李刚[1]2002年在《鸡传染性贫血的流行病学、病毒分离及其VP2基因表达的研究》文中指出本试验应用聚合酶链式反应(PCR)，酶联免疫吸附试验(ELISA)以及测量血细胞压积值(HCT)的方法对中国东北叁个省份进行了鸡传染性贫血病(chicken infectious anemia，CIA)的流行病学调查。结果各代次有鸡贫血病毒(chicken anemia virus，CAV)检出的鸡场占被检鸡场的比例分别是：祖代50.0％，父母代80.0％，商品代93.7％。 将来自现地疑为CAV感染的病鸡肝脏处理后，接种1日龄SPF雏鸡，14日后，实验鸡采血测量血细胞压积值(HCT)，剖检，并将发病鸡肝脏处理后接种MDCC-MSB1细胞。HCT，PCR以及间接免疫荧光试验(IFA)等实验结果显示我们分离到一株CAV病毒，命名为J0105株。 本研究根据已发表的CAV Cux-1株序列，设计了两对引物，从CAV J0105株感染的鸡肝脏中提取总DNA为模板，应用PCR方法扩增了两段DNA片段。将片段分别克隆到PMD18-T载体质粒中，并对其进行核苷酸序列测定和分析。结果表明，我们得到了J0105株全基因组序列，其基因高度保守，与Cux-1株，SJ1株以及荷兰弱毒株核苷酸同一性分别为97.8％，97.0％和96.6％。 根据文献报道又设计了一对扩增J0105株VP2基因的引物，将PCR扩增的VP2基因克隆到PMD18-T载体质粒上。然后经过酶切和连接，分别将VP2基因克隆至原核表达质粒PET-30b和杆状病毒表达质粒pFASTBACHTa，构建了PET30bVP2重组原核表达质粒和pFBHTaVP2重组杆状病毒表达质粒。以pFBHTaVP2质粒转化大肠杆菌DH10BAC感受态细胞，得到重组转座子rBacmidVP2。将重组转座子与脂质体共转染sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒rBacVP2。 将PET30bVP2和rBacVP2分别在大肠杆菌BL21株和sf9昆虫细胞中进行表达。SDS-PAGE电泳分析表明两种系统均成功表达了含VP2的重组蛋白。Western blot分析显示原核表达产物没有抗原性，而真核表达产物具有抗原性。 本研究为CIA的防制，诊断以及CAV基因工程疫苗的研制打下理论和实践基础。
雷小亚[2]2018年在《共表达鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗的研究》文中研究说明鸡传染性贫血(chicken infectious anemia,CIA)是由圆环病毒科环病毒属鸡传染性贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)引起的一种免疫抑制性疾病,主要感染20日龄以内的雏鸡,导致淋巴组织萎缩、再生障碍性贫血且常常伴随其它病毒、细菌或真菌的感染,给养禽业带来了巨大的经济损失。目前,尚无特效的药物治疗该病,疫苗防控早期感染是控制CAV的关键。CAV在鸡胚和MSB1细胞中的病毒滴度都较低,使得CAV灭活疫苗的生产成本很高,难以在养鸡业大量推广应用。使用CAV活疫苗存在垂直和水平传播的风险,不能推广应用。因此,及时进行CAV分子流行病学调查,掌握流行毒株基因组特点,制备新型基因工程疫苗是目前研究的主要方向。1、本研究于2016~2017年,从广东地区采集到56份疑似CAV感染的病料,经研磨反复冻融处理,通过PCR鉴定出12株为CAV。经过测序分析发现12株广东地区CAV分离株都处于Ⅰ分支且与本实验室分离的强度株KF224931进化关系较近。2、VP1蛋白是CAV主要的免疫原蛋白,也是唯一的衣壳蛋白,单独表达VP1蛋白机体产生的中和抗体较弱,只有在VP2蛋白的辅助下才能形成正确的抗原表位,诱导机体产生具有免疫保护作用的中和抗体。因此,以鸡痘病毒共表达VP1和VP2两个蛋白可提供较好的免疫保护。本研究将实验室分离的强度株KF224931的VP1和VP2基因克隆到pSY681鸡痘病毒转移载体启动子的下游,获得pSY681-VP1-VP2转移载体。用脂质体2000转染试剂盒将pSY681-VP1-VP2质粒转染已感染鸡痘病毒的细胞,发生同源重组有蓝斑出现,挑取蓝斑扩繁病毒,抽提重组鸡痘病毒DNA,PCR检测VP1和VP2基因已成功插入鸡痘病毒基因组,间接免疫荧光和Western Blot试验证明VP1和VP2基因成功在重组病毒中表达。3、本研究将10日龄SPF鸡随机分成4组,分别免疫rFPV-VP1-VP2重组疫苗、鸡传染性贫血弱毒苗、痘病毒疫苗以及空白对照,采集免疫后第7 d、14 d、21 d、28 d的外周血,用IDEXX的CAV抗体检测试剂盒检测试验鸡的抗体效价变化。试验结果显示,rFPV-VP1-VP2重组疫苗组的抗体水平显着高于空白对照组,但是低于CAV弱毒疫苗组。流式检测免疫后第七天外周血中CD_3~+、CD_4~+、CD_8~+T淋巴细胞亚群动态变化,结果显示:rFPV-VP1-VP2疫苗组外周血的CD_3~+、CD_4~+、CD_8~+T淋巴细胞含量显着高于空白组;rFPV-VP1-VP2疫苗组外周血的CD_3~+、CD_4~+T淋巴细胞含量显着高于rFPV组且两组之间CD_8~+T淋巴细胞含量差异不显着。以上结果表明:SPF鸡经过rFPV-VP1-VP2、rFPV疫苗免疫后引起了CD_4~+、CD_8~+T淋巴细胞的增加且rFPV-VP1-VP2疫苗免疫组更易引起CD_4~+T淋巴细胞的活化。
孙淑红[3]2003年在《中国传染性法氏囊病病毒野毒株致病性的流行病学研究》文中认为传染性法氏囊病(IBD)是一种危害幼龄鸡的一种急性、高度接触传染性疫病，其病原传染性法氏囊病病毒(IBDV)是一种双股RNA病毒。为了弄清我国各地流行的IBDV毒力程度，在3—7周龄SPF鸡进行人工感染的致病性试验，以此比较研究了1997—2001年期间从我国不同地区分离到的31个IBDV野毒株。结果表明，这些野毒株的毒力差异甚大。致病性最强的GX8／99可在易感年龄的SPF鸡引起70-92％的死亡率，是典型的超强毒。而人工接种YN2／99株的SPF鸡的死亡率几乎为零。其余毒株对SPF鸡的致死率则介于6—77％之间，但是所有毒株都能造成法氏囊和胸腺的显着萎缩。对具有不同致死率毒株的比较表明，近几年中，我国多数IBDV流行毒株的毒力都已远远超过标准毒IBDV，而接近超强毒。选择致病性最强的来自广西的GX8／99株，在对法氏囊悬液中病毒用鸡胚半数致死量(ELD_(50))定量测定后，在不同年龄的SPF鸡和商品代蛋用型坞多次重复地比较研究了该毒株的致病性。随鸡的日龄和接种剂量的不同，其致死率也有很大差异。对28-30日龄SPF鸡，病毒接种量为200个ELD_(50)时，感染后7日内死亡率最高可达60-90.5％(18／30和19／21)，感染量为20个ELD_(50)时死亡率亦可达53-92％(8／15和23／25)。以500个ELD_(50)感染28-104日龄期间SPF鸡，死亡率均在55.1％-67.2％。直至113-120日龄时，感染后仍有10-15％致死率。但在128日龄接种时，既不引起死亡也不表现任何症状，但都产生了抗IBDV抗体。人工种发病死亡鸡法氏囊出血程度随感染量和年龄而异。50日龄鸡接种2000个ELD_(50)后死亡的鸡，100％(12／12)的法氏囊严重出血，而在40日龄感染200个ELD_(50)后死亡鸡中，仅17％(3／18)发生出血。在2、3、4周龄带有母源抗 山东农业大学硕士学位论义（2003）体的商品代蛋鸡，u 2000个ELD50病毒接种后只引起 10o（2／20）、35O （7／20）和35o（7／20）的死亡率，但在5周龄时，随着母源抗体的消失，仅接触感染的致死率就可达 61．3％（98／1 60）。而在 4和 5周龄商品代蛋鸡人工接种200个ELD50病毒后，死亡率分别是sl．6－94．3％（62／76－33／35）和 93．9－94O（31／33－47／50）。通过在 1900多羽鸡的试验表明，GX－8／99株确实是一个超强毒IBDV毒株，表现为高死亡率（最高可达94％），易感年龄延长至4月龄，中枢性免疫器官法氏囊出血严重和胸腺明显萎缩。此外，GX－8／99株在 SPF鸡胚上增殖 2代的鸡胚毒（GX－8／99／HZ），每 0．lml含 ELD。。可达 10b，对鸡胚的致死率大大提高，但对 SPF鸡的致病力较囊毒显着降低。 为研究病毒的核酸分子结构与其致病性的关系，本研究选取了在致死率上不同的4个IBDV野毒株，比较了它们的VPZ基因高变区共494个碱基序列。结果表明，4个毒株对SPF鸡的致病性存在较大差异（G－94％之间），但VPZ基因高变区的变异较小。SD－l／97、SD－3／98、JS－30／99相互之间及其与＿IBDV参考株HK46间均具有相当高的同源性，结果似乎说明IBDV毒株的致病性与VPZ基因高变区变异的关系不大。 在SPF鸡分别比较研究了两个中等毒力IBDV疫苗接种后对法氏囊和胸腺的影响，以及对超强毒GX－8／99攻毒后的免疫保护力。结果表明，用于试验的两个中等毒力疫苗虽然在SPF鸡可引起法氏囊和胸腺不同程度的萎缩，但确实能够 100％保护己经免疫的 SPF鸡免于该超强毒 IBDV人工感染造成的死亡。而且，还能减轻该株病毒感染后诱发的法氏囊的炎症、出血和变性。这表明，在不受母源抗体干扰条件下，中等毒力的IBDV弱毒疫苗仍能诱发对IBDV超强毒株GX－8／99的有效的免疫保护作用。 通过对 24日龄 SPF鸡人工感染传染性贫血病病毒（CAV）、36日龄 一3 我国传染。性法氏囊病病毒野每株致病性的流行病学研究SPF鸡人工感染网状内皮增生病病毒（REV）、52日龄SPF鸡分别人工感染马立克氏病病毒（MDV）、CAV、REV、MDV＋REV＋CAV后不同天数，再用传染性法氏囊病病毒（IBDV）SD－3／98株做人工攻毒。结果表明，不同日龄的 SPF鸡在感染 MDV、CAV、REV、MDV＋REV＋CAV后对 IBDV强毒攻毒抵抗力下降。主要表现为在其它毒株共感染的作用下胸腺和法氏囊的萎缩程度更为严重，而引起死亡率的差异不甚明显。 这只是对几种病毒共感染对IBDV致病性的影响进行了初步探讨。关于 IR龄肉鸡感染其它免疫抑制病毒如 REV。J－ALV、REV＋J－ALV与IBDV共感染的试验正在进行之中。并且有待于在不同年龄不同间隔做更加深入的比较研究。
宇文延青[4]2008年在《我国部分地区传染性法氏囊病分子流行病学研究》文中研究说明本研究针对近年来我国鸡传染性法氏囊病防制过程中出现的免疫失败现象,对该病的分子流行病学进行了研究。从我国11个省(市、自治区)采集法氏囊病料68份,分离鉴定鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)21株。运用RT-PCR方法对VP2基因进行了扩增、测序、序列分析和遗传进化分析,结果表明:除SH-h株外,其余20株均具有IBDV超强毒株的分子特征,即222A、256I、294I和299S。核苷酸同源性比较表明:分离毒株与欧洲超强毒株UK661和我国超强毒株Gx株核苷酸同源率均在97.5%～99.4%;推导氨基酸同源在98.9%～100%。分离毒株间核苷酸同源率在96.7%～99.9%;推导氨基酸的同源率在98.2%～100%。以UK661为参考毒株,对分离毒株第一亲水区和第二亲水区推导氨基酸比较发现:SH-h株在222位发生A→P替换;HLJ-1、HLJ-2、HLJ-3和HLJ-4在第一亲水区的212位发生D→N替换,HLJ-3和HLJ-4株在第二亲水区321位氨基酸发生A→V替换,且血清I型IBDV均起源于同一祖先序列,所有分离毒株均位于vvIBDV进化群内。遗传距离表明:进化顺序为经典毒株、变异株,最后出现的是vvIBDV。以7株抗IBDV VP2单克隆抗体介导的间接ELISA方法对Gx、HLJ-2株和HLJ-4株3株病毒的抗原性进行分析,结果表明:HLJ-2、HLJ-4和Gx在抗原上存在着一定差异。在此基础上,用HLJ-4株和Gx株对传染性法氏囊活疫苗(Gt株)的免疫保护力进行检验,结果表明:传染性法氏囊活疫苗(Gt株)免疫SPF鸡群能抵抗超强毒株Gx和HLJ-4的攻击,SPF鸡保护率达100%。从山东、甘肃、江苏和辽宁等地的7个鸡场采集349份血清,对禽类叁种重要的能引起免疫抑制的病毒(CAV、ALV-J和REV)进行了血清学调查,结果显示:CAV的血清阳性率高达81.4%,表明CAV在我国的一些鸡场普遍存在。为进一步研究CAV感染对传染性法氏囊病疫苗的影响,将80羽1日龄SPF雏鸡随机分为5组,即Gx攻毒对照组(A组)、感染组(B组)、Gt株免疫组(C)、感染-法氏囊活株疫苗(Gt株)免疫组(D组)和空白对照组(E组),每组16羽,B组和D组在1日龄人工肌注感染病毒CAV-M9905株;7日龄,用鸡传染性法氏囊病活疫苗(Gt株)口服免疫C组和D组雏鸡;14日龄、20日龄和28日龄翅静脉采集分离血清,用ELISA试剂盒检测IBDV抗体水平,在28日龄对A、B、C和D组通过滴鼻点、点眼途径攻IBDV超强毒株Gx(ELD50=102.72/0.1ml),0.1ml/羽,攻毒后连续观察2周。结果表明:CAV感染使IBDV活疫苗(Gt株)的免疫保护率降低,抗体滴度上升缓慢。
陈绍平[5]2008年在《鸡贫血病毒VP1、VP2基因在毕赤酵母中的共表达、及重组蛋白的分析》文中研究指明鸡贫血病毒(CAV)是圆环病毒科,环形病毒属的唯一病毒。主要侵害雏鸡的骨髓造血组织、胸腺、法氏囊等淋巴组织,致使雏鸡发生造血障碍和免疫抑制,对传染性病原体的易感性升高。CAV基因组共编码叁种蛋白:衣壳蛋白VP1、其伴侣蛋白VP2、细胞凋亡素VP3。其中,VP1是主要的结构蛋白;VP2是辅助蛋白,辅助VP1折迭成正确的构象。CAV VP1和VP2蛋白能够刺激机体产生中和性表位,诱发中和反应,作为抗原蛋白用于研制防治鸡传染性贫血病(CIA)的重组基因工程疫苗。本研究将重组质粒pPIC9K-VP1和pPIC9K-VP2共同转入毕赤酵母GS115细胞中,通过带G418抗性平板的筛选获得阳性重组菌株,然后进一步对菌株进行PCR鉴定和甲醇诱导表达鉴定,通过对PCR鉴定结果,及对甲醇诱导表达蛋白的SDS-PAGE电泳结果的综合分析,确定获得的融合蛋白CAV VP1能够分泌表达,融合蛋白CAV VP2须经酵母细胞在破碎后释放;同时Dot-ELISA试验结果表明,得到的CAV VP1-VP2融合蛋白可以和CAV VP1及VP2单克隆抗体结台,并印证了非结构蛋白CAV VP2在病毒粒子组装过程中的重要辅助作用,结合Western blot试验结果说明,结构蛋白CAV VP1的表位是构象依赖型表位。实现了CAV VP1、CAV VP2在同一GS115酵母细胞中的共表达,成功构建了重组毕赤酵母基因工程菌GS115pPIC9K/CAV VP1-VP2株。将构建的GS115 pPIC9K/CAV VP1-VP2菌株进行小规模高密度发酵试验。通过优化发酵条件与目的蛋白表达产量的关系,确定重组毕赤酵母基因工程菌株表达CAVVP1及CAV VP2蛋白的最佳发酵条件为:30℃,pH 5.0,溶氧(DO)值40%,甲醇补料速度为7.5 ml/L·h,经72 h诱导后,最终OD_(600)值可达到1200或更高,表达蛋白保存于-20℃。将5升基础盐发酵培养基(FBS)的发酵产物超高压破碎后,进行紫外分光光度计测量和聚丙烯酰胺凝胶薄层扫描,结果显示:目的蛋白CAV VP1-VP2的表达量为34.2mg/ml,占到菌体总蛋白量的30%:表明CAV VP1及CAV VP2蛋白在小规模高密度发酵试验中获得了高水平表达,实现了该菌株在廉价基础盐培养基中的高密度发酵,获得了高表达、高稳定性的CAV VP1和CAV VP2蛋白,充分发挥了毕赤酵母这一真核表达系统的优越性。按既定工艺进行了含有由GS115 pPIC9K/CAV VP1-VP2菌株表达的CAV VP1、CAVVP2蛋白的基因工程疫苗的发酵生产,发酵浓缩得到的产物制成疫苗,并对其进行安全性试验及免疫效力效力试验。将疫苗稀释成不同浓度,胸肌注射免疫10日龄SPF雏鸡,每组5只,观察21d后剖检,结果显示,该疫苗安全;将疫苗稀释成不同浓度,胸肌注射免疫10日龄SPF雏鸡,每组10只,对免疫前和免疫后采集保存的血清进行ELISA检验,结果显示,不但在免疫组血清中检测到抗体,而且抗体滴度随雏鸡日龄的增长呈上升趋势;同时,IFA检验结果显示,免疫组制得的多克隆抗体可以和感染CAV的MDCC-MSB1反应,可见较强荧光;免疫3周后进行CAV强毒攻毒,观察21天后剖杀,进行病理观察及切片检查,结果显示,对照组雏鸡的脏器有明显的病理变化,而免疫组的雏鸡无明显病理变化,PCR方法诊断结果为CAV阳性。以上检验结果表明,该疫苗具免疫效力,能够表现出较好的免疫保护性,为日后此种疫苗的工厂化生产创造了良好的条件。
杨宵玥[6]2018年在《鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因转移载体的构建及其在293T细胞中的表达》文中研究说明鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的雏鸡的一种高度接触性病毒性传染病,自1962年报道以来,世界上主要养禽国家和地区均有流行,给养禽业带来严重的经济损失。目前,IBD防控的主要手段是采用疫苗进行免疫接种,使易感雏鸡获得主动或被动免疫保护,因此疫苗的研发对临床上IBD的防控起着至关重要的作用。虽然各国均有较好的商品化疫苗,但由于IBDV抗原的变异以及超强毒株的出现,商品化疫苗的抗原性与流行毒株不能完全匹配,临床上免疫失败的情况时有发生,因此迫切需要快速研发与临床流行毒株相匹配的新型疫苗用于IBD的防控。通过基因工程技术开发亚单位疫苗是近年来IBD疫苗的研究热点。相比全病毒灭活疫苗而言,亚单位疫苗生产成本低,能够快速与流行毒株抗原结构相匹配,且无潜在的生物安全风险。VP2蛋白是IBDV具有中和活性的主要保护性抗原,由于其具有良好的免疫原性和稳定性,是IBD亚单位疫苗研究的重点。通过真核生物系统表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,但目前为止,还没有通过真核表达系统研制的商品化VP2亚单位疫苗。首先,本研究为了建立表达IBDV-VP2蛋白的真核表达系统,通过特异引物扩增IBDV-HB96超强毒株的VP2基因,将其与真核表达载体pCAGGs相连,成功构建了VP2基因重组真核表达质粒pCAGGs-VP2,利用高效脂质体转染试剂,将pCAGGs-VP2质粒转染293T细胞,通过间接免疫荧光方法进行检测,结果表明VP2蛋白能够在293T细胞中正确表达,从而成功建立了VP2蛋白真核瞬时表达系统,实现了VP2蛋白的瞬时表达。其次,为进一步获得稳定表达VP2蛋白的哺乳动物细胞系,将VP2基因插入到携带绿色荧光基因的慢病毒载体pHB中,构建含绿色荧光蛋白的pHB-VP2转移载体,利用脂质体将慢病毒包装所需的叁种质粒pHB-VP2、pX、pG共同转染293T细胞,获得了表达绿色荧光蛋白的阳性细胞,将细胞用有限稀释法进行克隆,筛选出含绿色荧光蛋白的单个293T细胞克隆进行扩大培养,获得了一株293T-VP2细胞株。通过对不同传代代次细胞进行基因检测和荧光显微镜观察,各代次细胞均能检测到VP2特异基因,且荧光强度也没有明显差异,该结果表明通过慢病毒包装系统获得的293T-VP2细胞株是稳定的。因此,通过本论文研究,我们成功构建了表达VP2蛋白的瞬时表达系统,同时也成功构建了稳定表达IBDV VP2蛋白的293T-VP2细胞株。为进一步开展VP2蛋白的结构和功能研究、IBDV亚单位疫苗和DNA疫苗的研究奠定了基础。
林欢[7]2008年在《鸡贫血病毒VP1、VP2基因在巴斯德毕赤酵母中的表达及产物免疫保护性研究》文中研究说明本研究根据GenBank已公布的CAV的VP1和VP2基因序列,利用Oligo6.0分子生物学软件分别设计扩增引物,从已构建的载体pBluemCAV重组质粒中分别扩增出VP1及VP2基因,并将扩增出的片段插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,分别构建成重组质粒pPIC9K-VP1和pPIC9K-VP2,将构建好的载体均用SalⅠ线性化后,分别转化给酵母SMD1168细胞,经PCR鉴定、甲醇诱导表达、SDS-PAGE、Dot-Elisa和Western blot试验,结果表明:CAV VP1基因能够分泌表达,在约50KD处出现特异带,经紫外分光光度计测量,重组VP1蛋白在上清中的含量约为15μg/ml;VP2基因经破碎酵母细胞,释放胞内蛋白,在约30KD处出现特异带;经凝胶分析仪分析,紫外分光光度计测量,VP2蛋白占酵母总蛋白的21%。表达蛋白量约为25μg/ml,均属于高效表达。Dot-Elisa结果显示被检重组蛋白CAV VP1及CAV VP2都出现特异性颜色反应;免疫印记试验表明重组蛋白CAV VP1能够与针对CAV VP1的单克隆抗体反应,在50KD处出现特异带,具有良好的反应原性,重组蛋白CAV VP2与针对CAV VP1的单克隆抗体未见反应。分别将重组CAV VP1、CAV VP2蛋白乳化后,免疫6周龄BALB/c鼠,分离血清,Elisa试验结果显示所得血清分别可以与全病毒反应;IFA试验免疫重组蛋白CAV VP1制得的多克隆血清可以和感染CAV的MDCC-MSB1反应,而VP2没有反应。本研究优化了发酵条件与表达产量的关系,确定重组酵母表达CAV VP1及CAV VP2蛋白的最佳条件为:30℃,pH 6.0,溶氧值40%,空气流量1.25 vvm,当确定甘油耗尽时,通过分批补料的方式进行甲醇补料,诱导表达,最终OD600可达到250或更高,通过比较不同温度下保存重组蛋白的降解率得出表达蛋白保存于-20℃。这一工作为CAV VP1及CAV VP2蛋白的大规模发酵表达和应用打下了良好的基础。将发酵表达的重组蛋白CAV VP1、CAV VP2经薄层胶扫描、紫外分光光度计定量后,与等体积FREUND’SADJUVANT(SIGMA公司)乳化后,分为对照组、CAV VP1、CAV VP1+CAV VP2叁组,分别胸肌注射10日龄CAV阴性SPF雏鸡,免疫前后均采血,分离血清,Elisa试验显示免疫3周CAV VP1+CAV VP2组可检测到抗体,直到4周CAV VP1+CAV VP2组抗体滴度有所升高,5周达到最高滴度,6周后抗体滴度成平稳趋势,CAV VP1组3周可检测到较低抗体,之后抗体水平未见升高,对照组成阴性反应;IFA试验结果表明CAV VP1+CAV VP2组免疫3周后可检测到微弱的中和抗体,4周后可见较强荧光,CAV VP1组和对照组均未见到荧光。同时将乳化后的重组蛋白CAV VP1、CAV VP2分为对照组、CAV VP1、CAV VP1+CAV VP2叁组,分别胸肌注射无免种鸡,监测血清及卵黄抗体滴度,Elisa结果显示CAV VP1+CAV VP2组5周血清和卵黄抗体水平同时达到最高,之后波动较小,CAV VP1组及对照组血清和卵黄抗体水平均无明显波动;对免疫后2周孵化雏鸡1日龄攻毒(CAV),对照组攻毒13天增重有明显下降;分别于攻毒后7、14、21天时剖检,进行病理切片检查,免疫CAV VP1试验组和对照组胸腺淋巴细胞坏死、减少,伴有出血、髓质内浆析出;肝细胞空泡变性、小血管淤血;脾脏鞘动脉增生、周围有少量淋巴细胞围绕。免疫CAV VP1+CAV VP2试验组无明显变化。
曾祥伟[8]2003年在《鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株的致弱研究》文中指出本研究是中国—欧盟合作项目(ERBIC18CT980330)：“鸡传染性法氏囊病的流行病学、病毒基础及疫苗的改进”的一部分。目的在于通过对按OIE及欧盟标准分离鉴定的中国vvIBDV-GX株的致弱研究来揭示鸡传染性法氏囊病超强毒毒力的分子基础。 本研究成功将鸡传染性法氏囊病超强毒vvIBDV Gx株通过SPF鸡胚的快速培育及鸡胚成纤维细胞传代致弱，揭示了vvIBDV超强毒向弱毒转化过程中，主要结构蛋白VP2基因核苷酸及推导的氨基酸序列的变化规律。对不同代次细胞毒进行了序列分析，发现细胞毒在第7代以前，VP2基因序列没有改变，与欧洲标准超强毒氨基酸同源性达100％；细胞毒第8代，有个别核苷酸发生了改变，但氨基酸序列没有改变；细胞毒第9代是变化复杂的一代；10代毒VP2基因与欧洲标准弱毒Cu-1氨基酸序列同源性达97％；以后的细胞适应毒至20代，其VP2基因序列不再改变。致病性实验表明原代毒对4周龄SPF鸡致死率为64％，细胞5代毒仍具有超强毒的特征，接种4周龄SPF鸡，死亡率仍达60％；而15，20代毒对鸡无致病性，20代毒在鸡体内连续传代6代不返强。 我们对细胞毒第9代(CEF-9)的分子生物学及生物学特性进行了研究，结果表明其VP2基因序列既具有超强毒的特征，又兼有部分致弱毒的特征，其致病性介于超强毒株和致弱株之间；在体内外均不稳定，体外继续传代可继续致弱，回归体内可迅速返强。这说明CEF-9是vvIBDV驯化过程中，毒力强弱转化的中间过渡形式。 本研究证明，超强毒经过培育，可以由超强毒株演变成不稳定的中间株，再继续演变成稳定的致弱株。此研究为IBDV毒力变异规律的深入研究打下了物质和理论基础。
潘群兴, 朱向东, 欧阳伟, 王晓丽, 夏兴霞[9]2013年在《鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因密码子的优化及其在大肠杆菌中的表达》文中指出为了提高鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因在大肠杆菌中的表达量,分析近期引起安徽免疫失败IBD病例中分离的强毒分离株AH1株的VP2基因,发现有49个稀有密码子,其中编码Arg(R)的有16个,编码Gly(G)的有6个。编码精氨酸的AGG(AGA)2个稀有密码子紧密相连(R区),另外还有2个相对比较集中的GGG密集区(G区)。根据大肠杆菌密码子使用频率对IBD强毒分离株(AH1株)VP2基因进行改造并合成优化基因,命名为mVP2。将mVP2基因分别克隆到pET-32a及pBV220原核表达质粒,构建了含密码子优化型IBDV VP2基因的原核表达质粒pET32-VP2和pBV220-VP2。SDS-PAGE结果显示,优化基因mVP2在大肠杆菌中的表达较野生型基因有十分显着的提高。Western-blot检测到目的蛋白能够与鸡抗IBDV超免疫血清反应。本研究为开展VP2基因结构与功能的深入研究及IBD免疫预防和快速诊断奠定了理论基础。
王笑梅[10]2002年在《鸡传染性法氏囊病中国超强毒株的培育致弱及亚单位疫苗的研究》文中认为本研究从国内分离鉴定了鸡传染性法氏囊病超强毒，并将其成功地培育、致弱，揭示了vvIBDV从超强毒力向弱毒力转化过程中，其主要结构蛋白vp2基因序列的变化过程，同时得到了能在鸡胚成纤维细胞上增殖的、具有较强致病性的超强毒株和具有较好免疫原性的致弱株。将超强毒的Vp2基因经毕赫氏(Pichea)酵母表达系统进行高效表达，表达蛋白具有良好的免疫原性，以其为免疫原成功研制了亚单位疫苗。研究成果将为IBD的有效防制提供先进的、可靠的技术支撑。 本研究参与中国—欧盟合作项目(ERBIC18CT980330)：“鸡传染性法氏囊病的流行病学、病毒基础及疫苗的改进”。按OIE及欧盟标准，将从我国广西IBD发病鸡群中分离的IBD野毒，经致病性、抗原性及基因序列分析等叁个方面的研究鉴定，确定其为IBD超强毒株。该毒株对4周龄SPF鸡的致死率为60％以上，抗原性试验和序列分析表明，其具有超强毒的特征，并且与欧洲标准超强毒UK661的亲缘关系较近，主要结构蛋白核苷酸同源性为99％，氨基酸同源性为100％。在合作研究中，欧盟研究人员与中国研究人员共同确定其为vvIBDV中国标准株，命名为vvIBDV-GX。为我国IBD与IBDV的研究提供了与国际接轨的标准。 对vvIBDV-GX株进行了SPF鸡胚的快速培育及细胞传代致弱，对各代次细胞毒进行了序列分析和生物学实验，发现细胞毒在第7代以前，Vp2基因序列没有改变；细胞毒第8代，有个别核苷酸发生了改变，但没有影响氨基酸序列；细胞第9代，具有超强毒特征的第222位的丙氨酸和七肽区中第叁个丝氨基酸变成了具有弱毒特征的脯氨酸和精氨酸；10代细胞毒的Vp2基因序列与欧洲标准弱毒氨基酸序列同源性在97％以上，再继续传至20代，Vp2基因序列基本上没再发生改变。生物学实验也表明，细胞5代毒具有超强毒的特征，接种4周龄SPF鸡，死亡率达60％；而20代毒对鸡无致病性，在鸡体内连续传代6代不返强。5代毒和20代毒均可在鸡胚成纤维细胞上增殖，毒价均达到2.0×10~8PFU／ml以上。本研究证明，超强毒经过培育，可以由超强毒株演变为不稳定的中间株，再继续演变为稳定的致弱株。5代毒灭活后，仍具有较好的免疫原性，1千万PFU／只的剂量的灭活毒接种SPF鸡，可使免疫鸡对超强毒的保护率达到100％。20代毒对鸡无毒力，却有较强的免疫原性，接种后，可使免疫鸡产生特异性抗体，抗体阳性率达100％，并能有力地抵抗超强毒的攻击。本研究中培育的细胞5代毒可以作为灭活疫苗的种毒，20代毒可以作为弱毒疫苗的种毒。 用OLIGO软件设计引物，以插入vvIBDV-GX Vp2基因的PUC19为模板，扩增出1.5KB的片断；将此片断亚克隆到酵母表达载体(PpiczA)上，将构建好的载体(PpiczA-Vp2)用Sacll线性化后，转染酵母GS115细胞；经PCR鉴定、表型鉴定，筛选酵母重组子，SDS-PAGE电泳，在41KD处出现表达蛋白带；经小规模甲醇诱导表达，筛选出高表达菌株，经调整、优化诱导时间、温度、摇动培养的转速、甲醇含量等各项技术参数，在温度28℃、转速220rpm、甲醇含量0.5％的条件下，诱导120小时时，表达蛋白的琼扩试验出博士学位论文 鸡传染性法氏囊病中国超强毒株的培育致弱及亚单位疫苗的研究现特异性沉淀线，D。卜＊u8A iKI＆出现特异性颜色反应，表达量达到26％，属于高效表达。表达蛋白与白油佐剂以1：1．5的比例乳化，制成亚单位疫苗，免疫SPF鸡后，可产生特异性抗体，0．3mgi只的剂量免疫后，中和抗体滴度可达1：1000以上，并可保护免疫鸡抵抗vvlnDV的致死性攻击，保护率达90％。
参考文献：
[1]. 鸡传染性贫血的流行病学、病毒分离及其VP2基因表达的研究[D]. 李刚. 中国农业科学院. 2002
[2]. 共表达鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗的研究[D]. 雷小亚. 华南农业大学. 2018
[3]. 中国传染性法氏囊病病毒野毒株致病性的流行病学研究[D]. 孙淑红. 山东农业大学. 2003
[4]. 我国部分地区传染性法氏囊病分子流行病学研究[D]. 宇文延青. 中国农业科学院. 2008
[5]. 鸡贫血病毒VP1、VP2基因在毕赤酵母中的共表达、及重组蛋白的分析[D]. 陈绍平. 四川农业大学. 2008
[6]. 鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因转移载体的构建及其在293T细胞中的表达[D]. 杨宵玥. 中国兽医药品监察所. 2018
[7]. 鸡贫血病毒VP1、VP2基因在巴斯德毕赤酵母中的表达及产物免疫保护性研究[D]. 林欢. 中国农业科学院. 2008
[8]. 鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株的致弱研究[D]. 曾祥伟. 东北农业大学. 2003
[9]. 鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因密码子的优化及其在大肠杆菌中的表达[J]. 潘群兴, 朱向东, 欧阳伟, 王晓丽, 夏兴霞. 中国兽医科学. 2013
[10]. 鸡传染性法氏囊病中国超强毒株的培育致弱及亚单位疫苗的研究[D]. 王笑梅. 东北农业大学. 2002
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