江西省人民医院骨科 33006
摘要：目的 明确PAK5在骨肉瘤细胞系中的具体作用及分子机制，探索PAK5作为肿瘤新靶点的可能。方法 通过体外培养SaOS-2细胞，筛选出稳定的DOX耐药株，向已获得的耐药株内转染siRNA PAK5，分为四组细胞，为SaOS-2、SaOS-2-DOX、对照 siRNA- SaOS-2-DOX、siRNA PAK5- SaOS-2-DOX四组。采用 CCK-8 法检测细胞活性；WB 法检测Caspaes-3和Caspaes-9及PAK5的蛋白表达水平；流式细胞仪检测Rh123 染料在各组细胞内的聚集，然后进行统计学处理。结果 SaOS-2、SaOS-2-DOX细胞活性较好，后者显著大于前者，对照 siRNA- SaOS-2-DOX和siRNA PAK5- SaOS-2-DOX细胞活性无明显变化；WB 法结果显示，SaOS-2组和SaOS-2-DOX组、对照 siRNA- SaOS-2-DOX组三个蛋白的表达水平较高，siRNA PAK5- SaOS-2-DOX组的Caspaes-3、Caspaes-9及PAK5三个蛋白表达显著降低；Rh123染色结果显示siRNA PAK5- SaOS-2-DOX组荧光强度最大。结论 PAK5在SaOS-2细胞DOX耐药中起促进作用，缺乏PAK5细胞活性无明显变化，细胞凋亡水平显著降低，线粒体活性上升。
关键词：PAK5；骨肉瘤；DOX耐药；分子机制
骨肉瘤是骨肿瘤科常见疾病，其来源于间质细胞，恶性程度高于大部分骨肿瘤。骨肉瘤预后很差，因为其容易转移，在术后常复发，给病人带来巨大威胁。近年来发现，PAK家族在SaOS-2细胞DOX耐药机制的产生中有重要作用，但是还没有具体的研究表明，本研究通过细胞实验，旨在表明PAK5的相关作用。
1 材料与方法
1.1 细胞株
SaOS-2细胞株主要购于上海中科院研究所，采用DEME高塘培养基进行培养。培养的气体环境为5%CO2恒温恒湿环境，液体环境为10%牛血清+DMEM高糖培养基。
1.2 主要试剂和仪器
DOX、N-乙酰半胱氨酸、Rh123购于sigma-aldrich西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。实时荧光PCR试剂盒、CCK8检测试剂盒、蛋白提取试剂盒购于北京天根生化有限公司；相关抗体购于美国CST公司（cell signaling technology）；仪器均由本地高校借用提供。
1.3 SaOS-2细胞DOX耐药细胞系的获取
通过设置不同梯度浓度的DOX药物处理SaOS-2细胞，筛选出稳定的SaOS-2细胞DOX耐药细胞系。具体方法为大剂量间隙处理，动态观察SaOS-2细胞的耐药性，最终获得SaOS-2细胞DOX耐药细胞系。
1.4 细胞活性检测
对于已经获取的SaOS-2、SaOS-2-DOX、siRNA- SaOS-2-DOX、siRNA PAK5- SaOS-2-DOX四组细胞，根据CCK-8试剂盒进行检测，相关步骤参见说明书。
1.5 蛋白半定量检测（Western blot，WB）
使用总蛋白提取试剂盒提取SaOS-2、SaOS-2-DOX、siRNA- SaOS-2-DOX、siRNA PAK5- SaOS-2-DOX各组细胞中的总蛋白，然后进行WB实验，大致流程为制胶、电泳、转摸、一抗、二抗和显影。将所得图片通过专业软件进行读取和半定量数据分析。
1.6 线粒体活性（Rh123染色）
根据Rh123试剂盒说明书进行染色，使用CytoFLEX S 流式细胞仪进行检测，设置激发光为488纳米，发射光为525纳米。记录各组细胞的平均荧光强度。
1.7 统计学检测
每组实验重复4次，结果使用SPSS22.0进行统计学检验，非定量结果使用“++”、“+”、“+++”进行表示，计数资料使用x ± s进行记录，使用t检验进行验证，定0.05为检验水准。
2结果
2.1细胞活性结果
SaOS-2、SaOS-2-DOX细胞活性较好，对照 siRNA- SaOS-2-DOX和siRNA PAK5- SaOS-2-DOX细胞活性无明显变化
表1 各组细胞CCK-8细胞活性检测
2.2 WB结果
表2 WB结果
WB 法结果显示，SaOS-2组和SaOS-2-DOX组、对照 siRNA- SaOS-2-DOX组三个蛋白的表达水平较高，siRNA PAK5- SaOS-2-DOX组的Caspaes-3、Caspaes-9及PAK5三个蛋白表达显著降低
2.3 Rh123染色结果
Rh123染色结果显示siRNA PAK5- SaOS-2-DOX组荧光强度最大。
3讨论
骨肉瘤根据其来源的不同分为很多种，其中，超过50%是来源于成骨细胞[1]。骨肉瘤好发于青年人，中老年人偶见。发现时，骨肉瘤常已经侵及大部分骨组织，患者临床症状明显，且伴有全身转移，尤其中肺部组织转移。影像学统计结果显示，长骨是青年人多发部位，其他部位较为罕见。
目前，针对骨肉瘤，除了手术切除，还是用化学药物进行治疗[2]。化疗初期，骨肉瘤体积减小明显，化疗中后期，大多数已经产生了耐药性。根据目前科学报道，骨肉瘤的化疗耐药性主要和MDR蛋白有关，MDR蛋白能够抑制胞内凋亡蛋白的活性，从而抑制骨肿瘤细胞凋亡[3]。研究结果显示PAK5能够显著增加细胞的DOX耐药性，抑制细胞凋亡，促进肿瘤细胞繁殖。
综上，PAK5对SaOS-2细胞DOX耐药有促进作用，可能是通过抑制细胞凋亡来获得耐药性。
参考文献：
[1]夏晨，金晶，苟晓莉，侯相瑜，王永涛，黄民.白藜芦醇四甲氧基衍生物提高耐药人乳腺癌细胞MCF-7/DOX对阿霉素的敏感性[J].中药药理与临床，2014，30（06）：45-48.
[2]张晔. 线粒体靶向/荧光多功能纳米平台和胶束的制备及其生物医用研究[D].安徽大学，2017.
[3]Xia Dong，Zhiting Sun，Xiaoxiao Wang，Dunwan Zhu，Lanxia Liu，Xigang Leng. Simultaneous monitoring of the drug release and antitumor effect of a novel drug delivery system-MWCNTs/DOX/TC[J]. Drug Delivery，2017，24（1）.
论文作者:刘亚云,彭春光,李丽珍,熊龙,刘世伟
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年第23期
论文发表时间:2018/10/9
标签：细胞论文; 活性论文; 蛋白论文; 耐药性论文; 细胞系论文; 骨肉瘤论文; 荧光论文; 《中国误诊学杂志》2018年第23期论文;