分类和49ku结构基因在昆虫细胞中表达研究[D]. 李冬梅. 东北农业大学. 2004
[3]. 本地毛形线虫49 ku ES蛋白结构基因在昆虫细胞中的表达[J]. 李冬梅, 王秀荣, 路义鑫, 马广鹏, 花丽茹. 中国预防兽医学报. 2008