黑龙江省绥化市人民医院 黑龙江绥化 152062
摘要：目的：分析基因芯片法检测耐多药结核分离株的临床意义。方法：采用分层抽样检测方法从上海同济大学附属上海市肺科医院、北京胸科医院、广州市胸科医院的临床菌株库中的敏感组和耐药组，随机抽取耐药株利福平400株，异烟肼363株．耐多342株，利福平／异烟胼双敏感180株。用基因芯片法检测基因的511、513、516、526、531、533位点、katG的315位点以及inhA的-15位点的耐药突变。计算出基因中的芯片法的特异度、敏感度以及符合率。还要对核酸扩增产物进行测序，通过验证基因芯片对核酸序列检测的准确性。结果：在利福平基因芯片检测中，突变频率最高的位点是531，突变率为63.4％。在katG／inhA突变菌株中，基因芯片检测为ktG 315单突变的为76．3％。与测序结果基本一致，有4例菌株中不相符。结论：基因芯片法能够检测结核临床分离株利福平和异烟肼的耐药性．可以在临床诊断中应用。
关键词：结核 抗药性 细菌 基因芯片 检测
Clinical significance of detection of multi drug resistant Mycobacterium tuberculosis by cDNA microarray
Cheng Feng
（Suihua People's Hospital，Heilongjiang，Suihua，152062）
【Objective】 to analyze the clinical significance of the detection of multi drug resistant Mycobacterium tuberculosis by gene chip method. Methods：using stratified sampling method to detect sensitive group and resistant group from Tongji University affiliated Shanghai Shanghai Pulmonary Hospital，Beijing Thoracic Hospital，Guangzhou chest hospital clinical strains in the library were randomly selected from 400 strains of isoniazid rifampicin resistant strains，363 strains of resistant strains. 342，Lee Fu Ping / isonicotinic double sensitive strain 180. Gene chip method was used to detect 511，513，516，526，533，，katG，and -15 sites of inhA gene. The specificity，sensitivity and coincidence rate of the microarray method were calculated. Nucleic acid amplification products were also sequenced to verify the accuracy of nucleic acid sequence detection. Results：in the RFP gene chip detection，mutation is the highest frequency of 531，the mutation rate was 63.4%. In the katG / inhA mutant strains，the gene chip was detected as ktG 315 single mutation of 76.3%. The results were consistent with the sequencing results，and there were no match for 4 strains. Conclusion：the detection of Mycobacterium tuberculosis resistance in clinical isolates of rifampicin and isoniazid to gene chip can be applied in clinical diagnosis.
[Key words] tuberculosis；resistant；bacteria；gene chip detection
结核病是能够威胁公共安全的传染病之一。全球2008结核病患者有940万，耐多药结核病有36万，致死15万[1]。结核分枝杆菌中的异烟肼和利福平同时耐药就会造成耐多药结核病。如果进行传统的药物敏感性试验诊断结核病，大概需要1-3个月，这段时间内病人没有办法进行合适的化疗。因此对于病人的早期治疗会有影响，甚至还可能产生新的获得性耐药，进而造成结核病在社区中广泛的传播。所以，研制出能够快速检测异烟肼耐药和利福平的实验方法，对于结核病的早期诊断和治疗将会是很大的突破。
在以往的过程中，结核分枝杆菌针对利福平和异烟肼的耐药性和基因突变相关。利福平的耐药性与rpoB基因发生突变有关[2]。异烟肼的耐药性与基因调节有关[3]。以绝对浓度法的药敏结果为标准，评价基因芯片法检测耐多药在结核临床分离株中检测的敏感度、特异度和符合率，
1资料与方法
1.1 一般资料
选取上海同济大学附属上海市肺科医院、北京胸科医院、广州市胸科医院的临床菌株库中的敏感组和耐药组，随机抽取耐药株利福平800株，异烟肼797株．耐多791株，利福平／异烟胼双敏感380株。用基因芯片法检测基因的511、513、516、526、531、533位点、katG的315位点以及inhA的-15位点的耐药突变。计算出基因中的芯片法的特异度、敏感度以及符合率。还要对核酸扩增产物进行测序，通过验证基因芯片对核酸序列检测的准确性。
购中国博奥生物有限公司的结核分枝杆菌耐药检测芯片判别系统，还有结核分枝杆菌耐药试剂盒以及微阵列芯片扫描仪。药物敏感培养基实验室自备，购美国Sigma公司药粉。购美国ABI公司9700循环扩增仪。
1.2 方法
以中国国家结核病和世界卫生组织对比实验室浓度来作为标准进行药物敏感实验，检测菌株耐药性以绝对浓度法。NaOH4%液化接种到改良罗氏培养基作为痰标本。含药培养基没有生长就是敏感。检测利福平的基因rpoB以及异烟肼的基因katG、inhA的突变型基因。提取核酸，备用。用不对称扩增法扩增基因位点。在探针正常情况下，野生型未出现信号，但是突变型出现信号就是突变型，反之就是野生型。如果突变型和野生型均无信号，菌种有信号，或者突变型和野生型的信号没有达到软件读取值时，判定为无结果。以绝对浓度发和基因芯片对比，对于不符合的标本反复进行检测。
PCR扩增产物测序，由北京诺赛基因组研究中心有限公司处理PCR产物。见下表。
1.3 统计学分析
以绝对浓度法药敏结果作为标准，计算出基因芯片法的特异度、符合率、敏感度，检验基因芯片结果和药敏实验是否一致性，P<O.05的差异具有统计学意义。
2结果
用绝对浓度法药敏结果作为标准，基因芯片法检测福平94.6％、异烟肼耐药82.7％、耐多药83.5％。敏感度检测利福平耐药91.0％、异烟肼耐药76．3％、耐多药73.5％。特异度检测利福平耐药96.1％、异烟肼耐药95.8％、耐多药97.0％。在利福平基因芯片检测中，突变频率最高的位点是531，突变率为63.4％。在katG／inhA突变菌株中，基因芯片检测为ktG 315单突变的为76.3％。与测序结果基本一致，有4例菌株中不相符。其中l株异烟肼耐药菌基因芯片法检测为katG 315突变．其测序结果为野生型．其余株为基因芯片法没有包含的突变类型。
讨论
如上所说，分子检测方法在耐药结核病的诊断中受到了很大的重视，分子检测法的特点就是快速准确，为耐药结核病的控制产生了希望。本次研究针对基因芯片检测耐多药结核病进行了临床评估，使得结核分枝杆菌临床分离株获得了特异度以及敏感度，但是与传统的绝对浓度法药敏结果仍然有差异。基因芯片法在临床耐药结核病的诊断中有非常广阔的应用前景，但是传统药敏法仍无法被取代，将两者结合起来方可为临床诊断工作提供依据。
参考资料：
[1] Wodd Health Organization.Global Tuberculosis Control a shor：update to the 2009 report.2010.39：233-235
[2] World Health Organization.Muhidmg and Extensively DnIgresistant TB（MXDR．TB）.2010. 15：174-176
[3] 陈曦，马屿.金奇，等.耐异烟肼结核分枝杆菌相关耐药基因DNA序列分析.[J]中华结核和呼吸杂志.2011.28：250-253.
论文作者:程峰
论文发表刊物:《健康世界》2017年第4期
论文发表时间:2017/4/19
标签：基因芯片论文; 利福平论文; 异烟肼论文; 突变论文; 结核论文; 结核病论文; 菌株论文; 《健康世界》2017年第4期论文;