王贵平[1]2004年在《猪传染性胸膜肺炎免疫荧光和PCR诊断方法研究及apxⅣA的克隆与序列分析》文中研究表明胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)是猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia，PCP)的病原菌。在APP的15个血清型中，外膜脂蛋白(Outer membrane lipoprotein，OmlA)和毒素Ⅳ(apxⅣ)具有保守性，为建立种特异性检测方法提供了可能。本研究将用大肠杆菌表达系统表达的外膜脂蛋白纯化后免疫新西兰白兔，收集高免血清作为一抗，用异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的羊抗兔IgG作为二抗，建立了间接荧光抗体试验(Indirect fluorescent assay，IFA)。同时从高免血清中提纯IgG再标记FITC，作为荧光抗体，建立了直接荧光抗体试验(Direct fluorescent assay，FA)。这两种试验分别对血清1-13型APP标准株均出现荧光信号，而血清15型APP标准株、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和链球菌等其它相关细菌不出现阳性反应。IFA和FA对APP的最小检出浓度分别为10~4CFU／ml和10~5CFU／ml。 多聚酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)由于具有敏感快速的优点，已被成功应用于许多病原的快速检测和疾病诊断中。本研究中设计合成了一对引物，以毒素Ⅳ基因(apxⅣ)为扩增的目的基因，利用胸膜肺炎放线杆菌血清1型标准菌株为模板，经过模板制备方法和反应条件的筛选，建立了胸膜肺炎放线杆菌的PCR检测方法。该方法能从胸膜肺炎放线杆菌13个血清型(1-13型)中扩增出预期的apxⅣ基因中大小为422bp的片段；胸膜肺炎放线杆菌血清型15型、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和链球菌扩增结果为阴性。对APP的最低检出浓度是1.29×10~2CFU／ml。重复性试验说明，该方法重现性好。 对人工感染动物和139份临床送检病料进行检测，并与细菌学检测结果进行比较。实验感染动物样品细菌分离为阳性，同时用上述3种方法检测也为阳性，有较好的一致性；临床可疑病料中，有36(25.90％)株为IFA阳性，29(20.86％)株为FA阳性，42(30.22％)株为PCR阳性，从7份病料中分离到本病原。这些初步研究结果表明，所建立的荧光抗体试验和PCR诊断方法可以应用于胸膜肺炎放线杆菌感染的检测，在检出率方面优于细菌分离鉴定方法。 ApxⅣ基因是新报道的毒力相关基因，仅在感染动物体内表达，具有潜在诊断意义。而且，其与本病原毒力的相关性尚未阐明。本研究根据GenBank上发表的序列，设计了一对引物，通过PCR扩增，获得了胸膜肿炎放线杆菌血清1型的毒素ⅣA基因(apxⅣA)中2694bp的片段，用质粒pMD18-T克隆后，经序列测定和NCBI Blast同源性分析，与GenBank上的AFO21919序列高度同源，从而为蛋白质的表达和后续研究奠定了基础。
邵美丽[2]2006年在《猪传染性胸膜肺炎重组亚单位疫苗的研究》文中研究说明猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的以肺出血、坏死和纤维素性渗出为主要病变的高度接触性传染病。自1957年Pattison首次报道本病以来,该病在世界范围内广泛流行,并给各国养猪业带来了严重的经济损失。由于APP极易产生耐药性,疫苗接种是防控本病的主要措施。目前,国内主要使用灭活疫苗预防和控制本病。但由于APP血清型较多,灭活疫苗的保护效果十分有限。因此,开发新型疫苗已经成为研究热点。研究表明,通过分子生物学手段构建的一些PCP弱毒疫苗和新兴起的一种ghosts疫苗较灭活疫苗的免疫保护效果有明显提高,但这两种疫苗也存在一些问题,弱毒疫苗随着毒力降低,其免疫原性也有所降低,且存在毒力返强的可能性,而ghosts疫苗则存在菌体裂解不彻底等缺点。以天然提取的APP毒力因子为组份的亚单位疫苗则不存在上述缺点,且这种疫苗能诱导产生很好的免疫保护,但就其制备方法而言,存在着提取成本高、产量低和不适于大量生产等缺点。鉴于此,本试验通过基因工程方法,重组表达APP的多种毒力因子,制备多组份重组亚单位疫苗,并进行了免疫保护效果的探讨。研究表明,APP分泌的外毒素(ApxI、ApxII、ApxIII)和外膜蛋白(OMP)等不仅是APP重要的毒力因子,同时也是重要的免疫原性因子,它们已经作为4种重要的候选抗原应用于APP亚单位疫苗的研究,但APP菌毛(ApfA)和最近发现的的外毒素IV(ApxIV)作为APP的另外两个重要毒力因子,尚未见其应用于亚单位疫苗的研究报道。根据ApfA在定居宿主细胞过程中发挥的重要作用及ApxIV能刺激机体产生较高的抗体水平这一点,推测二者可能会在交叉保护方面起促进作用。因此,本试验首次将Apfa和ApxIV也作为疫苗组份进行了研究,并首次制备以4种和6种重组蛋白为组份的重组亚单位疫苗,通过对BALB/c小鼠的免疫攻毒保护试验,与灭活疫苗进行了保护效力的比较。具体试验内容与结果如下:1采用PCR方法分别从APP2型S1536株、APP1型72-1株和APP7型25-4株中扩增到APP的重要保护性抗原基因apxⅢA(3114bp),apxIVA(2553bp)和omp(963bp)。序列测定后与GenBank发表的其他菌株进行同源性比较。结果表明,所扩增的apxⅢA基因与血清2型和血清8型405株的核苷酸同源性分别为98.4%和97.8%,氨基酸同源性分别为98.9%和97.1% ;apxIVA基因与血清1型4074株和3型HV114株的核苷酸同源性分别为99.9%和99.2%;氨基酸同源性分别为99.9%和98.9%;omp基因与血清3型S1421株、血清6型Femo株和血清7型WF83株的核苷酸同源性分别为98.3%、98.2%和100%,氨基酸同源性分别为98.8%、98.8%和100%。以上结果说明所扩增的目的基因在不同血清型之间非常保守,尤其是apxIVA和omp基因。2成功构建了重组表达载体pGEX-apxⅢA,pGEX- apxⅣA和pGEX-omp。并将6种重组表达载体pGEX-apxⅢA,pGEX- apxⅣA、pGEX-omp、pGEX-apxIA、pGEX-apxⅡA和pGEX-apfa(后叁种为实验室已经构建好)分别在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,获得6种重组蛋白GST-Apx(IrApxI)、GST-ApxⅡ(rApxⅡ)、GST-ApxⅢ(rApxⅢ)、GST-ApxⅣ(rApxⅣ)、GST-Apfa(rApfa)和GST-OMP(rOMP),大小分别约116、110、140、118、42和62Ku。Western-blot分析表明,6种重组蛋白具有良好的抗原性。3将rApxI、rApxⅡ、rApxⅢ和rOMP组合作为疫苗I组,rApxI、rApxⅡ、rApxⅢ、rApxⅣ、rApfa和rOMP组合作为疫苗Ⅱ组,APP1型菌制备的灭活疫苗作为疫苗Ⅲ组,PBS
刘金林[3]2009年在《胸膜肺炎放线杆菌毒素ApxIV的致病性及基因缺失弱毒疫苗的研究》文中研究指明猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病,给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。胸膜肺炎放线杆菌是一种多毒力因子病原菌,RTX(Repeat-in-toxin)毒素是其重要毒力因子。目前研究证实APP中存在4种RTX毒素,分别为ApxⅠ, ApxⅡ, ApxⅢ和ApxⅣ。毒素ApxⅠ, ApxⅡ, ApxⅢ已被证实在APP致病过程中起重要作用,目前对ApxⅣ在APP致病过程中的作用并不清楚。为阐明ApxⅣ与APP致病性的关系以及开发更为安全高效的基因工程弱毒疫苗,本研究以本实验室之前构建的APP血清7型毒素apxⅡC单基因缺失突变株HB04C~-为亲本菌株,通过同源重组和负向筛选的方法,成功缺失了apxⅣA基因,构建了APP apxⅡC和apxⅣA双基因缺失突变株QDS01。同时,以APP-Escherichia.coli穿梭载体pJFF224-XN为基础,构建了apxⅣA基因缺失突变株的互补菌株QA01。并对APP双基因缺失突变株QDS01、单基因缺失突变株HB04C~-、互补菌株QA01的生物学特性和/或免疫原性进行了研究,主要研究内容包括:1.同源臂的扩增与自杀性重组转移质粒的构建根据Genbank中公布的血清1型APP 4074株apxⅣ基因的序列(AF021919),从HB04C~-中克隆到apxⅣA基因N端2745 bp的片段,将其连接到pBluescript SK载体上,通过BamHⅠ/SmaⅠ双酶切后,用Klenow片段补平BamHⅠ粘性末端,与SmaⅠ平端连接,得到含有缺失了605 bp的apxⅣ基因ΔapxⅣAN,用SalⅠ/NotⅠ将ΔapxⅣAN从pBluescript SK载体上切下来连接到经同样酶切的自杀性质粒pEMOC2上,得到缺失apxⅣA基因的重组自杀性质粒pEΔⅣA。2.双基因缺失突变株和互补菌株的构建以含有重组转移质粒pEΔⅣA的大肠杆菌β2155为供体菌,以HB04C~-为受体菌,通过接合转移和氯霉素(Cm)抗性筛选,获得带有Cm抗性的单交换菌株,鉴定正确后,将其接种到不含Cm抗性的TSB培养基培养,再涂到含有蔗糖抗性的培养基,筛选出蔗糖抗性(Sur~R)和氯霉素敏感(Cm~S)的菌株,通过PCR、序列分析和Southernblot验证突变株正确,将双基因缺失突变株命名为QDS01。通过PCR从APP分离株HB04基因组中克隆得到全长apxⅣ基因,将其连接到APP-E.coli穿梭质粒pJFF224-XN中,得到互补质粒pVC3,将其电转化到双基因缺失突变株QDS01,通过氯霉素抗性筛选得到互补菌株,命名为QA01,并检验了穿梭质粒在APP中的遗传稳定性和ApxⅣ的表达活性。3.突变株生物学特性的研究将APP apxⅡC和apxⅣA双基因缺失菌株QDS01在体外连续传代培养,通过PCR鉴定,证明该缺失菌株能够稳定遗传。将QDS01和apxⅡC单基因缺失亲本菌株HB04C~-进行活菌计数,绘制生长曲线,结果表明,QDS01的增殖能力没有发生明显变化,说明apxⅣA基因的缺失对APP的体外增殖能力无影响。检测了突变株对Balb/C小鼠的致病力,结果表明QDS01较亲本菌HB04C~-毒力下降了约3倍。4.突变株对仔猪的致病性将APP血清7型分离株HB04、apxⅡC单缺失株HB04C~-、apxⅡC/apxⅣA双缺失株QDS01以及互补菌株QA01通过气管接种6周龄仔猪,通过感染后临床症状、肺部损伤指数、血液生化指标以及病理切片来评价不同APP菌株致病力的差异。结果表明,双基因缺失株QDS01对仔猪致病力明显低于HB04C~-,且携带apxⅣ基因的穿梭质粒pVC3可恢复其致病力。证明毒素ApxⅣ在APP致病过程中起重要作用。5.ApxⅣAM的克隆表达及鉴别ELISA诊断方法的初步建立克隆QDS01中缺失的基因片段apxⅣAM,并连接到原核表达质粒pGEX-KG,构建表达质粒pGEX-apxⅣAM,将其转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),经IPTG诱导,得到融合蛋白GST-ApxⅣAM,通过亲和层析获得纯化的GST-ApxⅣAM。用Western blot鉴定其免疫原性。以纯化后的蛋白作为诊断抗原包被酶标板,通过方阵滴定确定了抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释倍数。通过对APP阴性血清检测界定该ELISA的阴阳性界限。初步建立了基于融合表达蛋白的ApxⅣAM-ELISA检测方法。6.突变株对小鼠的免疫效力试验取48只Balb/C小鼠,随机分为6组,其中第1和4组以1.0×10~7 CFU的QDS01通过腹腔注射免疫,第2和5组以相同方式接种HB04C~-,剩余两组接种TSB作为空白对照。间隔14天加强免疫,第28天以10×LD_(50)的APP血清7型菌株WF83 (1×10~7CFU)和10×LD_(50)的APP血清1型菌株4074(1.8×10~6 CFU)攻毒,连续观察5天,记录小鼠发病和死亡情况。于0天、14天和28天由尾静脉采血,检测小鼠对ApxⅡA,ApxⅣA和ApxⅣAM的抗体水平。结果表明,QDS01可以刺激小鼠产生对ApxⅡA,ApxⅣA的抗体,但不产生对ApxⅣAM的抗体,而亲本菌HB04C~-二免后ApxⅣAM抗体为阳性,说明ApxⅣAM-ELISA检测方法可用于野毒菌株和apxⅣA基因缺失突变株的鉴别诊断。免疫小鼠对血清7型APP的攻击均可提供100%保护,对血清1型APP攻击保护率为75%。7.突变株对仔猪的免疫效力试验取14头APP血清学和病原学阴性仔猪,随机分为3组,第1组5头用1.3×10~9CFU的QDS01以气管接种方式免疫仔猪,第2组用HB04C~-以相同方式进行免疫,第3组4头接种TSB作为空白对照。于首免后21天进行二免,二免后两周用血清1型菌株4074攻毒。观察记录其临床症状,于7天后将存活仔猪处死,剖检观察肺部损伤状况。空白对照组出现典型胸膜肺炎症状,并有一头死亡。QDSO1免疫组获得完全保护,HB04C~-免疫组有一头发病并死亡。免疫组临床症状和肺损伤指数明显低于空白对照组。于首免、二免和攻毒前采血,检测了血清中ApXⅡA,ApxⅣA和ApxⅣAM的抗体水平,免疫仔猪可产生针对ApxⅡA和ApxⅣA的抗体,但HB04C~-免疫仔猪的缺失蛋白ApxⅣAM的抗体为阳性,进一步证明ApxⅣAM-ELISA检测方法可用于QDS01免疫动物与野毒感染动物的鉴别诊断。
谢芳[4]2010年在《胸膜肺炎放线杆菌1型3型差异基因及两种蛋白功能研究》文中提出胸膜肺炎放线杆菌(APP)是引起猪传染性胸膜肺炎疾病的病原菌,该病是世界范围内流行、严重危害现代化养猪业的重要传染病。APP具有众多血清型,其致病力和免疫原性各不相同,主要血清型间无免疫交叉保护,是制约APP致病机理和疫苗研究的瓶颈,严重影响了APP的诊断、检疫和预防。本研究选择毒力存在差异、而无免疫交叉保护的APP血清1型和3型菌株为对象,采用代表性差异分析法(RDA),分别构建了基因组DNA差减基因文库和cDNA差异表达基因文库,系统筛选1型和3型基因组差异基因和差异表达基因,经生物信息学分析后,从中选取自转运黏附素基因(差异基因)的功能区adh和蛋白酶clpP基因(差异表达基因)进行克隆与序列分析,并采用实时定量PCR分析clpP基因的相对表达,分别对adh和clpP基因进行原核表达,得到GST-Adh和GST-ClpP重组蛋白,测定其对昆明小鼠抗APP感染的免疫保护性,并利用凝血酶切除GST,纯化Adh蛋白,检测Adh对猪肺上皮细胞的黏附活性。结果表明,获得APP 1型8条差异基因片段,APP3型11条差异基因片段,经PCR鉴定发现这19条差异基因在15个血清型中分布不同;获得APP 1型22条上调表达基因,APP 3型20条上调表达基因,clpP基因在APP 1型的相对表达量为3型的3.22倍;成功获得融合蛋白GST-Adh和GST-ClpP,大小分别约为81kDa和48kDa,并以可溶性的形式获得表达;GST-Adh蛋白对APP血清5b型的保护率为7/10,对血清1型、3型和5a型无明显保护作用;Adh蛋白对猪肺上皮细胞具有黏附活性,该蛋白及其抗体能抑制APP对猪肺上皮细胞的黏附作用;GST-ClpP蛋白对APP血清1型的保护率为6/10,对血清3型无明显保护作用。本研究为今后APP不同血清型致病机理研究、新型多价疫苗研究以及特异性分子诊断技术的建立提供必要的基础。
王勇[5]2007年在《猪传染性胸膜肺炎重组亚单位菌苗研究》文中指出猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的以肺出血、坏死和纤维素性渗出为主要病变的高度接触性传染病。该病可致各年龄猪只发生急性和慢性感染，发病率和死亡率常在20％以上，最急性型死亡率可高达80％～100％，慢性猪传染性膜肺炎潜伏于猪群内，可使猪只生长缓慢，平均日增重下降，饲养报酬降低。自1957年Pattison首次报道本病以来，该病在世界范围内广泛流行，给各国养猪业带来了严重的经济损失。由于APP对多种抗生素都易产生耐药性，所以疫苗接种是防制本病的主要措施。目前，国内主要使用灭活疫苗预防和控制本病，但由于APP血清型较多，灭活疫苗对不同血清型APP的交叉保护效果十分有限，因此新型疫苗的开发已经成为研究热点。研究表明，通过分子生物学手段构建的一些PCP弱毒疫苗和新兴起的一种ghost疫苗较灭活疫苗的免疫保护效果有明显提高，但这两种疫苗也存在一定问题，弱毒疫苗随着毒力降低，其免疫原性也有所降低，且存在毒力返强的可能性；ghosts疫苗则存在菌体裂解不彻底等缺点。以APP主要毒力因子为组份的亚单位疫苗则不存在上述缺点，也可提供较高的保护水平，但是由于亚单位疫苗中不含有全菌体成分，所以疫苗的抑菌作用十分有限，感染的猪只虽不表现症状，但可隐性感染而成为病原携带者。鉴于此，本试验将通过基因工程方法重组表达的APP六种毒力因子分别添加到APP7灭活苗中，希望添加的重组蛋白成分能够提高灭活苗的交叉保护力，从而筛选出具有较好保护效果的重组亚单位菌苗组合，为今后APP新型疫苗的研究提供依据。本研究将已经重组表达的APP六种主要毒力因子蛋白(rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ、rOMP、rApxⅣ和rApfA)与APP7灭活苗进行如下组合：试验Ⅰ组(灭活苗)、试验Ⅱ组(灭活苗+rApxⅠ+rApxⅡ+rApxⅢ+rOMP)、试验Ⅲ组(灭活苗+rApxⅠ+rApxⅡ+rApxⅢ+rApxⅣ)、试验Ⅳ组(灭活苗+rApxⅠ+rApxⅡ+rApxⅢ+rApfA)和对照组(PBS)，进行小鼠的免疫攻毒保护试验。免疫共分3次，每次间隔2周。第3次免疫后第7天，分别以APP1型菌(5×10~9cfu)和APP7型菌(10~(11)cfu)进行攻毒。通过检测血清特异性抗体和脾脏T淋巴细胞增殖能力的动态变化，结合攻毒后小鼠的保护率、肺脏病理变化及间接免疫荧光抗原定位，综合评价重组亚单位菌苗的免疫保护效果。结果显示试验Ⅰ组的OMP抗体、试验Ⅱ组的ApxⅠ和OMP抗体、试验Ⅲ组的ApxⅠ抗体、试验Ⅳ组的菌毛抗体均处于较高的水平，攻毒前与其它各组均有显着差异(p＜0.05)；试验Ⅱ组的细胞免疫水平在攻毒前与试验Ⅰ、Ⅳ两组及对照组有了极显着差异(p＜0.01)，与试验Ⅲ组有显着差异(p＜0.05)；小鼠攻毒后保护率、肺脏病变及肺脏抗原定位的结果与体液和细胞免疫检测结果基本一致，试验Ⅱ组最优，试验Ⅲ、Ⅳ两组次之，试验Ⅰ组在试验组中最差，仅好于对照组。结果表明，灭活苗中添加重组蛋白成分可以提高灭活苗的交叉保护力，尤其是试验Ⅱ组的ApxⅠ和OMP抗体显着高于其它各组(p＜0.05)，细胞免疫也处于最高水平，同时对于APP1和APP7两个血清型攻毒的保护率、肺脏病变及对肺脏内APP菌的清除作用都明显优于其它各组。揭示疫苗Ⅱ组可通过激活机体的体液免疫和细胞免疫反应，对不同血清型APP的攻击提供很好的交叉保护作用，为猪传染性胸膜肺炎新型疫苗的研制提供参考。
肖国生[6]2006年在《胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌基因芯片检测与分型研究》文中研究说明基因芯片技术能在单一检测中从种、亚种、型和亚型水平上同时鉴定多种病原，为多病原联合检测和病原分型提供了一项新技术。基因芯片技术具有敏感性高，特异性强、高通量和平行性的优点。本研究对胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌的检测和分型靶基因进行了设计，以PCR方法扩增出用于叁种细菌联合检测和胸膜肺炎放线杆菌分型的靶基因，并建立了检测叁种细菌和胸膜肺炎放线杆菌基因分型的基因芯片。建立的APP-Mhp-PM检测基因芯片和APP分型基因芯片是一种新的检测技术，将对监测、联合诊断和防治这叁种猪呼吸道细菌病发挥重要作用。 根据胸膜肺炎放线杆菌的16S rDNA、apxⅣA、dsbE、omlA、apx和荚膜多糖(cp)基因，猪肺炎支原体的16S rDNA和P36蛋白基因，多杀性巴氏杆菌的psl和KMT1基因，入噬菌体DNA共设计和选用了23对引物，除选用引物外，其它引物由Arraydesigner 2.0软件设计。用23对引物共扩增出25个不同靶基因，并克隆到pMD18-T载体中。其中7个检测靶基因：胸膜肺炎放线杆菌3个(apxⅣ、dsbE、A16S)，猪肿炎支原体2个(M16S、P36)，多杀性巴氏杆菌2个(psl、KMT1)；17个用于胸膜肺炎放线杆菌分型的靶基因：omlA1、omlA2、omlA3、omlA4、cps1、cps2、cps6、cps7、cps8、cpx3、cpx6、cpx9、apxⅠA、apxⅠD、apxⅡA、apxⅢA和apxⅢD；一个定位靶基因λDNA。对克隆的25个靶基因质粒进行了序列测定和序列比对。结果发现，靶基因A16S与放线杆菌属内所有放线杆菌的16SrRNA的同源性均在95％以上，靶基因M16S与猪肺炎支原体、絮状支原体和猪鼻支原体的16SrRNA的同源性分别为100％、95％和88％；靶基因apxⅣ、dsbE、P36、KMT1和psl与各自不同型或株的相同基因序列的同源性均在92％以上。除分型靶基因apxⅠD和apxⅢD序列间的同源性在75％外，其它分型靶基因序列间的同源性均在67％以下。 用7个检测靶基因制备APP-Mhp-PM检测基因芯片，选用omlA1、omlA2、omlA3、omlA4、cps1、cps2、cps6、cps7、cps8、cpx6、apxⅠA、apxⅠD、apxⅡA、apxⅢA和apxⅢD 15个分型靶基因制备APP分型基因芯片。靶基因A16S、dsbE和apxⅣ联合检测胸膜肺炎放线杆菌；靶基因M16S和36联合检测猪肺炎支原体；靶基因psl和KMT1联合检测多杀性巴氏杆菌。15个分型靶基因的不同组合用于胸膜肺炎放线杆菌的基因分型。用基因芯片点样仪SpotArray 24将异丙醇沉淀法制备的浓度在250～300 ng／μl的
汪招雄[7]2005年在《应用单抗夹心ELISA检测伪狂犬病毒和胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅢA在巴斯德毕赤酵母中的表达及检测方法研究》文中研究说明本论文包含2个部分。 1.检测猪伪狂犬病毒单抗夹心ELISA方法的建立和应用 伪狂犬病(Pseudorabies, PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus, PrV)引起的包括家畜和多种野生动物的一种以发热、奇痒及脑脊髓炎为症状的重要传染病。该病给养猪业造成了巨大的经济损失,猪是本病毒的天然宿主和贮存者。准确、及时地检测出病原是防止疾病扩散的重要措施之一。单克隆抗体的各种诊断方法在其它疾病的检测中得到广泛的应用,显示出灵敏性高、特异性强等优点。应用单克隆抗体来检测PrV在我国报道较少,为了能从感染PrV的动物体内和肉食品中检测出病原,本课题开展了以下研究。 1.1 将猪伪狂犬病毒Ea株在IBRS-2细胞上增殖培养后,纯化后免疫Balb/C小鼠,取其脾细胞与SP2/0的骨髓瘤细胞融合。经ELISA筛选,获得两株分泌抗PrV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞,分别命名为4A6F5和3G7E3。免疫荧光试验和交叉试验证明两种单抗能特异性地与PrV反应,小鼠腹水中MAb的ELISA效价均为1:100×2~(12)。这两株单克隆抗体为病毒抗原的诊断研究提供良好的材料。 1.2 用纯化的病毒免疫健康猪,制备了抗PrV血清,提纯了IgG;将效价较高的一株单克隆抗体和抗血清IgG分别作为捕获抗体和检测抗体,用于建立检测PrV的双抗体夹心间接ELISA方法,并优化了反应条件,检测结果显示,该方法对PrV的检测灵敏度达31.2ng(0.312μg/ml),与乙型脑炎病毒(JEV)、猪繁殖与呼吸障碍综合症(PRRSV)、细小病毒(PPV)和猪流感病毒(SIV)等病毒无交叉反应。批间和批内变异系数较小,介于为4.87%和1.07%之间。应用本方法对人工感染PrV的40日龄仔猪组织进行检测,肺和脑PrV抗原检出率最高,其次是脾、心、肝和肌肉。应用该方法和PCR对159份临床病料进行平行检测,二者的符合率可达到77.4%。实验结果表明:双抗体夹心间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点,可应用于发病动物组织中PrV检测。 1.3 从武汉市及其周边地区市场收集97头份猪肉样本、57头份羊肉样本、50头份牛肉样本,应用双抗体夹心ELISA和聚合酶链式反应(PCR)方法平行检测样本中的伪狂犬病毒。检测结果显示:97头份猪肉样中,双抗体夹心ELISA方法PrV检出19份(19.6%),gD-PCR检出25份(25.6%);牛样本中ELISA阳性数为0,PCR阳性2份(4%);羊样本中两种方法均为阴性。这2种方法均为阳性和阴性的总份数为12和170份,总符合率达到了89.2%,对部分ELISA阳性的样本,病毒分离也为阳性。 2 猪传染性胸膜肺炎毒素Ⅲ在巴斯德毕赤酵母中的表达和应用 胸膜肺炎放线
刘翠权[8]2011年在《广西395个规模猪场猪呼吸道疾病综合征的病原学调查及防控措施》文中指出猪呼吸道疾病综合征(PRDC)是一种多因子疾病,它是由病毒、细菌、支原体、寄生虫、不良的饲养管理条件及易感猪群等综合因素相互作用引起的疾病综合症。为了解该病在广西猪群中的感染状况,主要采用PCR和RT-PCR方法,结合细菌分离鉴定,2007年5月至2009年5月,对广西14个市395个规模猪场的1686份组织样品分别进行了12种病原检测。结果显示：292个规模猪场和1212份样品为PRDC阳性,猪场和组织样品的阳性率分别为73.92%(292/395)和71.89%(1212/1686)。其中,单独或者混合感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪链球菌(SS)、猪伪狂犬病毒(PRV)、支气管败血波氏杆菌(Bb)、猪流感病毒(SIV)、猪附红细胞体(E-suis)、产毒素多杀性巴氏杆菌(T+PM)、副猪嗜血杆菌(HP)、猪细小病毒(PPV)和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)的阳性样品分别为51.36%(866/1686)、36.54%(616/1686)、10.91%(184/1686)、9.19%(155/1686)、6.76%(114/1686)、6.64%(112/1686)、5.81%(98/1686)、5.63%(95/1686)、4.45%(75/1686)、3.91%(66/1686)、0.59%(10/1686)和0(0/1686)。1病原学分析从感染的类型看,在1212份阳性样品中,单独感染的样品351份,占28.96%(351/1212)；混合感染的样品861份,占71.04%(861/1212)。从混合感染的类型看,在861份混合感染阳性样品中,二重混合感染597份、叁重混合感染210份、四重混合感染54份,分别占69.34%(597/861)、24.39%(210/861)和6.27%(54/861)。从混合感染的微生物种类看,在861份混合感染阳性样品中,“病毒与病毒”混合感染的样品460份、“病毒与细菌”混合感染的样品401份,分别占53.43%(460/861)和46.57%(401/861)。从感染的优势病原分析,PRRSV和/或PCV2感染的样品1054份,占1212份阳性样品的86.96%。其中,"PRRSV+PCV2(+其它病原)”混合感染的样品428份,占所有861份混合感染样品的49.71%。结果表明：广西规模猪场普遍存在PRDC, PRRSV、PCV2是引起PRDC的主要病原；感染类型复杂多样,混合感染相当普遍,以"PRRSV+PCV2(+其它病原)”混合感染最为常见。2病理组织学观察在病原学调查的基础上,对560个PRDC病例的心、肝、肺、肾、脾、淋巴结等组织器官进行石蜡包埋、切片、H.E染色,光学显微镜下观察其病理组织学特征。560个中的500个(占89.3%),其中,PRRSV单独感染病例166个、PRV单独感染病例22个、PRRSV+PCV2混合感染病例247个、PCV2+PRV混合感染病例38个、PRRSV+E-suis感染病例21个、PRRSV+CSFV+PCV2+HP感染病例6个,其心、肝、肺、肾、脾、淋巴结等组织器官的病理组织学变化呈现以下特点：PRRSV单独感染的病例,肺主要表现为间质性肺炎,肾表现为肾小球肾炎,淋巴结表现为急性增生性淋巴结炎,肝脏表现为变质性肝炎,心肌表现为变质性心肌炎,脾表现为脾小体体积缩小、坏死,红髓区内出血,淋巴细胞减少；PRRSV和/或PCV2混合感染其他病毒或继发细菌感染时,病变更加典型,组织细胞发生变性甚至坏死。系统的病理组织学观察为进一步形成PRDC的病理组织学诊断技术规范提供重要参考依据。3防控措施2009年5月开始,对15个试验猪场采取综合防控措施。这些措施主要包括：对必须进入猪场的人员、车辆、物品随时进行消毒,对猪舍地板、墙壁、天花板、空气、用具等定期进行消毒；做好PRRSV、CSFV、PRV、SIV、PCV2等PRDC原发性病原的免疫和监测,对抗体水平不合格的及时进行强化免疫;做好环境虫鼠蚊蝇等生物灾害防范和通风、温度、湿度控制；加强饲养管理,做到全进全出、养殖密度合理、营养均衡；尽可能减少猪群转栏、混群、免疫次数,净化养殖周边环境,减少应激；对病猪及时隔离并投喂敏感药物,防止继发感染；对死猪及其污染的物品及时进行无害化处理和消毒。重点措施是消毒、监测和对病死及带毒猪的隔离、淘汰、无害化处理,主要内容包括：对必须进入猪场的人员、车辆和物品随时进行消毒；对产房、保育猪舍、生产育肥猪舍的地板、墙壁、天花板、用具等分别进行2次/周、1次/周、2次/月的常规消毒,空栏后进猪前进行2次全面消毒；对产房、保育猪舍的空气在空栏后进猪前进行1次密闭熏蒸消毒；对猪舍外环境进行2次/月的消毒；对病猪和带毒猪及时隔离、淘汰,对死猪及其污染的物品及时进行无害化处理和消毒。4防控效果采取综合防控措施后,猪瘟的免疫抗体合格率明显提高,猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病、猪圆环病毒2型感染和猪流感的病原学监测的平均阳性率均不同程度地下降。2009年5月至2010年6月,共监测15个规模猪场血清样品16974份、病原学样品1589份。其中,猪瘟免疫抗体的平均合格率由试验前的91.18%提升到试验后的95.90%,病原学样品的平均阳性率由8.55%下降到6.04%；猪繁殖与呼吸综合征免疫抗体的平均阳性率由86.46%提升到88.11%,病原学样品的平均阳性率由15.80%下降到13.15%；猪圆环病毒2型病原学样品的平均阳性率由26.61%下降到22.28%；猪伪狂犬病gE抗体的平均阳性率由5.53%下降到4.51%,病原学样品的平均阳性率由6.43%下降到5.16%；猪流感感染抗体的平均阳性率由5.51%下降到5.30%,病原学样品的平均阳性率由637%下降到4.97%。生猪的死亡率总体趋于下降。15个猪场的总体平均死亡率由试验实施1～2月的8.28%下降到实施11～12月的7.24%,总体下降了1.04个百分点。种猪的繁殖性能和仔猪的存活率显着提高,仔猪的平均死亡率明显下降。其中,每头长白母猪年平均提供活仔数由20.73头提高到21.57头,提高了0.84头；仔猪的平均死亡率由8.54%下降到6.86%,下降了1.68个百分点。每头杜洛克母猪年平均提供活仔数由18.95头提高到19.23头,提高了0.28头；仔猪的平均死亡率由7.44%下降到6.55%,下降了0.89个百分点。每头大约克母猪年平均提供活仔数由19.97头提高到20.54头,提高了0.57头；仔猪的平均死亡率由7.42%下降到6.39%,下降了1.03个百分点。仔猪的生长性能大幅度提高。其中,长白仔猪达到30kg和100kg的平均日龄分别提前了2.1天和3.3天,30～100kg平均日增重提高了30.1g,保育猪和育肥猪的料肉比分别降低了0.063和0.098。杜洛克仔猪达到30kg和100kg的平均日龄分别提前了2.1天和3.9天,30～100kg平均日增重提高了24.6g,保育猪和育肥猪的料肉比分别降低了0.029和0.089。大约克仔猪达到30kg和100kg的平均日龄分别提前了1.9天和3.6天,30～100kg平均日增重提高了21.5g,保育猪和育肥猪的料肉比分别降低了0.023和0.056。2009年5月至2010年6月,采取上述综合措施后,15个规模猪场的主要疫病防控效果显着,生猪发病减少了,死亡率降低了,猪群的免疫抗体水平、种猪的繁殖性能、仔猪的死亡率和生长性能等各项指标均发生了明显改善,取得了良好的经济效益和社会效益。
邹浩勇[9]2011年在《猪肺炎支原体的分离鉴定及基因工程疫苗的研究》文中研究说明猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae, MHP)可引起猪地方性流行性肺炎(Enzootic Pneumonia, EP),也是猪呼吸道疾病综合症的重要原发性病原之一。更重要的是,MHP的感染易造成多种其它病原微生物的继发感染,增加猪呼吸道疾病的发病率和死亡率,给养猪业带来了巨大的经济损失。本研究开展MHP的病原分离鉴定、病原检测方法、重组沙门氏菌基因工程疫苗和重组猪传染性胸膜肺炎放线杆菌基因工程疫苗进行研究,为我国MHP的诊断、预防和控制提供新的方法,为MHP致病机制的研究提供基础。主要研究内容如下：1.MHP的分离鉴定及基因序列分析从我国送检的临床病例中有典型或凝似MHP症状的猪肺组织中分离出了1株MHP菌株,命名为HNYY。通过菌落形态观察、电镜观察、基因序列分析,分离鉴定的MHP菌株可以在MHP固体培养基中形成典型的“煎蛋样”菌落,菌落中心隆起,呈致密的小颗粒,中央颗粒较粗。通过电镜负染观察其形态,大多数为圆形。通过对MHP特异性的P36、P46以及16sRNA基因片段进行扩增测序分析,分离株的P36、P46和16sRNA序列与NCBI上报道的MHP序列进行比对,发现其同源性分别为100%、93%和96%。用MAGE4.0软件对这些基因进行进化分析,发现该分离株与国际232菌株的进化关系最近。2.MHP分离株的致病性研究筛选12头MHP和PRRSV血清抗体阴性的21日龄仔猪,分成两组。用分离的MHP菌株进行连续2次气管注射107个CCU的菌液,连续观察28天。分别对感染MHP后仔猪的体温、生长指标、精神状况、临床表现进行监测,对血清抗体和剖解后的组织病理切片和免疫组化进行分析。结果表明感染后仔猪的体温并没有升高,食欲和精神状况变化也不大,也并没有显示很明显的MHP临床症状。直到感染26天左右,体温才开始升高,部分猪也表现出咳嗽。但剖解后肉眼并没有观察到肺组织典型的MHP实质性的肉变或虾样肉变。通过测定平均日增重结果显示感染组的平均日增重比空白对照组低。血清抗体检测结果显示感染组并没有完全发生阳转。通过病理切片分析发现所有的肺组织均表现有不同程度的间质性肺炎和支气管纤毛上皮细胞脱落,而对照组均正常。用黏附素蛋白制备的多抗进行免疫组化分析结果显示感染组中所有的肺组织均为MHP阳性,说明分离的MHP菌株可感染仔猪,但并未造成严重的发病,初步鉴定为弱毒株。3. Real-time PCR检测方法的建立针对MHP保守的特异性基因——P36制备TaqMAN探针,建立用于检测MHP的FQ-PCR方法。该方法敏感度可达1×100拷贝/μ1,对批内起始浓度为1.0×108、1.0×107、1.0×106拷贝/μ1的pMD18-P36标准品的Ct值得变异系数(CV)分别为：0.6、0.5、0.5。批间起始浓度为1.0×108、1.0×107、1.0×106拷贝/μ1的pMD18-P36标准品的试验的Ct值变异系数(CV)分别为：7.6、7.9、3.4。检测的灵敏度比普通PCR高100倍。说明该方法具有良好的特异性、稳定性和重复性。4.在大肠杆菌中的表达及反应原性分析根据MHP免疫原性基因相关的研究报道,我们选取主要的免疫原性基因P46、P65、P97R1和NrdF进行分析,结果显示P46基因序列中含有3个TGA密码子,分别位于碱基序列的208、301和760位；P65基因序列中含有1个TGA密码子,位于碱基序列的631位；而P97R1序列是黏附素基因中起主要黏附作用的位点,位于黏附素基因P97序列中的2560-2889,序列中无TGA密码子；NreF基因序列编码一个11 Kda蛋白,无TGA密码子。分别将P46、P65、P97R1NrdF构建在原核表达质粒pGEX-KG于宿主菌JM105中进行表达并纯化蛋白,其大小分别为72 KDa,91 KDa,62 KDa和50 KDa。5.表达MHP保护性抗原的重组沙门氏菌株的构建分别将P46、P65、P36、P97R1NrdF基因片段与沙门氏菌asd平衡表达质粒pYA3493进行连接,制备重组平衡表达质粒pYAP46、pYAP65、pYAP36和pYAP97R1N。将这些质粒分别电转化猪霍乱沙门氏弱毒株C501中,制备重组菌株C501(pYAP46)、C501(pYAP65)、C501(pYAP36)、C501(pYAP97R1NrdF)均保留了亲本株C501的生化特性和抗原表型,能稳定遗传并高效表达MHP的P36、P46、P65和P97R1NrdF抗原。6.MHP重组沙门氏菌基因工程疫苗对小鼠免疫效果的观察利用表达MHP免疫原形基因P46、P65、P36、P97R1NrdF片段的重组猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C501(pYAP46)、C501(pYAP65)、C501(pYAP36)、C501(pYAP97RlNrdF),制备猪肺炎支原体重组沙门氏菌基因工程疫苗,利用BALB/c小鼠检测免疫原性。将4×108CFU重组菌株C501(pYAP46)、C501(pYAP65)、C501(pYAP36)、C501(pYAP97RlNrdF)分别进行肌肉免疫和口服免疫。重组疫苗C501(pYAP46)免疫组血清中未检测到抗P46特异的IgA抗体,但可检测到特异的IgG抗体,而肺组织中只有肌肉免疫组中可检测到特异的P46-IgG抗体。重组疫苗C501(pYAP65)免疫后的实验结果显示特异性的P65抗体水平与P46结果类似,免疫小鼠后血清和肺组织中也无特异的IgA抗体,也是肌肉免疫途径效果好。与之不同的是,免疫小鼠后血清中诱导的特异的P65-IgG抗体水平比P46-IgG高,且比商品化168活疫苗对照组高,差异显着。而肺组织中产生的特异的P65-IgG抗体水平却比P46-IgG低。重组疫苗C501(pYAP36)和重组疫苗C501(pYAP97R1NrdF)免疫小鼠后血清和肺组织中均可以诱导机体产生特异的IgA和IgG抗体,免疫效力优于P46和P65抗原。C501(pYAP36)口服免疫比肌肉免疫组产生的P36-IgA抗体滴度高,但差异不显着。相反,重组口服疫苗比肌肉免疫组产生的P36-IgG抗体滴度却低,差异也不显着。肺组织中肌注免疫168活疫苗产生特异的P36-IgA抗体滴度最高,与重组菌C501(pYAP36)免疫组相比差异显着。口服免疫重组菌C501(pYAP36)的P36-IgG抗体滴度最高,与其他免疫组相比差异显着。重组疫苗C501(pYAP97R1NrdF)无论是口服免疫还是肌肉免疫均比168活疫苗对照组产生的P97R1N-IgA和IgG抗体滴度高,且差异显着。肺组织中,重组疫苗C501(pYAP97R1NrdF)也可以检测到特异的高水平的P97R1N-IgA和P97R1N-IgG抗体。本研究通过用不同的抗原刺激免疫后小鼠的脾淋巴细胞来测定细胞因子水平的结果中可以看出,构建的重组疫苗免疫动物后可以刺激小鼠产生细胞免疫,其中重组疫苗C501(pYAP97R1N)诱导的细胞免疫最高。7.MHP重组沙门氏菌基因工程疫苗对仔猪的免疫保护研究依据小鼠免疫效力实验的结果,选用18头21日龄的猪肺炎支原体和PRRSV血清抗体阴性的仔猪作为实验研究的动物,分成4组,分别为四种重组猪霍乱沙门氏菌弱毒株的多价重组疫苗C501(pYAP46/P65/P36/P97R1NrdF)组、串联重组单苗C501(pYAP97R1NrdF)组、进口商品化疫苗M+PACR组和未免疫对照组,考察该疫苗对该年龄段猪的免疫保护MHP的情况。分别用3×109CFU的重组四价苗C501(pYAP46/P65/P36/P97R1NrdF)和重组单苗C501(pYAP97R1NrdF)进行肌肉免疫接种。通过建立的ELISA和商品化的ELISA试剂盒对免疫仔猪进行抗体水平的测定。重组疫苗免疫仔猪后可诱导机产生针对各种免疫原特异的IgM抗体,其中P65-、P97R1-、P97R1N-IgM抗体滴度较商品化疫苗组高,单苗免疫组中特异的IgM抗体较联苗组高。重组疫苗免疫仔猪后血清中均可产生特异的IgG,而无特异的P46-和P65-IgA抗体产生,此外,血清中也无P36-IgA抗体产生。实验结果中重组疫苗免疫仔猪后均可产生高于商品化疫苗产生针对P46-、P65-、P36-、P97R1-和P97R1N特异的IgG抗体；重组单苗C501(pYAP97R1NrdF)产生的特异的P97R1-和P97R1N-IgG抗体高于重组四价苗C501(pYAP46/P65/P36/P97R1NrdF)。但根据商品化M.hyo抗体的ELISA试剂盒检测结果显示商品化疫苗免疫组的抗体水平显着高于重组疫苗免疫组。说明M.hyo特异抗体水平与疫苗免疫保护没有相关性。用IgG1和IgG2a来抽象的评价重组疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫效果,发现重组疫苗既可以诱导体液免疫又可诱导细胞免疫,其中细胞免疫水平略高于体液免疫水平。对血清中的IL-6和TNF-α细胞因子检测,结果显示未免疫攻毒组血清中的IL-6和TNF-α炎性细胞因子水平显著高于各免疫组；而其中商品化疫苗组的TNF-α细胞因子水平显著高于重组单苗C501(pYAP97R1N)免疫组,重组联苗免疫组高于重组单苗免疫组。从病理切片显示几乎所有组攻毒后都有不同程度的病理变化,但从攻毒后肺部病理评分和临床剖解病理变化来看,重组疫苗免疫组的肺脏组织损伤明显比商品化疫苗免疫组和未免疫空白组弱,差异显着。从以上结果我们可以看出,多价重组疫苗免疫保护效果比商品化疫苗好,重组疫苗C501(pYAP97R1N)免疫仔猪后攻毒感染MHP引起的肺部损伤最轻,起到免疫保护的效果最好。有望成为今后预防锗肺炎支原体新型的基因工程疫苗。8.MHP重组猪传染性胸膜肺炎放线杆菌基因工程疫苗的研究本研究以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)血清1型双基因缺失株SLW03和猪肺炎支原体为材料,分别克隆APP脲酶结构C(UreC)基因的上下同源臂、MHP主要免疫原性蛋白——乳酸脱氢酶(P36)基因和强启动子基因ner,将强启动子序列插入到含脲酶基因核糖体结合位点的P36基因上游,并插入到脲酶结构C基因的上下同源臂中间,构建获得含修饰过的P36基因并缺失脲酶C基因的APP突变株SLW36,该突变株不含抗生素抗性基因。对突变株进行生物学特性、生长特性以及免疫活性进行分析,试验结果显示构建的突变株比亲本株的毒性更低,更安全,异源基因P36的插入及脲酶结构基因的失活也没有影响其生长特性,通过SDS-PAGE和Western blot分析也表明了异源基因P36能够在APP染色体中表达,通过免疫反应实验结果显示突变株免疫小鼠后可以产生抗P36特异的IgG抗体和微量的猪肺炎支原体抗体,表明猪传染性胸膜肺炎放线杆菌弱毒株可以表达异源基因并能诱导产生异源基因特异的抗体,说明其作为细菌疫苗载体的可行性,并有望用于多价基因工程疫苗的研究。
左之才[10]2012年在《人工感染放线杆菌（Ⅰ型）对猪肺脏和肺门淋巴结的损伤机理研究》文中指出目的：PP在高密度饲养的现代大型规模化养猪场所造成的损失及危害相当严重。PP的病原学、流行特点及检测方法等一直是国内外研究人员和学者关注的焦点；关于APP感染对猪机体组织损伤及免疫相关的系统研究较为少见。本研究旨在：(1)建立PP人工感染疾病模型；(2)监测感染APP后,猪的病症、血液常规及生化指标、抗氧化功能、免疫状况(红细胞免疫、T细胞免疫与体液免疫及细胞因子水平)及病理变化；(3)利用含43,603个探针的Agilent猪类全基因组芯片检测感染APP猪的肺和肺门淋巴结基因表达谱变化,探索感染组织损伤的分子机制。结果：1.采用鼻腔气雾法,按猪每千克体重鼻腔喷雾含APP3.5-4×107CFU/ml的APP(I型)稀释液0.25ml,成功建立了PP疾病模型。2.感染猪的WBC、GRA及MON的数量及比例显着增高(P<0.01),LYM的数量及比例显着降低(P<0.01)。血清GLB含量显着增高(0.01 [1]. 猪传染性胸膜肺炎免疫荧光和PCR诊断方法研究及apxⅣA的克隆与序列分析[D]. 王贵平. 华中农业大学. 2004 [2]. 猪传染性胸膜肺炎重组亚单位疫苗的研究[D]. 邵美丽. 东北农业大学. 2006 [3]. 胸膜肺炎放线杆菌毒素ApxIV的致病性及基因缺失弱毒疫苗的研究[D]. 刘金林. 华中农业大学. 2009 [4]. 胸膜肺炎放线杆菌1型3型差异基因及两种蛋白功能研究[D]. 谢芳. 吉林大学. 2010 [5]. 猪传染性胸膜肺炎重组亚单位菌苗研究[D]. 王勇. 东北农业大学. 2007 [6]. 胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌基因芯片检测与分型研究[D]. 肖国生. 四川农业大学. 2006 [7]. 应用单抗夹心ELISA检测伪狂犬病毒和胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅢA在巴斯德毕赤酵母中的表达及检测方法研究[D]. 汪招雄. 华中农业大学. 2005 [8]. 广西395个规模猪场猪呼吸道疾病综合征的病原学调查及防控措施[D]. 刘翠权. 南京农业大学. 2011 [9]. 猪肺炎支原体的分离鉴定及基因工程疫苗的研究[D]. 邹浩勇. 华中农业大学. 2011 [10]. 人工感染放线杆菌（Ⅰ型）对猪肺脏和肺门淋巴结的损伤机理研究[D]. 左之才. 四川农业大学. 2012 标签：畜牧与动物医学论文; 肺炎论文; 猪传染性胸膜肺炎论文; 免疫荧光技术论文; 基因合成论文; 胸膜论文; 同源重组论文; 抗原抗体论文; 肺炎疫苗论文; 传染病论文; 同源基因论文; 问题疫苗论文; 仔猪论文; igg抗体论文; 参考文献：